口腔癌細(xì)胞誘導(dǎo)的淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞基因表達(dá)譜的變化

1、口腔癌細(xì)胞誘導(dǎo)的淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞基因表達(dá)譜的變化作者：張壯 張松濤 韓波 夏輝 潘劍作者單位：1.口腔疾病研究國家重點實驗室，四川大學(xué)；2.四川大學(xué)華西口腔醫(yī)學(xué)院 口腔頜面外科教研室，四川 成都 610041【摘要】【摘要】目的 探討在口腔癌細(xì)胞影響下淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞分子表型的變化。方法 利用體外共培養(yǎng)模型，將淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞與口腔癌細(xì)胞進(jìn)行共培養(yǎng)，模擬腫瘤中淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞的變化。應(yīng)用 Affymetrix U133 Plus 2.0 基因芯片對腫瘤組織中淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞（TLEC）與淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞（LEC）基因表達(dá)的差異進(jìn)行了檢測和比較。并對功能相似的表達(dá)差異基因進(jìn)行分類。結(jié)果 差異基因表達(dá)譜共發(fā)現(xiàn)

2、了 677 個基因表達(dá)差異在 1 倍以上，其中在 TLEC 中表達(dá)上調(diào)的基因有 384 條，下調(diào)的基因有 293 條。這些基因與細(xì)胞黏附、凋亡、運(yùn)動、發(fā)育及血管生成有關(guān)。同時這些基因還參與細(xì)胞的信號傳導(dǎo)、免疫應(yīng)答、細(xì)胞代謝等過程。結(jié)論 LEC 與 TLEC 在分子水平是有差別的。以此為基礎(chǔ)，可以針對淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行靶向阻斷，達(dá)到治療口腔癌淋巴道轉(zhuǎn)移的目的?！娟P(guān)鍵詞】【關(guān)鍵詞】口腔癌 淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞 淋巴道轉(zhuǎn)移 基因芯片Altered gene expression of lymphatic endothelial cells in oralcancerZHANG Zhuang1，2, ZHA

3、NG Song-tao2, HAN Bo2, XIA Hui2, PANJian2. （1. State Key Laboratory of Oral Diseases, Sichuan University,Chengdu 610041, China; 2. Dept. of Oral and Maxillofacial Surgery,West China College of Stomatology, Sichuan University, Chengdu 610041,China）AbstractObjectiveTo explore altered molecular phenoty

4、peof lymphatic endothelial cells（LEC） induced byoral cancer cells. Itis relevant to develop therapeutic strategies for blocking oralcancer spread through lymphatic vessels. MethodsLEC were co-cultured with oral cancer cells in a model. Differential geneexpression profiles be-tween tumor-derived lymp

5、hatic endothelial cell（TLEC） and LEC were analyzed by Human Genome U133 Plus 2.0GeneChiparrays. Differential expression genes of functional similarity wereclassified. ResultsDifferential gene expression profiles revealedthat 677 unique genes had at least a twofold change in expressionlevel between t

6、he two groups, 384 were overexpressed，and 293 wereunderexpressed in TLEC. These genes were related to cell adhesion,apoptosis, cell motility, development, and angiogenesis. In addition,some genes were involved in signal transduction, immune response,cell metabolism, and so on. ConclusionLEC and TLEC

7、 are distinct atthe molecular level. A novel therapeutic strategy of lymphaticmetastasis is encouraging and anticipated based upon manipulation ofLECresponses to oral cancer cells.Key wordsoral cancer； lymphatic endothelial cell；lymphatic metastasis； gene microarray淋巴系統(tǒng)不僅在免疫監(jiān)視、血漿間質(zhì)平衡、預(yù)防水腫、脂肪吸收等過程中起作

