固相萃取差示脈沖伏安法測定牛黃解毒片的黃芩苷

1、固相萃取差示脈沖伏安法測定牛黃解毒片的黃芩苷 【摘要】 目的研究黃芩苷在玻碳電極上的伏安行為,建立牛黃解毒片中黃芩苷的含量測定方法。方法Waters PlusC18(1 mL/50 mg,30 m)固相萃取柱進行樣品前處理,采用循環(huán)伏安法與差示脈沖伏安法研究黃芩苷在玻碳電極上的伏安行為。結果用20%甲醇1.0 mL能完全洗脫黃芩苷;在pH 3.0磷酸鹽緩沖溶液中,黃芩苷的差示脈沖伏安峰電流與其濃度在110-6910-5 mol/L呈良好的線性關系,檢測限為110-7mol/L。結論本法簡便、經(jīng)濟,靈敏度高,用于牛黃解毒片中黃芩苷的含量測定效果滿意。 【關鍵詞】 電化學 色譜法 固相萃取 牛黃解

2、毒丸 黃芩苷 牛黃解毒片為常見清熱解毒中藥制劑,其處方由牛黃、雄黃、石膏、大黃、黃芩、桔梗、冰片和甘草8味中藥組成。方中黃芩瀉火解毒,黃芩苷為其主要有效成分之一。因此,中國藥典(2005版)采用高效液相色譜法1分析牛黃解毒片中的黃芩苷成分以控制牛黃解毒片的質量,該法準確,但費時,所需儀器設備昂貴。已有文獻報道采用紫外分光光度法、高效毛細管電泳法等方法測定方劑中黃芩苷的含量2 3,但樣品前處理大多涉及到溶劑多次萃取過程,操作較復雜且準確度和精密度不好?？紤]到黃芩苷分子中的酚羥基結構具有電化學活性,可利用電化學分析手段對其進行微量和特異性的檢測。筆者研究黃芩苷在玻碳電極(GCE)上的循環(huán)伏安和差示

3、脈沖伏安行為,建立其差示脈沖伏安測定法。 1材料和方法 1.1儀器電化學分析儀(CHI660B，上海辰華儀器公司);精密酸度計(pHS3B型，上海雷磁儀器廠);醫(yī)用數(shù)控超聲波清洗器(KQ250DE型，昆山市超聲儀器有限公司);Waters PlusC18固相萃取小柱(1 mL/50 mg,30 m),柱材料為十八烷基鍵合硅膠(美國Waters公司)。 1.2試劑無水乙醇、甲醇及磷酸(AR,安徽安特生物化學有限公司);牛黃解毒片(北京同仁堂科技發(fā)展股份有限公司制藥廠,規(guī)格片心重0.27 g,批號:4122356,6121877,6120617);110-3mol/L黃芩苷標準溶液:準確稱取黃芩苷

4、對照品(中國藥品生物制品檢定所)5 mg,用70%乙醇溶液溶解并定容于10 mL容量瓶,避光保存;磷酸鹽緩沖液(PBS)由0.05 mol/L NaH2PO4Na2HPO4+0.02 mol/L NaCl配制,并用H3PO4與0.1 mol/L NaOH調節(jié)至所需pH值;所用試劑均為分析純,實驗用水為二次蒸餾水。 1.3方法 1.3.1電極預處理以飽和甘汞電極為參比電極(以下所述電位均相對于該電極),鉑絲電極為對電極,玻碳電極(GCE)為工作電極。玻碳電極依次用金相砂紙和0.05 m氧化鋁粉末和水的混合物拋光至鏡面,然后依次用11乙醇和二蒸水超聲清洗,取出后待用;實驗前,測定系統(tǒng)用2 mmol

