東亞鉗蝎提取物對(duì)癲癇小鼠大腦皮層NMDA受體和GABAA受體

1、    【關(guān)鍵詞】  東亞鉗蝎提取物；,GABAA受體；,NMDA受體；,癲癇摘要：目的研究BmKE對(duì)抗戊四氮致癲癇作用及其對(duì)致癇小鼠大腦皮層NMDAR和GABAAR的調(diào)節(jié)作用。方法觀察戊四氮（PTZ）致癲癇模型小鼠，丙戊酸鈉（VAP，陽性對(duì)照）治療組和BmKE低（L）、中（M）、高（H）劑量治療組小鼠癲癇發(fā)作的潛伏期，應(yīng)用同位素3H分別標(biāo)記MK-801和Mucimol，檢測小鼠大腦皮層NMDAR和GABAAR的結(jié)合活性。結(jié)果BmKE（M）能顯著延長PTZ致癲癇小鼠的發(fā)作潛伏期(P0.05)，BmKE（L）作用很小，BmKE（H）治療組癲癇小鼠

2、發(fā)作潛伏期的延長值比BmKE（M）治療組低。PTZ顯著升高致癇小鼠大腦皮層的NMDAR結(jié)合活性（P0.05），BmKE（L）治療組小鼠大腦皮層NMDAR結(jié)合活性降低，但是無顯著性差異，BmKE（M）和BmKE（H）均極顯著降低癲癇小鼠大腦皮層NMDAR結(jié)合活性（P0.001）。BmKE（L）和BmKE（H）顯著提高GABAAR結(jié)合活性（P0.05），BmKE（M）極顯著提高GABAAR結(jié)合活性（P0.001）。結(jié)論適量的BmKE能夠有效治療戊四氮引起的癲癇，顯著延長癲癇小鼠的發(fā)作潛伏期，BmKE抗癲癇的作用機(jī)理，可能與其抑制NMDAR結(jié)合活性，激活GABAAR的結(jié)合活性有關(guān)。關(guān)鍵詞：東亞鉗蝎提

3、取物；  GABAA受體；  NMDA受體；  癲癇The Modulation of Buthus martensic Karch Extract（BmKE）on Cerebral Cortex NMDA Receptor and GABAA Receptor in Epileptic Mice  Abstract：ObjectiveTo study the antagonism of BmKE on epilepsy of PTZinduced epileptic mice and the modulation on NMDA recept

4、or(NMDAR) and GABAA receptor (GABAAR) binding activities in cerebral cortex. MethodsThe convulsion latent periods of PTZinduced epileptic mice，vaproate sodium（VAP，positive control drug）treating group and BmKE（L），BmKE（M），BmKE(H) treating groups were observed. NMDAR and GABAAR binding activities of ce

5、rebral cortex were detected by isotope 3H-tagged MK-801 and mulimol respectively. ResultsBmKE(M) significantly prolonged laten periods of epileptic mice(P0.05), BmKE(L) had a few effect on latent periods, the prolonged value of latent periods treated by BmKE(H) was shorter than that treated by BmKE(

6、M). PTZ significantly increased NMDAR binding activities in cerebral cortex of mice (P0.05). Both BmKE(M) and BmKE(H) excessively decreased those of PTZ-induced epileptic mice(p<0.001),but those of BmKE(L) treated group had no significant difference with those of PTZinduced epilepsic mice. GABAAR

7、 binding activities were reduced by PTZ. (P0.005). BmKE(L) and BmKE(H) significantly increased those of PTZinduced epileptic mice(P0.05), and BmKE(M) excessively increased those of PTZinduced epileptic mice(P0.001).ConclusionSuitable BmKE can prolong latent periods of epilepstic mice induced by PTZ,

8、 and has an antiepileptic effect. The effects of BmKE may have relationship between the inhibition on NMDAR binding avtivities and excitation on GABAAR binding avtivities in cerebral cortex of epileptic mice.Key words：BmKE；  GABAA receptor；  NMDA receptor；  Convulsion latent period

