外周血多形核白細(xì)胞凋亡情況及生存率與急性胰腺炎嚴(yán)重程度相關(guān)性

1、外周血多形核白細(xì)胞凋亡情況及生存率與急性胰腺炎嚴(yán)重程度相關(guān)性研究         10-02-01 15:33:00     作者：孫綱，高建軍    編輯：studa20【摘要】  目的 研究急性胰腺炎大鼠模型外周血多形核白細(xì)胞即中性粒細(xì)胞（PMN）的凋亡情況及生存率與急性胰腺炎嚴(yán)重程度的關(guān)系。方法 采用在大鼠胰膽管共同通道內(nèi)逆行注射不同濃度的脫氧膽酸鈉，制備不同嚴(yán)重程度的急性胰腺炎模型。18只SD大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、模型1

2、組（0.75%脫氧膽酸鈉劑量組）、模型2組（1.5%脫氧膽酸鈉劑量組）。分別于造模后6 h 處死各組存活大鼠。觀察各組大鼠的胰腺組織病理學(xué)變化、組織病理學(xué)評(píng)分，血清、腹水淀粉酶水平，腹水量及外周血清IL6、IL8水平。同時(shí)用TUNEL法分析外周血多形核白細(xì)胞凋亡情況，用流式細(xì)胞分析法分析外周血多形核白細(xì)胞存活率。并與急性胰腺炎嚴(yán)重程度各項(xiàng)指標(biāo)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)相關(guān)分析。結(jié)果 模型1組大鼠較模型2組大鼠胰腺組織壞死及出血程度輕，組織病理學(xué)評(píng)分低，腹水及血清淀粉酶水平低，腹水量相對(duì)少,外周血清IL6，IL8水平低；病變程度較輕的模型1組大鼠外周血多形核白細(xì)胞凋亡指數(shù)比病變重的模型2組大鼠高（30±

3、;6 vs 20±4 P<0.05）；病變程度較輕的模型1組大鼠外周血多形核白細(xì)胞存活率比病變重的模型2組大鼠低（56.12±4.21） vs （67.15±5.11）， P<0.05。結(jié)論 急性胰腺炎時(shí)，外周血多形核白細(xì)胞凋亡指數(shù)與急性胰腺炎嚴(yán)重程度呈負(fù)相關(guān)，外周血多形核白細(xì)胞存活率與急性胰腺炎嚴(yán)重程度呈正相關(guān)。 【關(guān)鍵詞】  多形核白細(xì)胞；凋亡；存活率；急性胰腺炎Abstract： Objective  To study the relationship between apoptosis index and and sever

4、ity of acute pancreatitis (AP) in rats.Methods  The different severities of acute pancreatitis models of SD rats were established by retrograde injection with different concentrations of sodium deoxycholate into the common bilepancreatic duct of the rats. The rats (n=18) were divided at random

5、into control group, AP1 group (0.75% dose group) and AP2 group (1.5% dose group). The apoptosis indexes of polymorphonuclear neutrophils (PMNs) in acute pancreatitisis were analysed by TUNEL method, and the survival rates of PMNs were measured by flowcytometry analysis.Results  The apoptosis in

6、dex was higher in the AP1 group than in the AP2 group (30±6 vs 20±4, P<0.05), whereas the survival rate was lower in the AP1 group than in the AP2 group (56.12±4.21)% vs (67.15±5.11)%, P<0.05. Conclusion  The apoptosis index of PMNs is inversely related to the severity

7、 of AP, whereas the survival rate of PMNs is positivily related.Key  words： polymorphonuclear neutrophil; apoptosis index; survival rate; acute pancreatitis    多形核白細(xì)胞即中性粒細(xì)胞（polymorphonuclear neutrophil，PMN）作為炎癥反應(yīng)的重要標(biāo)志物之一，在炎癥反應(yīng)的各個(gè)階段發(fā)揮著重要作用1。據(jù)以往研究2表明在急性胰腺炎病程中PMN的凋亡是一種保護(hù)現(xiàn)象，可延緩急性胰腺炎的