5、/L K3Fe(CN)6水溶液校準,電位測量誤差為0.004 V,全部實驗在室溫下進行。 1.3.2黃芩苷循環(huán)伏安行為采用三電極系統(tǒng),以飽和甘汞電極為參比電極(以下所述電位均相對于該電極),鉑絲電極為對電極,以GCE為工作電極,在-0.2-0.8 V電位研究黃芩苷的循環(huán)伏安行為,并考察掃描速度、溶液pH等因素對黃芩苷電化學氧化的影響。 1.3.3差示脈沖伏安法測定黃芩苷用 0.05 mol/L PBS作為媒介溶液,在-0.2-0.8 V電位測定黃芩苷的差示脈沖伏安曲線,記錄氧化峰電流值,并用空白溶液進行背景校正。 1.3.4固相萃取分離純化樣品將牛黃解毒片20片原藥除去外殼黃色包衣后研成粉末。

6、準確稱取試樣0.6 g于錐形瓶中,加70%乙醇30 mL,超聲處理20 min,放冷,濾過,濾液置100 mL量瓶中,用少量70%乙醇分次洗滌容器和殘渣,洗液濾入同一量瓶中,加70%乙醇至刻度,搖勻,待用。用甲醇1 mL活化SPE柱后,再用二蒸水0.5 mL平衡固定相,速度為每秒1滴。將上述處理好的試樣加到SPE柱上,每次上樣200 L,再用二蒸水200 L作為洗脫溶劑洗脫,用注射器盡量吹出SPE柱中的洗脫溶劑,最后用25%甲醇1 mL將黃芩苷洗脫,收集洗脫液約1.0 mL。 1.3.5固相萃取洗脫條件選擇與萃取回收率以高、中、低3個濃度(110-5,310-5,510-5 mol/L)的黃芩

7、苷標準溶液為研究對象,均于固相萃取柱上上樣200 L,分別使用0.5%,10%,25%,40%,60%,80%,100%甲醇水溶液各1 mL進行洗脫。記錄黃芩苷色譜帶完全流出所需的時間和體積,采用高效液相色譜法測定黃芩苷含量并計算其回收率8,以萃取回收率作為評價指標。 2結果 2.1黃芩苷在玻碳電極上的循環(huán)伏安行為在pH 3.0 PBS溶液中,以2.010-5 mol/L黃芩苷為分析對象,其在玻碳電極上的氧化峰電位(Epa)為0.420 V,還原峰電位(Epc)為0.395 V,兩峰電位相差25 mV(圖1)。改變?nèi)芤簆H值,記錄黃芩苷在不同pH值中的循環(huán)伏安圖(圖2),計算各pH溶液中的式量

8、電位E值,將其對溶液的pH值作圖(圖3),可得一直線,其斜率為-64.7 mV/pH,此外,在pH 3.0 PBS溶液中,隨著掃描速度從20 mV/s增加到140 mV/s,其氧化峰電流(Ip)明顯增大,且Ip與掃描速度(v)呈良好的線性關系(圖4)。 A:黃芩苷; B:空白溶液.掃描速率:100 mV/s. 圖1循環(huán)伏安曲線 Fig 1Cyclic voltammograms of baicalin with a scan rate of 100 mV/s 2.2電化學檢測體系工作條件的選擇影響伏安法測定靈敏度和分辨率的主要因素一般有伏安法的類型、酸度,掃描電位等因素。以黃芩苷的氧化峰為測定

9、對象,優(yōu)化選擇測定實驗條件。 2.2.1方法應用循環(huán)伏安法(CV),線性掃描伏安法(LSV),方波伏安法(SWV)和差示脈沖伏安法(DPV)等對黃芩苷的PBS(pH 3.0)溶液在玻碳電極(GCE)上的電化學進行比較。在相同的測定條件 pH a:2.0;b:3.0;c:4.0;d;5.0;e:6.0;f:7.0;g:8.0.掃描速率:100 mV/s. 圖2黃芩苷在不同pH值溶液中的循環(huán)伏安曲線 Fig 2Cyclic voltammograms of baicalin at GCE with pH 圖3pH對黃芩苷式量電位的影響 Fig 3The effect of E (baicalin)