9、60;   東亞鉗蝎Buthus martensic Karch是我國傳統(tǒng)藥材，中醫(yī)臨床用干燥全蟲治療驚風(fēng)抽搐、風(fēng)濕痹痛等癥1。提取分離有效部位，進(jìn)而純化有效成分，對(duì)其進(jìn)行藥理活性的檢測，研究其作用機(jī)理將進(jìn)一步提高其臨床應(yīng)用價(jià)值。在實(shí)驗(yàn)性癲癇中，GABAAR的Cl-通道阻斷劑戊四氮（pentylenetetrazol,PTZ）被廣泛應(yīng)用于誘導(dǎo)產(chǎn)生驚厥、建立癲癇動(dòng)物模型。早期的研究發(fā)現(xiàn)，PTZ不僅具有抑制GABAA受體的效應(yīng)2，3，連續(xù)注射還可引起NMDA受體激活，導(dǎo)致Ca2+向細(xì)胞內(nèi)流動(dòng)4。東亞鉗蝎在中醫(yī)臨床上常用于同其他藥物配伍，控制癲癇的發(fā)作，前期研究發(fā)現(xiàn)，BmKE能夠

10、延長癲癇發(fā)作的潛伏期，顯著升高被戊四氮抑制的GABAAR的結(jié)合活性5。BmKE是否還影響NMDAR的結(jié)合活性，從而克服PTZ的作用而達(dá)到治療癲癇的作用，為此，我們進(jìn)一步研究了BmKE對(duì)戊四氮致癇小鼠大腦皮層NMDAR的結(jié)合活性的影響。本文中我們將討論BmKE對(duì)癲癇小鼠大腦皮層中GABAAR和NMDAR的調(diào)節(jié)作用，以闡明BmKE抗癲癇的作用機(jī)理。1  材料與方法1.1  動(dòng)物選用健康昆明系小鼠（一級(jí)），體重（20.5±0.9）g，由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院動(dòng)物研究所提供，在自然光線，溫度為2025的飼養(yǎng)室喂養(yǎng)，自由進(jìn)食水。1.2  藥物與試劑BmKE5，VAP， P

11、TZ，Sigma公司產(chǎn)品，同位素： 3HMucimol(GABAAR拮抗劑配基)，NEN公司，3HMK801（NMDAR拮抗劑配基）， Dupont 公司，閃爍劑：PPO, Fluka 公司（進(jìn)口分裝），NMDAR測定采用BECHMANL9800同位素液閃計(jì)數(shù)儀。1.3  動(dòng)物分組及處理  昆明系小鼠40只，雌雄各半，適應(yīng)環(huán)境3 d后隨機(jī)分成5組?？瞻讓?duì)照組服用蒸餾水0.4 ml/只/d。其余4組用于PTZ癲癇模型的建立。1.4  PTZ癲癇模型的建立  PTZ誘導(dǎo)時(shí)間均定為下午1：00 4：00。動(dòng)物在服藥前均注射PTZ50 mg/kg。建模組動(dòng)物首次

12、注射PTZ的潛伏期和發(fā)作等級(jí)無明顯差異。于第2天上午9：30灌胃給藥?？瞻讓?duì)照組和癲癇模型非治療組服用蒸餾水0.4 ml /(20 gd)；VAP185 mg/kg，并設(shè)計(jì)了3種劑量BmKE服用組，其中低劑量250 mg/kg（BmKEL）、中劑量500 mg/kg（BmKEM）、高劑量1000 mg/mg（BmKEH），給藥體積 0.4 ml，連續(xù)灌服3 d。于最后一次服藥后4 h再次腹腔注射PTZ 50 mg/kg。 1.5  腦突觸粗膜制備 為了探討B(tài)mKE抗癲癇的作用機(jī)理，第2次腹腔注射PTZ50 mg/kg后，將小鼠斷頭取腦，制備操作在4下進(jìn)行。稱取凍存腦組織，按15（w/

