甲胎蛋白增強(qiáng)子－白蛋白啟動(dòng)子聯(lián)合轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列的克隆

1、    甲胎蛋白增強(qiáng)子白蛋白啟動(dòng)子聯(lián)合轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列的克隆        【摘要】 目的 克隆人肝癌細(xì)胞特異的甲胎蛋白增強(qiáng)子(EAFP)白蛋白啟動(dòng)子(PALB)聯(lián)合轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列。方法 用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)和分子克隆方法，從人染色體基因組中擴(kuò)增白蛋白啟動(dòng)子，將其融合到甲胎蛋白增強(qiáng)子的下游，此融合序列與白細(xì)胞介素-2(IL-2)cDNA連接，定向克隆入真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA-3的多克隆位點(diǎn)區(qū)。用磷酸鈣共沉淀法將質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HepG2和HeLa細(xì)胞，用MTS/PMS法測(cè)定細(xì)胞培養(yǎng)液中

2、IL-2的活性。結(jié)果 PCR擴(kuò)增的白蛋白啟動(dòng)子長(zhǎng)406bp，DNA序列分析發(fā)現(xiàn)含有典型的TATA box、CAAT box和GC box。與甲胎蛋白增強(qiáng)子融合后的片段(EAFP-PALB)長(zhǎng)度為822bp，它能調(diào)控IL-2在HepG2細(xì)胞中的表達(dá)，平均IL-2活性為782U/106細(xì)胞，而在轉(zhuǎn)染的HeLa細(xì)胞培養(yǎng)液中未測(cè)得IL-2活性。結(jié)論 甲胎蛋白啟動(dòng)子白蛋白增強(qiáng)聯(lián)合轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列能特異地調(diào)控目的基因在肝癌細(xì)胞中的表達(dá)，這為肝癌基因治療研究提供了一有效手段?！娟P(guān)鍵詞】 啟動(dòng)子 白蛋白 增強(qiáng)子 甲胎蛋白 轉(zhuǎn)錄調(diào)控THE CLONING OF COMBINED TRANSCRIPTIONAL RE

3、GULATORY SEQUENCES OF -FETOPROTEIN ENHANCER AND ALBUMIN PROMOTERHe Ping, Ye Shenglong, Tang Zhaoyou. Liver Cancer Institute, Shanghai Medical University, Zhongshan Hospital, Shanghai 200032【Abstract】 Objective To clone the specific a-fetoprotein enhancer(EAFP)-albumin promoter(PALB) combinated trans

4、criptional regulatory sequences of human hepatoma cells. Methods An albumin promoter was amplified from human genomic DNA by PCR. This promoter was fused into the down-stream of a-fetoprotein enhancer, ligated with human interleukin-2 cDNA, and then inserted into polyclonal site of eukaryotic expres

5、sion vector pcDNA-3. The recombinant plasmid was transfected into HepG2 and Hela cells by calcium phosphate transfection. The activity of IL-2 in culture medium was measured by MTS/PMS method. Results The 406bp EAFP was confirmed by DNA sequencing that it contains typical TATA box, CAAT box and GC b

6、ox. The fused EAFP-PALB could regulate the expression of IL-2 gene in HepG2 cells, and the activity of IL-2 in the culture medium of transfected HepG2 is 782U/106 cells, but not in transfected Hela cells. Conclusion The combined transcriptional regulatory sequences of EAFP-PALB can regulate specific

7、ally the expression of target genes in hepatoma cells.【Key words】 Promotor Albumin Enhancer a-fetoprotein Transcriptional regulation根據(jù)人肝癌組織中甲胎蛋白和白蛋白的表達(dá)特點(diǎn)，我們克隆甲胎蛋白增強(qiáng)子(AFP enhancer, EAFP)和白蛋白啟動(dòng)子(Albumin promoter, PALB)聯(lián)合轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列，用于指導(dǎo)目的基因在肝癌細(xì)胞中的特異表達(dá)，提高肝癌基因治療的療效。資料與方法1. 質(zhì)粒、菌株和細(xì)胞：含EAFP序列的質(zhì)粒PUH-1由本所制備。pUC18