8、用，而且在許多病理過程中起作用，包括腫瘤的淋巴道轉(zhuǎn)移1-2。當(dāng)腫瘤細(xì)胞與淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞（lymphatic endothelialcell，LEC）接觸之后，腫瘤細(xì)胞可以穿越內(nèi)皮細(xì)胞屏障，進(jìn)入淋巴管系統(tǒng)，進(jìn)而發(fā)生轉(zhuǎn)移。因此，LEC是發(fā)生轉(zhuǎn)移癌細(xì)胞的重要作用界面，兩者之間的相互作用是淋巴道播散的關(guān)鍵步驟。那么，口腔癌中的淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞與正常的淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞具有哪些差異，這些差異對口腔癌的淋巴道轉(zhuǎn)移有何影響，目前很少報道。本實驗利用人淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞進(jìn)行共培養(yǎng)，模擬了腫瘤組織中淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞（tumor-derived lymphatic endothelial cell，TLEC）的變化

9、3，采用全基因組的芯片對正常 LEC 及腫瘤中 LEC 基因表達(dá)譜進(jìn)行了檢測和對比，從而更全面的了解 LEC 轉(zhuǎn)錄水平的變化。1 1材料和方法材料和方法1.1細(xì)胞培養(yǎng)人淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞（human lymphatic endothelialcells，HLEC）及內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基（endothelial cellmedium，ECM）均購自美國 Sciencell 研究實驗室。完全內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基由 500 mL ECM、25 mL FBS、5 mL 內(nèi)皮細(xì)胞生長添加劑（endothelial cell growthsupplement，ECGS）、5 mL 青霉素/鏈霉素溶液組成。HLEC 在 3

10、7 、5%CO2 環(huán)境中進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)傳代。傳代 3 次后用于后續(xù)實驗。Tca8113 細(xì)胞株為上海交通大學(xué)附屬第九人民醫(yī)院饋贈。應(yīng)用添加 5FBS 及 5雙抗的 RPMI 1640 培養(yǎng)基（Gibco 公司，美國）進(jìn)行培養(yǎng)、傳代。1.2Tca8113 與 LEC 共培養(yǎng)模型的建立應(yīng)用 Transwell 膜（Corning 公司，美國）對共培養(yǎng)的細(xì)胞進(jìn)行隔離。聚酯膜的孔徑為 0.4 m。將 Tca8113（每毫升 1106 個）接種于聚酯膜過濾嵌套內(nèi)，用添加 5FBS 及 5雙抗的 RPMI 1640 培養(yǎng)基培養(yǎng)，貼壁后 PBS 洗 2次。將附著細(xì)胞的嵌套轉(zhuǎn)入 6 孔板中，其中的 LEC 已經(jīng)

11、匯合。加入無 ECGS 的ECM，于 37 、5%CO2 環(huán)境中共培養(yǎng) 35 d，觀察共培養(yǎng)后 LEC 細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變。1.3腫瘤細(xì)胞總 RNA 的提取和純化吸去培養(yǎng)液，4 預(yù)冷 DEPC-PBS 溶液沖洗 1 次。加入 Trizol（Invitrigen 公司，美國）振蕩并以移液器反復(fù)吹打。氯仿振蕩混勻，室溫放置 23 min，4 下 12 000 r/min 離心 15 min，吸取上層水相至 DEPC 預(yù)處理的 EP 管中。加入 0.5 mL 異丙醇，-20 沉淀 30 min。4 下 12 000 r/min離心 10 min，棄上清。沉淀中加入 1 mL 75%乙醇，于 4 下 12

12、 000 r/min 離心 10 min，小心移出上清。重復(fù)用 75%乙醇洗滌 RNA 沉淀。加入 30 L 無RNase 水，充分溶解。變性凝膠電泳進(jìn)行質(zhì)檢。參照說明書，應(yīng)用 Rneasy MiniKit（Qiagen 公司，美國）對總 RNA 進(jìn)行純化，瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行質(zhì)檢。1.4cDNA 和 cRNA 的制備應(yīng)用 Affymetrix one-cycle cDNA Synthesis Kit （Affymetrix 公司，美國）將總 RNA 分別合成 1st cDNA 及 2nd cDNA。合成的 cDNA 應(yīng)用 AffymetrixGeneChip Sample Cleanup Mo