13、v）比例加入預(yù)冷的 50 mmol/L pH 7.4 Tris醋酸緩沖液（TAB），在冰浴中用TEKMER組織勻漿器勻漿，用Dupont RC5加入TAB 10 ml離心（21  000 r/min，20 min）。洗滌3次，最后將沉淀懸浮于滅菌的0.32 mol/L蔗糖溶液中，-70凍存?zhèn)溆?。此即突觸粗膜。1.6  NMDAR結(jié)合實(shí)驗(yàn) 將突觸粗膜離心洗滌1次后，用0.5 ml TAB稀釋。取100 l 突觸膜稀釋液，加入200 l TAB，在非特異性結(jié)合管中加入100 l 0. 1 mmol/L非標(biāo)記的MK801和100 l TAB，每管加入0.1 Ci 3HMK801，

14、在30水浴中孵育30 min，反應(yīng)結(jié)束后加入預(yù)冷的TAB5 ml，抽濾在纖維素濾膜上，并用預(yù)冷的TAB20 ml洗滌。將濾膜放入閃爍杯中，75左右烘烤30 min后加入甲苯閃爍液7 ml，在液體閃爍計(jì)數(shù)儀上測定cpm值，結(jié)合突觸膜蛋白質(zhì)濃度計(jì)算3HMK801結(jié)合量（以每毫克蛋白質(zhì)結(jié)合的3HMK801pmol數(shù)表示）：3HMK801特異結(jié)合=（樣本cpm - 非特異結(jié)合cpm）×4.926pmol/mg ptot÷總計(jì)數(shù)cpm。1.7  GABAAR受體結(jié)合實(shí)驗(yàn) 總結(jié)合試管采用3HMucimol(1 nmol/L)在Tris檸檬酸緩沖液（TCB，pH 7.1）中與粗

15、膜于2孵育30 min，非特異性結(jié)合試管另加10-4mmol/L GABA。反應(yīng)結(jié)束后, 加入緩沖液洗滌，負(fù)壓抽濾于纖維素膜，沖洗3遍，將該膜置于閃爍杯中，加甲苯閃爍液進(jìn)行測定。特異性結(jié)合以總結(jié)合減非特異性結(jié)合得到。1.8  統(tǒng)計(jì)方法 采用Cochran Cox 近似 t檢驗(yàn)校正其近似臨界值。數(shù)據(jù)以±s表示，P0.05為差異顯著，P0.005和P0.001為差異極顯著。2  結(jié)果2.1  BmKE對(duì)小鼠癲癇發(fā)作潛伏期的影響  采用治療后癲癇發(fā)作潛伏期治療前癲癇發(fā)作潛伏期的平均值分析，以說明提取物延長發(fā)作潛伏期的程度（見表1）。BmKE（L）作用很小，BmKE（M）的治療效果非常明顯（P0.05），同VAP相當(dāng)，但是，提取物劑量的進(jìn)一步增加，不僅沒有增強(qiáng)對(duì)癲癇的治療作用，其治療作用反而有所下降。-     防止處方調(diào)配差錯(cuò)是一項(xiàng)任重而道遠(yuǎn)的工作,是藥劑人員必須時(shí)時(shí)提高警惕的重要日常工作。它的發(fā)生不是單一的某方面,而是醫(yī)院各個(gè)環(huán)節(jié)的綜合表現(xiàn),對(duì)于涉及兒童健康生命大事的職業(yè),每一位藥學(xué)專業(yè)技術(shù)人員都應(yīng)具有高尚的思想品質(zhì)、嚴(yán)謹(jǐn)?shù)墓ぷ髯黠L(fēng)和高度的責(zé)任心,杜絕一切差錯(cuò)發(fā)生,真心實(shí)意