單鏈可變區(qū)片段與趨化因子融合的獨特型淋巴瘤疫苗原核表達(dá)質(zhì)粒的

1、單鏈可變區(qū)片段與趨化因子融合的獨特型淋巴瘤疫苗原核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及表達(dá)(1)               作者：王福旭趙冰程云會潘崚羅建民張學(xué)軍董作仁【摘要】  本研究目的在于克隆小鼠 B 細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞膜免疫球蛋白（Ig）的單鏈可變區(qū)片段（scFv），與單核細(xì)胞趨化因子（MCP-3）的基因融合，構(gòu)建融合基因scFv- MCP-3的表達(dá)載體，在大腸桿菌中表達(dá)融合蛋白，制備作為治療B細(xì)胞淋巴瘤的獨特型融合蛋白疫苗。采用RT-PCR法擴(kuò)增BALB/c

2、小鼠源B細(xì)胞淋巴瘤A20細(xì)胞株的Ig VH和Ig VL基因，重組PCR法用一段編碼 (Gly4Ser)3連接肽的基因序列連接兩基因，制備scFv片段。用相同PCR方法，選用一段編碼NDAQAPKS連接肽的基因序列，連接scFv與MCP-3基因，獲得scFv- MCP-3融合基因片段。定向克隆到原核表達(dá)質(zhì)粒pGLo中，并在大腸桿菌中表達(dá)融合蛋白。測序結(jié)果表明：分別成功克隆A20細(xì)胞的Ig VH 和Ig VL基因，并成功制備了scFv片段和scFv- MCP-3融合基因片段；限制性酶切方法證實，重組pGLo/scFv- MCP-3原核表達(dá)質(zhì)粒中融合基因準(zhǔn)確插入。SDS-PAGE電泳分析顯示，融合蛋

3、白分子量約65 kD, 與預(yù)期蛋白分子量一致，并且目的蛋白占菌體蛋白的30%。 結(jié)論：本研究成功構(gòu)建鼠源scFv片段與趨化因子MCP-3融合的獨特型B細(xì)胞淋巴瘤疫苗表達(dá)質(zhì)粒pGLo/scFv- MCP-3，并實現(xiàn)融合蛋白的初步表達(dá)。 【關(guān)鍵詞】  本研究目的在于克隆小鼠 B 細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞膜免疫球蛋白（Ig）的單鏈可變區(qū)片段（scFv），與單核細(xì)胞趨化因子（MCP-3）的基因融合，構(gòu)建融合基因scFv- MCP-3的表達(dá)載體，在大腸桿菌中表達(dá)融合蛋白，制備作為治療B細(xì)胞淋巴瘤的獨特型融合蛋白疫苗。采用RT-PCR法擴(kuò)增BALB/c小鼠源B細(xì)胞淋巴瘤A20細(xì)胞株的Ig VH和Ig VL

4、基因，重組PCR法用一段編碼 (Gly4Ser)3連接肽的基因序列連接兩基因，制備scFv片段。用相同PCR方法，選用一段編碼NDAQAPKS連接肽的基因序列，連接scFv與MCP-3基因，獲得scFv- MCP-3融合基因片段。定向克隆到原核表達(dá)質(zhì)粒pGLConstruction and Expression of A Prokaryotic Expression Plasmid of Idiotypic Vaccine against B Cell Lymphoma： Encoding the Fusion Genes of Single-Chain Variable Fragment a

5、nd MCP-3Department of Hematology, The Second Hospital; 1Department of molecular biology,  Hebei Medical University, Shijiazhuang 050000, ChinaAbstractThe aim was  to construct a prokaryotic expression plasmid encoding the fusion gene of single-chain variable fragment and monocyte chemotact

6、ic protein-3 (MCP-3). The cDNAs of immunoglobulin (Ig) VH and Ig VL were amplified by RT-PCR and assembled into the single-chain variable fragment（scFv） by recombinant PCR method. The cDNAs of Ig VH and Ig VL were connected by a (Gly4Ser) 3 linker. Then, the fragments of scFv and MCP-3 were connecte