13、dule（Affymetrix 公司，美國）進(jìn)行純化。純化后的產(chǎn)物采用 GeneChip IVT Labeling Kit（Affymetrix 公司，美國）反轉(zhuǎn)錄成 cRNA。cRNA 再次經(jīng)過 GeneChip Sample Cleanup Module 進(jìn)行純化 cRNA。加入片段化緩沖液及無 RNase 水，配置緩沖體系，94 溫浴 35 min，之后置于冰上。片段化 cRNA 約為 35200 bp，配置雜交液，待芯片檢測。1.5芯片雜交、洗脫和掃描實驗采用 Human Genome U133 Plus 2.0 Gene-Chip arrays（Affymetrix公司，美國），芯片

14、包含 47 000 轉(zhuǎn)錄本，代表 38 500 明確的基因。首先在AffymetrixHybridization Oven 640（Affymetrix 公司， 美國）中進(jìn)行測試芯片的雜交、洗染和分析，根據(jù)測試芯片的結(jié)果，檢測合格后再雜交表達(dá)譜芯片。應(yīng)用 GeneArrayTM scanner 3000（Affymetrix 公司，美國）掃描芯片獲得原始數(shù)據(jù)。判斷 Affymetrix 基因芯片實驗成功的標(biāo)準(zhǔn)如下：基因芯片的掃描圖像外觀必須出現(xiàn) 4 條明暗交替模式、拐角棋盤模式；左上角芯片名稱清晰；芯片中央有十字模式。背景平均值為 20150。lys、phe、thr、dap 信號值應(yīng)呈現(xiàn)遞增的

15、趨勢；雜交對照 bioC、bioD、cre 應(yīng)該總是檢測到, 并且以遞增的信號強(qiáng)度表達(dá)。-Actin 和 GAPDH 探針組的 3/5比值至少小于 3；總體基因的表達(dá)率不能低于 20。1.6數(shù)據(jù)分析掃描后獲得的圖像應(yīng)用 GCOS 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。圖像中的熒光強(qiáng)度去除背景干擾，Normalization 進(jìn)行定量。探針信號表達(dá)強(qiáng)度上調(diào) 1 倍或者對照樣本中表達(dá)缺失的基因認(rèn)為是表達(dá)上調(diào)基因。反之亦然，認(rèn)為是表達(dá)下調(diào)的基因。對于表達(dá)差異的基因應(yīng)用 unsupervised hierarchical cluster 分析，將功能相似的基因進(jìn)行分組歸類。2 2結(jié)果結(jié)果2.1LEC 及 TLEC 的形態(tài)

16、學(xué)觀察倒置顯微鏡下觀察，LEC 與 TLEC 都表現(xiàn)為典型的內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)，匯合后形成“砌路石”外觀（圖 1A、1D）。在包被纖維粘連蛋白的孔板中，都可以形成管型結(jié)構(gòu)。通過形態(tài)學(xué)觀察，兩者之間沒有明顯的區(qū)別。Tca8113 細(xì)胞能夠在體外順利擴(kuò)增，呈上皮細(xì)胞形態(tài)，分化程度低（圖 1B）。接種于 Transwell 膜后，細(xì)胞能夠良好貼壁（圖 1C）。本次共培養(yǎng)采用的膜能夠良好的分離腫瘤與淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞，培養(yǎng)過程中未見到兩種細(xì)胞的混合。2.2RNA 質(zhì)檢本實驗收集 LEC 及 TLEC 各一份標(biāo)本，分別將提取的總 RNA 進(jìn)行 1瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果可見明顯的 28 S、18 S 這 2 條帶，清

