克隆基因的方法

1、第三章第三章基因的克隆方法基因的克隆方法2 基因基因是生物染色體上的是生物染色體上的一段一段DNADNA序列序列，具有轉(zhuǎn)錄、翻譯成某種蛋白質(zhì)，具有轉(zhuǎn)錄、翻譯成某種蛋白質(zhì)調(diào)控生物生命活動(dòng)的功能。調(diào)控生物生命活動(dòng)的功能。4即基因的克隆方法即基因的克隆方法 基于基于基因產(chǎn)物基因產(chǎn)物的基因克隆方法的基因克隆方法 基于基于基因加標(biāo)簽基因加標(biāo)簽的基因克隆方法的基因克隆方法 基于基于基因序列基因序列的基因克隆方法的基因克隆方法 基于基于基因圖譜基因圖譜的基因克隆方法的基因克隆方法51 1、根據(jù)、根據(jù)蛋白質(zhì)序列蛋白質(zhì)序列克隆目的基因克隆目的基因2 2、根據(jù)、根據(jù)基因表達(dá)差異（基因表達(dá)差異（mRNAmRNA）克

2、隆基因克隆基因6 原理：根據(jù)蛋白質(zhì)上的一段多原理：根據(jù)蛋白質(zhì)上的一段多肽的氨基酸序列，反推核苷酸序列，肽的氨基酸序列，反推核苷酸序列，然后設(shè)計(jì)探針或引物從基因組文庫然后設(shè)計(jì)探針或引物從基因組文庫或或cDNAcDNA文庫中分離出相應(yīng)的基因。文庫中分離出相應(yīng)的基因。7實(shí)用性：實(shí)用性： 分離純化蛋白質(zhì)十分困難Cys Met Asp Glu Met Lys Arg Asn IleTGTATGGACGAAATGAAAAGAAACATA C T GATG G G T T C據(jù)某段氨基酸序列推導(dǎo)可能的核苷酸序列據(jù)某段氨基酸序列推導(dǎo)可能的核苷酸序列注意！注意！密碼子有簡密碼子有簡并性現(xiàn)象！并性現(xiàn)象！82 2、

3、根據(jù)基因表達(dá)差異（、根據(jù)基因表達(dá)差異（mRNAmRNA）克隆基因）克隆基因基因表達(dá)的差異表現(xiàn)：基因表達(dá)的差異表現(xiàn)：一是基因表達(dá)的種類的不同；一是基因表達(dá)的種類的不同；二是基因表達(dá)水平的改變。二是基因表達(dá)水平的改變。9 差減雜交（差減雜交（SHSH） 抑制性差減雜交（抑制性差減雜交（SSHSSH） 差異顯示差異顯示PCRPCR（DD RT-PCRDD RT-PCR） DNADNA代表性差異分析（代表性差異分析（DNA RDADNA RDA） 擴(kuò)增限制性片段長度多樣性（擴(kuò)增限制性片段長度多樣性（AFLPAFLP） cDNAcDNA微陣列微陣列10 n最早由最早由Lamar和和Palmer于于198

4、4年提出并用年提出并用于雄鼠于雄鼠Y染色體的染色體的DNA研究。研究。超聲波超聲波打斷雌鼠打斷雌鼠的的DNA（過量（過量100倍）倍）(XX)MboI完全消化雄鼠完全消化雄鼠的的DNA (XY)變性、復(fù)性變性、復(fù)性去除共有序列去除共有序列BamHI酶切酶切表達(dá)載體表達(dá)載體連接、轉(zhuǎn)化、測序分析連接、轉(zhuǎn)化、測序分析缺點(diǎn)：技術(shù)要求高，耗時(shí)，工作量大缺點(diǎn)：技術(shù)要求高，耗時(shí)，工作量大NO.1NO.2NO.311SH在mRNA研究上的應(yīng)用機(jī)理： !不足之處：重復(fù)性差，靈敏度低，回收的cDNA量有限。特異表達(dá)基因特異表達(dá)基因的樣本（的樣本（TS）提取mRNA提取mRNAcDNAcDNA轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)錄過量雜交TS的