8、病變發(fā)展。當(dāng)PMN進(jìn)入抗感染狀態(tài)時(shí)，其壽命比正常循環(huán)中的PMN半衰期明顯延長(zhǎng)，其存活及凋亡情況對(duì)炎癥發(fā)展起著重要作用。外周血PMN的凋亡指數(shù)及生存率客觀反應(yīng)出外周血PMN的存在方式及組成成分，且可能與急性胰腺炎嚴(yán)重程度存在相關(guān)性。我們采用不同藥物濃度制備不同嚴(yán)重程度的急性胰腺炎大鼠模型，觀察各組大鼠的胰腺組織病理學(xué)變化、組織病理學(xué)評(píng)分，血清、腹水淀粉酶水平，腹水量及外周血清IL6、IL8水平等指標(biāo)以確定急性胰腺炎病變嚴(yán)重程度，同時(shí)應(yīng)用TUNEL方法分析外周血PMN的凋亡指數(shù)及應(yīng)用流式細(xì)胞分析法分析外周血PMN的存活率。最終分析外周血PMN凋亡及存活率與急性胰腺炎大鼠模型嚴(yán)重程度的相關(guān)性。1&#

9、160; 材料和方法11  主要試劑及儀器 （1）淋巴細(xì)胞分離液： 上海恒信化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品；（2）原位細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒（POD）：德國(guó)ROCHE公司產(chǎn)品；（3）DAB：北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；（4）EPICSXL 流式細(xì)胞儀：美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特公司；（5）SD大鼠：中國(guó)醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物試驗(yàn)室；（6）IL6、IL8 ELISA Kit：美國(guó)Genzyme Co；（7）Annexin VFITC Kit：深圳晶美生物工程有限公司。12  實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及方法121  選用健康SD大鼠18只，雌雄各9只，體重230250 g，隨機(jī)分為對(duì)照組，模型1組，模型2

10、組。其中，對(duì)照組僅常規(guī)開腹，翻動(dòng)胰腺；模型1組、模型2組分別為胰膽管內(nèi)注射濃度為0.75%、1.5%的脫氧膽酸鈉制備的急性胰腺炎模型組。給藥后6h經(jīng)靜脈放血處死各組存活大鼠。122  各組留取外周血5 ml，肝素抗凝，注入已經(jīng)預(yù)置5  ml 濃度為30 g/L葡萄糖T 500離心管中，混合均勻；將離心管于恒溫箱中37靜置45 min，使RBC沉降；取上層液，以1 000r/min、離心半徑10 cm  離心10 min，去上清；將沉淀重懸于含3小牛血清的PBS中，鋪放在等體積的淋巴細(xì)胞分離液上，以1 000 r/min 離心半徑10 cm 水平離心20 min，去

11、上清；加入1 ml  0 無菌蒸餾水，靜待30  min，溶解剩余的RBC；加入1 ml  20 g/L氯化鈉溶液，構(gòu)成等滲液，以1 000 r/min 離心半徑10 cm離心10 min，去上清；將沉淀以PRMI 1640培養(yǎng)液以1 000 r/min、離心半徑10 cm 離心10 min，共2次；以含10熱滅活新生牛血清、青霉素鈉100 U/ml、鏈霉素100 U/ml 的RPMI 1640培養(yǎng)液懸浮細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為5×106/ml；應(yīng)用苔盼藍(lán)拒染法測(cè)定，PMN純度>95%；將分離的各組PMN分別接種于24孔培養(yǎng)板，每孔細(xì)胞數(shù)5×

12、106（2 ml）；將培養(yǎng)板放置于CO2培養(yǎng)箱中，在37 ，飽和濕度，5的CO2條件下孵育24 h3。 123  與此同時(shí)快速切取各組胰腺組織標(biāo)本，置于20中性磷酸鹽緩沖液甲醛中固定，4 m 連續(xù)切片，行常規(guī)HE染色。124  留取各組標(biāo)本適量血清供測(cè)定淀粉酶及IL6、IL8水平；留取各組腹水供腹水量及腹水淀粉酶水平測(cè)定。13  觀察指標(biāo)及具體觀察方法131  光鏡下胰腺組織病理學(xué)改變。常規(guī)制作病理HE切片。方法按臨床病理學(xué)切片檢查方法進(jìn)行。觀察各組胰腺組織病變程度及按照Kyogoku法進(jìn)行組織病理學(xué)評(píng)分。132  血清淀粉酶及腹水淀粉酶測(cè)定。采用全自動(dòng)生化分析檢測(cè)儀。133  腹水量測(cè)量。浸滿腹水紗布重量與浸濕前的干紗布重量之差即為腹水量。134  外周血清IL6，IL8水平檢測(cè)。采取血樣后，立即進(jìn)行離心，留取血清采用ELISA法進(jìn)行檢測(cè)。135  用TUNEL方法檢測(cè)外周血PMN凋亡指數(shù)。其方法原理為：在末端脫氧核糖核