17、晰，無明顯脫尾。5 S 區(qū)帶不明顯。說明 RNA 提取質(zhì)量較高，無明顯降解。2.3Affymetrix 基因芯片實驗質(zhì)量控制根據(jù) Affymetrix 基因芯片的技術(shù)特點，無論是測試芯片還是實驗芯片，基因芯片的樣本是高質(zhì)量的，實驗操作是成功的，得出的結(jié)果是可信的。2.4TLEC 與 LEC 差異性表達(dá)基因根據(jù)掃描后基因芯片的信號強(qiáng)度對 TLEC 及 LEC 的差異表達(dá)進(jìn)行了分析。表達(dá)升高或降低 1 倍以上的基因認(rèn)為是差異表達(dá)基因。本實驗中共發(fā)現(xiàn) 677 個差異基因，其中 384 個基因表達(dá)上調(diào)，293 個基因表達(dá)下調(diào)。這些基因與細(xì)胞黏附、凋亡、運(yùn)動、發(fā)育及血管生成有關(guān)。同時這些基因還參與細(xì)胞的

18、信號傳導(dǎo)、免疫應(yīng)答、細(xì)胞代謝等過程（部分差異基因見表 1、2）。3 3討論討論淋巴系統(tǒng)是腫瘤擴(kuò)散的一個重要通道，尤其對口腔癌（oral squamouscell carcinoma，OSCC）來說，淋巴道轉(zhuǎn)移具有更重要的意義4。因為 OSCC容易發(fā)生早期的淋巴道轉(zhuǎn)移，同時頸部淋巴結(jié)是否發(fā)生轉(zhuǎn)移是癌癥患者生存及預(yù)后的重要影響因素5-6。近來發(fā)現(xiàn)的促進(jìn)淋巴管生成的因子以及淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞的標(biāo)志物，使研究淋巴道轉(zhuǎn)移過程中腫瘤細(xì)胞與 LEC 的相互作用成為可能。在此基礎(chǔ)上，如何通過阻斷 LEC 與腫瘤細(xì)胞的相互作用進(jìn)而減少淋巴道轉(zhuǎn)移幾率成為腫瘤轉(zhuǎn)移領(lǐng)域的熱點，因為這是一種全新的治療策略，不僅是從腫瘤細(xì)胞

19、自身的角度，而且從淋巴道轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵及限速步驟入手，著眼于腫瘤細(xì)胞與微環(huán)境中轉(zhuǎn)移相關(guān)的關(guān)鍵因素淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞7-8。多項研究9-14表明，OSCC 中同樣存在淋巴管生成的現(xiàn)象。一般將 OSCC中的淋巴管分成 2 種：癌周淋巴管（peritumor lymphatics，PTLs）和癌中淋巴管（intratumor lymphatics，ITLs）。腫瘤細(xì)胞很可能主要通過 PTLs 發(fā)生淋巴道轉(zhuǎn)移，但是不能排除 ITLs 參與轉(zhuǎn)移的可能15-16。但是，腫瘤細(xì)胞成功實現(xiàn)轉(zhuǎn)移除了管腔數(shù)量及面積的多少，更主要取決于腫瘤細(xì)胞能否向 LEC 移動、黏附及穿越內(nèi)皮細(xì)胞屏障。那么，在發(fā)生淋巴道轉(zhuǎn)移的腫瘤中，L

20、EC 表達(dá)哪些參與腫瘤細(xì)胞趨化或是黏附等過程的分子呢？腫瘤中 LEC 基因表型與正常組織中 LEC 有什么區(qū)別，與腫瘤的淋巴道轉(zhuǎn)移有什么聯(lián)系呢？目前對這些問題知之甚少。但是從相關(guān)的腫瘤組織內(nèi)血管內(nèi)皮細(xì)胞研究文獻(xiàn)可以推測：TLEC 可能與腫瘤組織內(nèi)血管內(nèi)皮細(xì)胞相似，形成與正常 LEC 不同的特殊表型，甚至表達(dá)一些組織特異或者腫瘤特異性的分子17-18。為了揭示 TLEC 基因表型的變化，本實驗利用 LEC 與 Tca8113 進(jìn)行共培養(yǎng)，模擬 LEC 的腫瘤環(huán)境。此外，為了更全面的了解 TLEC 與 LEC 基因表達(dá)的差異，采用全基因組芯片，對細(xì)胞表達(dá)的所有基因進(jìn)行轉(zhuǎn)錄水平的分析。結(jié)果顯示：相對