5、CDNA純化、富集、擴(kuò)增去除過量的RS的cDNA及雜交分子12 基因突變體的研究：如基因的表達(dá)與不表達(dá)； 基因時(shí)空表達(dá)的研究：如根、莖、葉； 不同處理?xiàng)l件下的基因表達(dá)差異：如施肥與不施肥、光照與不光照。：131.2.2 抑制性差減雜交（抑制性差減雜交（SSH）Tester樣本樣本mRNADriver樣本樣本mRNASfiI AcDNAcDNASfiI BAB混合，變性雜交混合，變性雜交過量ABPCR擴(kuò)增擴(kuò)增5314應(yīng)用應(yīng)用基因突變體的研究：如基因的表達(dá)與不基因突變體的研究：如基因的表達(dá)與不表達(dá)表達(dá)基因時(shí)空表達(dá)的研究：如根、莖、葉基因時(shí)空表達(dá)的研究：如根、莖、葉不同處理?xiàng)l件下的基因表達(dá)差異：如施

6、不同處理?xiàng)l件下的基因表達(dá)差異：如施肥與不施肥、光照與不光照肥與不施肥、光照與不光照151.2.3 差異顯示差異顯示PCR（DD RT-PCR）最先由最先由Liang等于等于1992年報(bào)道，目前已廣泛年報(bào)道，目前已廣泛在實(shí)驗(yàn)室使用。在實(shí)驗(yàn)室使用。主要原理：利用真核生物主要原理：利用真核生物mRNA結(jié)尾處有結(jié)尾處有POLY（A）結(jié)構(gòu)，在其）結(jié)構(gòu)，在其3端設(shè)計(jì)象端設(shè)計(jì)象5-T11GA樣引物，該引物可與樣引物，該引物可與mRNA總數(shù)的十二分之總數(shù)的十二分之一結(jié)合，從而使這部分基因得到逆轉(zhuǎn)錄，同一結(jié)合，從而使這部分基因得到逆轉(zhuǎn)錄，同時(shí)結(jié)合時(shí)結(jié)合5端的隨機(jī)引物（端的隨機(jī)引物（20條條10-mer），可），

7、可以使不同長度的基因得到擴(kuò)增。以使不同長度的基因得到擴(kuò)增。53AAAAAAAAATGCAGCTTTTTTTTTTRPmRNA1653AAAAAAAAATGCAGCTTTTTTTTTTRPmRNAAATTTTTTTTACTTTTTTTTAGTTTTTTTTTATTTTTTTTTCTTTTTTTTTGTTTTTTTTCATTTTTTTTCCTTTTTTTTCGTTTTTTTTGATTTTTTTTGCTTTTTTTTGGTTTTTTTT1718具體操作：具體操作：1、提取、提取mRNA；2、特定引物（、特定引物（12分之一）反轉(zhuǎn)錄；分之一）反轉(zhuǎn)錄；3、特定引物和、特定引物和RP結(jié)合結(jié)合RT-PCR；

8、4、把不同處理的樣品擴(kuò)增產(chǎn)物按引物組合、把不同處理的樣品擴(kuò)增產(chǎn)物按引物組合分別進(jìn)行電泳比較分別進(jìn)行電泳比較DNA帶，從而找出差別帶，從而找出差別DNA。19缺點(diǎn)：缺點(diǎn)：假陽性條帶多，對(duì)低豐度的基因表達(dá)不容假陽性條帶多，對(duì)低豐度的基因表達(dá)不容易檢測。易檢測。工作量大。工作量大。無法定量研究。無法定量研究。擴(kuò)出的條帶往往是擴(kuò)出的條帶往往是3端比較短的端比較短的UTR區(qū)的區(qū)的一段序列，提供的信息較少。一段序列，提供的信息較少。20優(yōu)點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)：簡便、靈敏、高效、省時(shí)，能快速顯示簡便、靈敏、高效、省時(shí)，能快速顯示mRNA的組成。的組成。所需的所需的mRNA量少。量少。各樣本各樣本mRNA的差異可同時(shí)進(jìn)行