8、和大腸桿菌JM109由本所保存。pcDNA3質(zhì)粒購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司，細(xì)胞株HepG2、HeLa購(gòu)自中科院細(xì)胞生物研究所。2. 主要試劑：蛋白酶K，限制性?xún)?nèi)切酶EcoR、BamH、Hind，T4 DNA連接酶，Taq DNA聚合酶，dNTP均購(gòu)自Promega公司。3. 擴(kuò)增PALB的引物1：(5'-TTGGATCCC TTAACTCTTTCA-3')和引物2：(5'-GGAATTCCGCTAGGCTAAATTAGCACTAA-3')由中科院植物生理研究所合成，5'端和3'端分別攜帶BamH和EcoR位點(diǎn)。細(xì)胞培養(yǎng)基RPMI1640、

9、抗菌素G418等購(gòu)自GIBICO公司。4. 人染色體DNA的抽提：參見(jiàn)文獻(xiàn)1。5. PCR反應(yīng)體系及條件：gDNA 1g，10×PCR Buffer 10l，2mmol/L dNTP 3l，Taq DNA聚合酶1l，Primer 2l，ddH2O加至100l。95變性1分鐘，55退火1分鐘，72延長(zhǎng)2分鐘，共進(jìn)行30個(gè)循環(huán)。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳分離、回收。6. 分子克隆方法：PCR產(chǎn)物經(jīng)限制性?xún)?nèi)切酶EcoR和BamH酶切。與載體的連接、轉(zhuǎn)化、質(zhì)粒抽提及鑒定等參見(jiàn)文獻(xiàn)2的方法。PCR產(chǎn)物用自動(dòng)測(cè)序儀測(cè)定DNA序列。7. EAFP-PALB聯(lián)合調(diào)控序列指導(dǎo)白介素-2表達(dá)：將I

10、L-2 cDNA置于EAFP-PALB的下游，經(jīng)Hind+Xho酶切，組裝到pcDNA-3的多克隆位點(diǎn)區(qū)命名為pAF(IL-2)，而僅插入IL-2 cDNA的pcDNA-3質(zhì)粒為pCD(IL-2)，將這兩個(gè)重組體分別轉(zhuǎn)染AFP陽(yáng)性的肝癌細(xì)胞(HepG2)和AFP陰性的宮頸癌細(xì)胞(HeLa)，用MTS/PMS法測(cè)定細(xì)胞培養(yǎng)液中IL-2活性。1 人白蛋白啟動(dòng)子PALB序列1.pGEM-7Z(+)/HaeIII Markers(bp):657,458,434,328,289.2.PUH-3/Hind III+ECOR I(bp):822,2635.3.PUH-3/Hind III+BamH I(bp

11、):417,26564.PUH-3/EcoR I+BamH I(bp):406,26645.DNA/HindIII Markers(bp):23130,9416,6682,4361,2322,2027.2 重組質(zhì)粒PUH-3酶切譜3 細(xì)胞培養(yǎng)液中rIL-2的活性結(jié) 果1. PCR擴(kuò)增結(jié)果：擴(kuò)增的PALB片段為406bp(1)。經(jīng)DNA序列分析，其序列與文獻(xiàn)報(bào)道一致3。2. 含EAFP-PALB聯(lián)合序列的質(zhì)粒(PUH-3)構(gòu)建：擴(kuò)增的PALB片段經(jīng)BamH+EcoR雙酶解，EAFP片段從質(zhì)粒pUH-1經(jīng)Hind+BamH雙酶解回收，此兩片段與經(jīng)Hind+EcoR雙酶解的PUC18連接構(gòu)建成質(zhì)粒P