7、d with a NDAQAPKS spacer, using recombinant PCR method again. The results indicated that the fusion gene of scFv-MCP-3 were constructed correctly and cloned into the prokaryotic expression plasmid successfully identified by sequencing and restriction endonucleases examination. Finally, the fusion pr

8、otein was expressed in E coli DH5 under induction by arabinose. And the fusion protein was 65 kD and account for 30% of the total protein of the bacteria. In conclusion, a prokaryotic plasmid, encoding the fusion gene of single-chain variable fragment with MCP-3 and expressing idiotype protein vacci

9、nation against B cell lymphoma, was constructed correctly.Key wordsrecombinant  idiotype vaccine; B cell lymphoma; scFv; monocyte chemotactic protein-3B細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞表面的獨特型膜免疫球蛋白 (smIg) 是一種明確的腫瘤相關(guān)性抗原（tumor associated antigen, TAA），結(jié)合免疫佐劑主動免疫后能誘導(dǎo)抗淋巴瘤腫瘤免疫應(yīng)答。研究表明，單鏈可變區(qū)片段（scFv）可以模擬完整的免疫球蛋白的抗原性, 具有相對分子量小、組

10、織穿透力強、血漿清除快、易于基因改造并可通過細(xì)菌發(fā)酵大量生產(chǎn)等優(yōu)點3 ，有很大的臨床應(yīng)用潛力。本研究中我們以BABL/c小鼠源的B細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞株A20作為模型, 單核細(xì)胞趨化蛋白MCP-3 ( monocyte chemotac-tic  protein -3) 為免疫佐劑，運用抗體工程和基因工程技術(shù)，制備A20細(xì)胞的獨特型smIg的scFv片段，并與同種鼠源的MCP-3基因連接，構(gòu)建原核表達(dá)載體pGLo/scFv- MCP-3，并在大腸桿菌中實現(xiàn)高產(chǎn)量表達(dá)融合蛋白，為進(jìn)一步純化及作為融合蛋白疫苗進(jìn)行主動免疫治療的實驗研究提供了基礎(chǔ)。材料和方法細(xì)胞、質(zhì)粒和菌種源于BALB/c小鼠的

11、B細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞株A20購自美國ATCC。含有BALB/c小鼠源的MCP-3 基因序列的質(zhì)粒為中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院腫瘤研究所胡錦躍教授惠贈。原核表達(dá)質(zhì)粒pGLo及大腸桿菌DH5株為本室保留。酶和主要試劑高糖 DMEM購自美國Gibco公司。FBS為杭州四季青產(chǎn)品。TRIZOL RNA提取試劑盒購自美國Invitrogen公司。Pfu酶、Taq酶、DNA Marker、膠回收純化試劑盒、質(zhì)粒小量抽提試劑盒購自上海生工公司。其它RT-PCR相關(guān)試劑及克隆載體pGEM-T easy為Promega產(chǎn)品。限制性內(nèi)切酶Sac，Kpn、T4連接酶購自TaKaRa公司。引物設(shè)計根據(jù)文獻(xiàn)4報道的A20細(xì)胞Ig

12、VH cDNA序列l(wèi)eader區(qū)與FR4區(qū)，自行設(shè)計引物VH0 5'、VH0   3'，并通過引物設(shè)計軟件Primer 5驗證引物的有效性。Ig VL cDNA 擴(kuò)增引物VL0 5'、VL0 3' 根據(jù)小鼠鏈FR1區(qū)和恒定區(qū)設(shè)計，經(jīng)相同方法驗證有效性。構(gòu)建的重組質(zhì)粒如圖1所示，載體pGLo攜帶有GFP（綠色熒光蛋白）基因，重組的scFv- MCP-3融合基因片段插入到GFP編碼區(qū)的下游，并保持與前者一致的開放性讀碼框。IgVH、IgVL 基因片段由編碼（Gly4Ser）3 的基因序列連接，IgVL與MCP-3基因片段以編碼氨基酸序列為NDAQ