9、比較。的差異可同時(shí)進(jìn)行比較。擴(kuò)出的擴(kuò)出的cDNA可直接用于測序、文庫篩選等?？芍苯佑糜跍y序、文庫篩選等。21原理：主要是在生物基因組中原理：主要是在生物基因組中插入插入外源的一段外源的一段DNA，使生物體產(chǎn)生，使生物體產(chǎn)生某種突變表型，然后反過來利用某種突變表型，然后反過來利用這段外源已知的這段外源已知的DNA片段來克隆片段來克隆基因的方法?；虻姆椒ā?2外源外源DNA基因組染色體基因組染色體DNA基因基因A產(chǎn)生突變型產(chǎn)生突變型 分類：分類： T-DNA標(biāo)簽法標(biāo)簽法 轉(zhuǎn)座子標(biāo)簽法。轉(zhuǎn)座子標(biāo)簽法。23 T-DNA標(biāo)簽法克隆基因技術(shù)路線：標(biāo)簽法克隆基因技術(shù)路線：農(nóng)桿菌侵染植物得到轉(zhuǎn)化苗，篩選出表

10、現(xiàn)某種突農(nóng)桿菌侵染植物得到轉(zhuǎn)化苗，篩選出表現(xiàn)某種突變性狀的個(gè)體。變性狀的個(gè)體。建立突變體基因組文庫及野生型基因組文庫建立突變體基因組文庫及野生型基因組文庫.用用T-DNA片段做片段做probe篩選突變體文庫，獲得陽篩選突變體文庫，獲得陽性克隆。性克隆。用獲得的陽性克隆篩選野生型基因組文庫，獲得用獲得的陽性克隆篩選野生型基因組文庫，獲得野生型的陽性克隆。野生型的陽性克隆。把陽性克隆轉(zhuǎn)化突變體進(jìn)行功能互補(bǔ)及進(jìn)行測序把陽性克隆轉(zhuǎn)化突變體進(jìn)行功能互補(bǔ)及進(jìn)行測序分析。分析。24野生株野生株轉(zhuǎn)基因株轉(zhuǎn)基因株目的基因染色體T-DNA染色體T-DNA探針探針篩選轉(zhuǎn)基因文庫篩選轉(zhuǎn)基因文庫作探針篩選野生株基因文庫

11、作探針篩選野生株基因文庫構(gòu)建基因組文庫基因苗構(gòu)建基因組文庫基因苗陽性克隆陽性克隆目的基因目的基因獲得陽性克隆獲得陽性克隆基因序列分析，基因序列分析，確定為基因確定為基因陽性克隆轉(zhuǎn)化突變體，確定基因功能25 轉(zhuǎn)座子又稱轉(zhuǎn)座因子或者跳躍因子轉(zhuǎn)座因子或者跳躍因子，實(shí)際上也是DNA片段片段，它可以在生物的染色體組中移動(dòng)，從染色體的一個(gè)位點(diǎn)跳到另一個(gè)位點(diǎn)，或從一條染色體跳到另一條染色體上，引起基因功能的改變。26轉(zhuǎn)座子標(biāo)簽法轉(zhuǎn)座子標(biāo)簽法u最早是美國玉米育種家最早是美國玉米育種家1951年發(fā)現(xiàn)，起初不被年發(fā)現(xiàn)，起初不被認(rèn)同，認(rèn)同，1967年在大腸桿菌的半乳糖操縱子中證年在大腸桿菌的半乳糖操縱子中證實(shí)后得到