21、于 LEC，TLEC 中大約有 677 個明確的基因表達(dá)上調(diào)或是下調(diào) 1 倍以上，并且這些基因具有特定的功能，與細(xì)胞的凋亡、生長、黏附以及細(xì)胞外基質(zhì)的構(gòu)成有關(guān)。因此實驗結(jié)果提供了明確的 TLEC 的分子特征，為進(jìn)一步研究 LEC 在淋巴道轉(zhuǎn)移過程中的作用提供了基礎(chǔ)。同時，從中也可以得到幾個重要的結(jié)論：首先 TLEC 與 LEC 是高度相似的，因為通過全基因組的掃描，只發(fā)現(xiàn)了 677 個差異基因；其次，TLEC 與 LEC 在性質(zhì)上又是完全不同的，384 個上調(diào)的基因和293 個下調(diào)的基因已經(jīng)造成了 LEC 生物學(xué)性狀的改變；另外，TLEC 已經(jīng)具有了特定的分子表型，可能主動參與淋巴道轉(zhuǎn)移的過程

22、。例如，多個參與血管生成的生長因子在 TLEC 表達(dá)上調(diào)；3 種細(xì)胞生長因子及細(xì)胞因子表達(dá)上調(diào)，僅有一種表達(dá)下調(diào)；參與細(xì)胞外基質(zhì)構(gòu)成的分子發(fā)生了顯著的改變。這些分子已經(jīng)證明與淋巴道轉(zhuǎn)移關(guān)系密切。腫瘤轉(zhuǎn)移的機(jī)制目前不明，但是有一點可以肯定，腫瘤轉(zhuǎn)移不是一個隨機(jī)的過程。腫瘤細(xì)胞可能通過主動或是被動的方式進(jìn)入管道系統(tǒng)19，比較認(rèn)可的解釋是一方面腫瘤細(xì)胞沿著趨化分子形成的梯度進(jìn)行遷移，一方面內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)的組織特異性黏附分子選擇遷移的腫瘤細(xì)胞并指導(dǎo)定向轉(zhuǎn)移20-21。本實驗結(jié)果顯示，TLEC 可以表達(dá)生長因子、細(xì)胞因子、趨化因子及與細(xì)胞黏附相關(guān)的分子，說明 TLEC 不僅可以參與遷移梯度的形成，而且可以

23、參與腫瘤細(xì)胞的定向轉(zhuǎn)移，在淋巴道轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮主動的作用。因此，在淋巴道轉(zhuǎn)移過程中，TLEC 可能不是傳統(tǒng)觀點認(rèn)為的一個被動參與因素22-23?？傊诒緦嶒炛邪l(fā)現(xiàn)了 TLEC 中 600 余個差異表達(dá)的基因，雖然數(shù)目不多，但是如何確定參與淋巴道轉(zhuǎn)移的相關(guān)基因還是相當(dāng)困難。不僅僅是因為差異基因數(shù)目較多，主要是這些基因的功能還沒有完全清楚。但是，深入理解正常組織及腫瘤組織中 LEC 基因表達(dá)差異的意義，對于發(fā)現(xiàn)參與淋巴道轉(zhuǎn)移的相關(guān)基因具有重要意義。本研究為阻斷腫瘤細(xì)胞與 LEC 相互作用提供了理論基礎(chǔ)，為今后淋巴道轉(zhuǎn)移靶向治療提供了新的思路?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】【參考文獻(xiàn)】1 Saharinen P,

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