12、UH-3，PALB序列融合于EAFP序列的下游。限制性?xún)?nèi)切酶酶切分析結(jié)果見(jiàn)2。3. EAFP-PALB聯(lián)合調(diào)控序列指導(dǎo)白介素-2的表達(dá)：初步測(cè)定發(fā)現(xiàn)(3)，轉(zhuǎn)染pAF(IL-2)的HepG2細(xì)胞培養(yǎng)液中IL-2的平均活性為782U/106細(xì)胞，轉(zhuǎn)染pAF(IL-2)的HeLa細(xì)胞培養(yǎng)液中未測(cè)到IL-2的活性，pCD(IL-2)在兩種細(xì)胞中表達(dá)的IL-2活性較低(約200U/106細(xì)胞),兩者未見(jiàn)明顯差異。討 論甲胎蛋白作為癌胚抗原已成為臨床診斷復(fù)發(fā)性肝癌的極有價(jià)值的指標(biāo)。我們?cè)肦T-PCR方法測(cè)定肝癌組織、癌旁肝硬化組織及正常肝組織中AFP基因的轉(zhuǎn)錄水平，發(fā)現(xiàn)血漿AFP陽(yáng)性的病人，在其肝癌組

13、織及癌旁肝硬化組織均表達(dá)AFP，前者明顯高于后者，而正常肝組織中無(wú)AFP基因表達(dá)（另文報(bào)道）。這說(shuō)明AFP主要由肝癌組織特異表達(dá)。白蛋白是肝細(xì)胞特異表達(dá)的一種蛋白質(zhì)，自肝細(xì)胞形成起即開(kāi)始表達(dá)，直至成年達(dá)到穩(wěn)定水平。有關(guān)這兩種蛋白質(zhì)在肝細(xì)胞癌中的轉(zhuǎn)錄調(diào)控及其生物學(xué)意義的研究日趨活躍。已有人利用這兩個(gè)基因的啟動(dòng)子或增強(qiáng)子選擇性地調(diào)控胸腺嘧啶激酶(CTK)基因和細(xì)菌胞嘧啶脫氨酶基因在肝癌細(xì)胞中的表達(dá)4, 5。本所已成功地從人染色體中克隆了肝癌細(xì)胞特異的EAFP6，又克隆了肝細(xì)胞特異的PALB，兩者串聯(lián)形成聯(lián)合調(diào)控序列。人甲胎蛋白基因和白蛋白基因串聯(lián)排列于4號(hào)染色體的長(zhǎng)臂上，克隆的EAFP序列位于AF

14、P基因上游的-3.3kb-3.7kb區(qū)域，是AFP增強(qiáng)子的核心區(qū)域。它本身能提高外源基因在肝癌細(xì)胞中的特異表達(dá)7?？寺〉腜ALB序列中含有典型的TATA box和CAAT box，并有一些AT富含區(qū)和GT富含區(qū)，它們是特異的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)，能提高啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活性。還初步研究了EAFP-PALB聯(lián)合調(diào)控序列的功能。結(jié)果提示，這個(gè)聯(lián)合調(diào)控序列能特異地指導(dǎo)IL-2在AFP陽(yáng)性的肝癌細(xì)胞中高效表達(dá)。為進(jìn)一步肝癌基因治療的研究打下了良好的基礎(chǔ)，也將為解決腫瘤基因治療中基因特異性表達(dá)調(diào)控問(wèn)題提供了一個(gè)成功的范例。本課題受?chē)?guó)家自然科學(xué)基金（39400050）和美國(guó)中華醫(yī)學(xué)基金（93-583）資助作者單位：

15、200032上海醫(yī)科大學(xué)中山醫(yī)院、肝癌研究所參 考 文 獻(xiàn)1 Melani C, Rivoltini L, Parmiani G, et al. Inhibition of proliferation by c-myb anti-sense oligodeoxynucleotides in colon adenocarcinoma cell lines that express c-myb. Cancer Res, 1991, 51: 2897-2901.2 Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T. Molecular cloning-a laborartory

16、manual. 2nd Ed, New York. Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989.3 Urano Y, Watanabe K, Masaharu S, et al. The human albumin gene. J Biol Chem, 1986, 261: 3244-3251.4 Su H, Chang JC, Xu SM, et al. Selective killing of AFP-positive hepatocellular carcinoma cells by adeno-associated virus transfer of the herpes simplex virus thymidine kinase gene. Human Gene Therapy, 1996, 7: 463-470.5 Kanai F, Lan KH, Shiratori Y, et al. In vivo gene therapy for a-fetoprotein-producing hepatocellular carcinoma by adenovirus-mediated transfer of cytosine deaminase gene. Cancer Res,