12、認(rèn)同。實(shí)后得到認(rèn)同。u根據(jù)根據(jù)DNA的結(jié)構(gòu)和轉(zhuǎn)座的機(jī)理，分為兩大家族：的結(jié)構(gòu)和轉(zhuǎn)座的機(jī)理，分為兩大家族：轉(zhuǎn)座子和逆轉(zhuǎn)座子，前者如玉米的轉(zhuǎn)座子和逆轉(zhuǎn)座子，前者如玉米的Ac/Ds系統(tǒng)和系統(tǒng)和spm因子，后者如果蠅的因子，后者如果蠅的copia因子。因子。27轉(zhuǎn)座子根據(jù)結(jié)構(gòu)不同可以分為簡單轉(zhuǎn)座轉(zhuǎn)座子根據(jù)結(jié)構(gòu)不同可以分為簡單轉(zhuǎn)座子和復(fù)雜轉(zhuǎn)座子子和復(fù)雜轉(zhuǎn)座子簡單轉(zhuǎn)座子：可以直接插入到其他位置簡單轉(zhuǎn)座子：可以直接插入到其他位置,也也叫插入序列。叫插入序列。復(fù)雜轉(zhuǎn)座子：攜帶有其它基因或遺傳標(biāo)記。復(fù)雜轉(zhuǎn)座子：攜帶有其它基因或遺傳標(biāo)記。結(jié)構(gòu)共同點(diǎn)：結(jié)構(gòu)共同點(diǎn)：兩端含有兩端含有20-40個(gè)核苷酸的倒置重復(fù)序列。個(gè)

13、核苷酸的倒置重復(fù)序列。含有可編碼轉(zhuǎn)座酶的基因。含有可編碼轉(zhuǎn)座酶的基因。應(yīng)用：以應(yīng)用：以Ac/Ds系統(tǒng)為例系統(tǒng)為例28Ac/Ds系統(tǒng)操作原理把把Ac，Ds分別轉(zhuǎn)化并獲得轉(zhuǎn)化體。分別轉(zhuǎn)化并獲得轉(zhuǎn)化體。把把Ac轉(zhuǎn)化體同轉(zhuǎn)化體同Ds轉(zhuǎn)化體進(jìn)行雜交得到轉(zhuǎn)化體進(jìn)行雜交得到F1代，然后自交得到代，然后自交得到F2、F3代分離群體，代分離群體，找出穩(wěn)定突變個(gè)體。找出穩(wěn)定突變個(gè)體。用用Ds做做probe篩選突變體文庫獲得突變篩選突變體文庫獲得突變基因的部分序列。基因的部分序列。用上述序列篩選正常個(gè)體基因組文庫或用上述序列篩選正常個(gè)體基因組文庫或cDNA文庫，得到目的基因。文庫，得到目的基因。29 根據(jù)克隆的策略

14、的不同，基于基因序列的基因根據(jù)克隆的策略的不同，基于基因序列的基因克隆方法又可以分為兩種形式：通過分子雜交克隆克隆方法又可以分為兩種形式：通過分子雜交克隆法和通過法和通過PCR擴(kuò)增基因法擴(kuò)增基因法301 1、通過分子雜交克隆法原理：通過分子雜交克隆法原理： 根據(jù)基因序列上的同源保守性，從一種生物中分根據(jù)基因序列上的同源保守性，從一種生物中分離獲得的基因用于制作分子探針，從另一種生物的基離獲得的基因用于制作分子探針，從另一種生物的基因文庫中分離出此生物中的同源基因。因文庫中分離出此生物中的同源基因。311）直接從基因組中擴(kuò)增過程：直接從基因組中擴(kuò)增過程：（1）提取基因組）提取基因組DNA作作模板

