山仙顆粒對荷瘤小鼠免疫功能影響的實驗研究

1、山仙顆粒對荷瘤小鼠免疫功能影響的實驗研究        【摘要】  目的觀察山仙顆粒對荷瘤小鼠免疫系統(tǒng)的影響。方法純系BALB/c小鼠30只，用U14瘤細胞荷瘤建立動物模型，隨機平均分為3組：山仙顆粒組、環(huán)磷酰胺治療組、生理鹽水對照組。觀察山仙顆粒對荷瘤小鼠NK細胞活性、淋巴細胞轉化率、TNF-等免疫指標的影響。結果山仙顆粒能夠顯著提高治療組小鼠的NK細胞活性、淋巴細胞轉化率和血清中TNF-，IL-2的含量。結論山仙顆粒能夠顯著提高荷瘤小鼠免疫系統(tǒng)的活性。 【關鍵詞】  山仙顆粒 小鼠腫瘤 免疫

2、Abstract：ObjectiveTo observe the effect of Shanxian Granule on immune system in tumor-bearing mice.MethodsMMT method was used to estimate cell toxic action of Shanxian Granule.After the animal model of mouse bearing tumors was established, we observed their life spans,NK cell activity, tansformation

3、 efficiency of lymhocytic cell and the content of TNF-.ResultsShanxian Granule could significantly increase the NK cell activity and transformation efficiency of lymphocytic cell, elevate the contents of TNF-, IL-2 in tumorbearing mice.ConclusionShanxian Granule can enhance the activity of immune sy

4、stem in tumor-bearing mice.Key words：Shanxian   Granule;  Tumor;  Immunity     正氣虧虛,血行淤滯是腫瘤發(fā)生與轉移的基本病機。癌癥患者常常免疫功能低下，加之放、化療對全身免疫系統(tǒng)的損傷，患者血中吞噬細胞的活性與吞噬殺傷作用均有不同程度降低，此即中醫(yī)所說的正氣虧虛。由于免疫功能低下，免疫細胞難以識別和殺滅存在于血液循環(huán)中的具有轉移能力的癌細胞而使癌細胞擴散，故氣虛血淤是腫瘤發(fā)生與轉移的主要病機，這也是癌癥晚期患者最常見的證型。筆者多年的臨床經驗,潛心

5、研究,研制出補氣活血之山仙顆粒,臨床觀察有防止腫瘤復發(fā)與轉移作用。經動物實驗證實1，2,山仙顆粒能分別從提高紅細胞免疫、抑制IV型膠原酶表達、提高吞噬細胞功能、抑制腫瘤血管生成等方面對抗癌細胞侵襲與轉移。為深入探討其抗癌轉移機理,本實驗對山仙顆粒對荷瘤小鼠腫瘤免疫系統(tǒng)的影響做了進一步研究?，F報道如下。1  器材與方法1.1  材料1.1.1  動物純系BALB/a小鼠，體重1822 g,67周齡，雌雄各半。1.1.2  山仙顆粒山仙顆粒由陜西中醫(yī)學院附屬制劑中心提供，每10 g山仙顆粒相當于11.5 g生藥，用生理鹽水配制成1.2 g/ml的混懸液待用。

6、1.1.3  瘤株U14(小鼠腹水型宮頸癌細胞)、YAC-I（小鼠淋巴瘤細胞）購自陜西省中醫(yī)研究院動物中心。1.1.4  試劑與儀器RPMI-1640；Gibco 刀豆蛋白A（ConA）；sigma 產四甲基偶唑藍（MTT）；Flu-ka產PCH-100電腦CO2孵育培養(yǎng)箱；TNF-，IL-2試劑盒，上海森雄科技實業(yè)有限公司產品；奧地利產SUTSPECTRA2酶標儀。1.2  方法取U14瘤株生長最佳狀態(tài)的傳代細胞，按細胞數1×106/ml，0.2 ml/小鼠腹腔注射，24 h后隨機分組。山仙顆粒組0.4  ml/d灌胃，1次/d，連續(xù)7 d；

7、生理鹽水（NS）組用無菌NS，途徑、劑量、方法、次數同山仙顆粒組；環(huán)磷酰胺（CY）組用環(huán)磷酰胺0.4 mg/ml，途徑、劑量、方法、次數同山仙顆粒組。于接種瘤株后第12天各組小鼠分別摘除眼球取血，之后再脫頸處死取脾進行下一次實驗。1.2.1  NK細胞殺傷活性的測定小鼠脫頸處死后無菌取脾，制成單個脾細胞，用無菌三蒸水休克紅細胞30 s，迅速加入等量的1.7%無菌鹽水恢復等滲，臺朌藍拒染計數活細胞在95%以上，與YAC-1一起加入96孔培養(yǎng)板（效靶比201），各設3個復孔，MTT法檢測NK細胞活性。NK細胞活性（%）=靶細胞對照孔A值 （實驗孔A值-效應細胞孔A值）/靶細胞對照孔A值&

8、#215;100%。1.2.2  淋巴細胞增殖反應的測定  按上述方法制備脾細胞，濃度為5×106/ml,加入96孔培養(yǎng)板，每孔200µl，實驗孔每孔再加50µl/mlConA20µl，對照孔加培養(yǎng)液20µl,置37 CO2孵育培養(yǎng)箱中培養(yǎng)68 h，離心取上清100µl MTT測A值，淋巴細胞增殖率。淋巴細胞增殖率（%）=實驗孔A值 /對照孔A值×100%1.2.3  荷瘤小鼠血清TNF-含量測定用TNF- ELISA試劑盒，采用雙夾心酶聯免疫檢測法，=450 nm，根據標準A值繪制曲線，從標準