15、模板（2）根據(jù)目的基因序列）根據(jù)目的基因序列設(shè)計(jì)引物設(shè)計(jì)引物（3）PCR擴(kuò)增及產(chǎn)物鑒定擴(kuò)增及產(chǎn)物鑒定2 2、通過通過PCR擴(kuò)增基因法原理：擴(kuò)增基因法原理： 根據(jù)基因序列結(jié)構(gòu)特征，設(shè)計(jì)基因特根據(jù)基因序列結(jié)構(gòu)特征，設(shè)計(jì)基因特異引物，利用異引物，利用PCRPCR技術(shù)直接從生物的基因技術(shù)直接從生物的基因組或是組或是cDNAcDNA中擴(kuò)增出目的基因。中擴(kuò)增出目的基因。32提取基因組提取基因組DNAPCR引物設(shè)計(jì)引物設(shè)計(jì)真核生物基因組含有內(nèi)含子！真核生物基因組含有內(nèi)含子！此法適合擴(kuò)增原此法適合擴(kuò)增原核生物基因。核生物基因。PCR擴(kuò)增擴(kuò)增基因序列分析基因序列分析33（1）提取基因組）提取基因組 total

16、RNA（2）反轉(zhuǎn)錄合成總）反轉(zhuǎn)錄合成總cDNA作模板作模板（4）PCR擴(kuò)增及序列分析擴(kuò)增及序列分析（3）根據(jù)目的基因序列設(shè)計(jì)引物）根據(jù)目的基因序列設(shè)計(jì)引物2）從從mRNA中擴(kuò)增中擴(kuò)增: RT-PCR原核生物不易得到原核生物不易得到mRNA，也不含有，也不含有polyA尾。尾。適合擴(kuò)增真核生物基因。適合擴(kuò)增真核生物基因。344 、基于基因圖譜的基因克隆方法又稱圖位克隆法，是建立在擁有RFLP等分子標(biāo)記的連鎖遺傳圖和基因文庫，基因產(chǎn)物未知的一種基因克隆技術(shù)，理論上可以分離任何一個(gè)突變基因。35基因圖位克隆示意圖基因圖位克隆示意圖36圖位克隆基因的一般操作過程：圖位克隆基因的一般操作過程： 通過遺傳

17、分析構(gòu)建與目標(biāo)基因緊密通過遺傳分析構(gòu)建與目標(biāo)基因緊密連鎖的分子標(biāo)記連鎖圖，達(dá)到基因連鎖的分子標(biāo)記連鎖圖，達(dá)到基因的精細(xì)定位。的精細(xì)定位。 用與目標(biāo)基因緊密連鎖的兩側(cè)分子用與目標(biāo)基因緊密連鎖的兩側(cè)分子標(biāo)記標(biāo)記篩選基因組文庫篩選基因組文庫，構(gòu)建包含目，構(gòu)建包含目標(biāo)基因的基因組物理圖譜。標(biāo)基因的基因組物理圖譜。目的基因標(biāo)記標(biāo)記1標(biāo)記標(biāo)記2標(biāo)記標(biāo)記3標(biāo)記標(biāo)記4標(biāo)記標(biāo)記537基因組物理圖譜基因組物理圖譜進(jìn)一步精細(xì)定位獲得目的基因38 通過染色體步移或染色體登陸技術(shù)對(duì)通過染色體步移或染色體登陸技術(shù)對(duì)目標(biāo)基因進(jìn)行進(jìn)一步精細(xì)定位，得到目標(biāo)基因進(jìn)行進(jìn)一步精細(xì)定位，得到陽性克隆。陽性克隆。 對(duì)陽性克隆轉(zhuǎn)化隱性受體進(jìn)行功能互對(duì)陽性克隆轉(zhuǎn)化隱性受體進(jìn)行功能互補(bǔ)。補(bǔ)。 基因序列測定及表達(dá)分析等?；蛐蛄袦y定及表達(dá)分析等。39影響基因圖位克隆的因素：影響基因圖位克隆的因素：建立的分子標(biāo)記遺傳圖中標(biāo)記與基因之間的建立的分子標(biāo)記遺傳圖中標(biāo)記與基因之間的距離大小。距離大小?；蚪M的大小及可能存在的大量的重復(fù)序列?；蚪M的大小及可能存在的大量的重復(fù)序列?；蚪M文庫的大小及單克隆的大小