9、曲線上查出待檢標本的TNF-含量。1.2.4  荷瘤小鼠血清IL-2含量測定用IL-2ELISA 試劑盒，采用雙夾心酶聯免疫檢測法，=450 nm,根據標準A值 繪制曲線，從標準曲線上查出待檢標本的IL-2含量。1.3  統(tǒng)計方法兩兩比較，采用方差分析中的SND-q檢驗，結果以±s表示。1         2  結果2.1  山仙顆粒腹水型荷瘤小鼠，NK細胞活性及淋巴細胞增殖率的影響結果見表1。    結果表明山仙顆粒組荷瘤小鼠NK細胞

10、活性及淋巴細胞增殖率顯著高于NS組及CY組(P<0.01),CY組NK細胞活性及淋巴細胞增殖率顯著低于NS組（P<0.05）。2.2  山仙顆粒對腹水型荷瘤小鼠血清中TNF-，IL-2含量的影響結果見表2。表1  山仙顆粒腹水型荷瘤小鼠，NK細胞活性及淋巴細胞增殖率的影響（略）表2  山仙顆粒腹水型荷瘤小鼠血清中TNF-，IL-2含量的影響（略）結果表明山仙顆粒組荷瘤小鼠血清中TNF-，IL-2含量顯著高于NS組及CY組，CY組小鼠血清中TNF-，IL-2含量顯著低于NS組（P<0.05）。3  討論   

11、 腫瘤是嚴重危害人類生命的疾病之一，其死亡率居高不下，為了與腫瘤作斗爭，各國家進行了長期不懈的努力。近年來，中藥抗腫瘤的研究日益得到人們的重視，并取得了一定的成果。山仙顆粒作為有效的抗癌制劑，已被廣泛應用于臨床，本實驗探討其對荷瘤小鼠免疫系統(tǒng)的影響。3.1  實驗表明山仙顆粒對荷瘤小鼠NK細胞活性有明顯的增強作用。NK細胞在機體防御及腫瘤監(jiān)視中起重要作用。NK細胞對敏感的靶細胞的殺傷效應不受靶細胞是否表達MHC的影響。當予以生物反應調節(jié)劑全身或局部或在機體受病毒感染期間，實體組織中NK細胞明顯增加，對監(jiān)視體內微環(huán)境及干涉腫瘤的起到重要作用，故可以認為山仙顆?？鼓[瘤作用與激活NK細胞有

12、密切關系。許多因子如IFN-，IL-2等均可激活NK細胞，殺傷腫瘤靶細胞，活化的NK細胞可釋放細胞因子TNF-，IL-2，IFN-等，呈正向調節(jié)作用，調節(jié)巨噬細胞的功能，擴大了抗腫瘤作用。3.2  實驗表明山仙顆粒能夠促進荷瘤小鼠脾淋巴細胞對COnA的增殖反應，說明山仙顆粒能增強細胞免疫，而環(huán)磷酰胺抑制脾細胞對ConA反應，山仙顆粒能夠拮抗免疫抑制藥所致的免疫抑制。3.3  TNF-是由細菌脂多糖活化的單核巨噬細胞釋放的細胞因子，與腫瘤細胞膜上的TNF-受體結合，特異性地殺傷腫瘤細胞，對機體的正常細胞無害，可致腫瘤細胞壞死。此外，TNF-還在體外與IFN-協同作用，誘導腫瘤

13、細胞凋亡。本實驗表明山仙顆粒實驗小鼠血清中TNF-的含量顯著高于NS組及CY組，說明山仙顆粒能夠促進荷瘤小鼠單核巨噬細胞分泌TNF-，從而提高荷瘤小鼠特異性免疫功能，達到抗腫瘤作用。3.4   IL-2是機體CD4+和CD8+細胞分泌的一種小分子物質，它在機體對腫瘤細胞的免疫監(jiān)控中起著很重要的作用。首先，它可以誘導CTL，NK和LAK等多種殺傷性細胞的分化和效應功能，并能誘導殺傷細胞產生IFN-C，TNF-A等細胞因子；其次IL-2能促進細胞增殖、分化和抗體分泌。已經發(fā)現，活化的B細胞有IL2-R,IL-2對B細胞的調節(jié)作用，除通過刺激T細胞分泌B細胞增殖和分化因子外，還可能有直接調控作用，從而調節(jié)體液免疫；第三，IL-2可促進吞噬細胞通過ADCC機制殺傷腫瘤。此外，IL-2在體外可誘導腫瘤浸潤淋巴細胞成為LAK-C。目前，LAK/IL-2對腎母細胞癌、黑色素瘤、非何杰金氏淋巴瘤、結腸直腸癌有一定療效3。本實驗表明山仙顆粒組小鼠血清中IL-2的含量顯著高于NS組及CY組，說明山仙顆粒能夠提高荷瘤小鼠血清中IL-2的含量，從而提高荷瘤小鼠免疫功能，達到抗腫瘤作用。    綜上所述，本實驗說明山仙顆粒能夠提高荷瘤