13、APKS的核苷酸序列間隔。GFP和scFv- MCP-3之間設(shè)計a因子蛋白酶識別位點，編碼的核苷酸序列為 ATCGAAGGTCGG。并在每個相對獨立的功能片段前后都設(shè)計了限制性內(nèi)切酶位點，便于基因操作。按重疊延伸PCR（Splicing overlap extension by PCR）引物實驗設(shè)計原理設(shè)計3對引物：VH 5'、VH 3'；VL 5'、VL 3'； MCP-3 5'、 MCP-3 3'。 其中VH 3' 和VL 5'、VL 3' 和MCP-3 5' 為2對用于基因連接的嵌合引物，由linker或sp

14、acer的編碼序列、與模板的互補序列及限制性酶切位點3部分組成。并且在每對嵌合引物5'端為互補區(qū)， 用于重疊延伸PCR 反應(yīng)。 在VH 5'、 MCP-3 3' 引入與載體接頭的Sac和 Kpn限制性內(nèi)切酶切位點，在MCP-3 3' 引物中引入終止密碼子。引物序列見表1。Table 1.  Sequences of primers（略）A20 細(xì)胞株的培養(yǎng)將來源于BALB/c小鼠的B細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞株A20培養(yǎng)于含10% 的胎牛血清、100 U/ml青霉素、100 U/ml鏈霉素的高糖DMEM，置于37、5% CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中，每3-4天傳代1

15、次。培養(yǎng)到對數(shù)生長期收獲細(xì)胞。Ig VH、 Ig VL cDNA擴(kuò)增采用TRIZOL RNA提取試劑盒提取細(xì)胞內(nèi)總RNA，用六核隨機(jī)引物常規(guī)方法反轉(zhuǎn)錄。以cDNA為模板，以VH0 5，VH0 3為引物，選用pfu酶擴(kuò)增Ig VH cDNA。反應(yīng)條件: 94 5分鐘；94 40秒，61 35秒，72 1分鐘，35個循環(huán)后72 10分鐘。2%瓊脂糖電泳檢測后切膠回收目的片段。送大連寶生物公司測序?；厥瘴?10稀釋后作為下步反應(yīng)的模板。以下模板制備方法相同。Ig VL cDNA片段擴(kuò)增反應(yīng)條件相同，擴(kuò)增產(chǎn)物凝膠電泳檢測后回收目的片段，進(jìn)行測序并制備下步反應(yīng)模板。scFv 基因片段的制備用引物VH 5

16、和VH 3、VL 5和VL 3分別對IgVH、IgVL cDNA片段進(jìn)行修飾擴(kuò)增，反應(yīng)條件相同，均為： 94 5分鐘，94 40秒，63 40秒，72 1分鐘，35個循環(huán)后72 10分鐘。制備模板。用等摩爾數(shù)的修飾后的IgVH、 IgVL cDNA為模板，VH 5和VL 3為引物，用重組PCR法，制備scFv。反應(yīng)分兩步：第一步，反應(yīng)體系中未加入引物。反應(yīng)條件： 94 5分鐘；94 1分鐘，63 1分鐘，72 1分鐘，7個循環(huán)。 第二步，加入引物VH 5'和V L 3'。反應(yīng)條件： 94 2分鐘；94 1分鐘，63 1分鐘，72 1分鐘，25 個循環(huán)后72 10分鐘。擴(kuò)增產(chǎn)物凝

17、膠電泳檢測后回收目的片段，進(jìn)行測序并制備下步反應(yīng)模板。MCP-3基因的擴(kuò)增以含有MCP-3 基因序列的質(zhì)粒為模板，分別用引物MCP-3 5' 和MCP-3 3' 擴(kuò)增MCP-3 基因。反應(yīng)條件： 94 5分鐘；94 40秒，63 35秒，72 1分鐘，35個循環(huán)；72 10分鐘。2%瓊脂糖電泳檢測后切膠回收目的片段。制備模板用于下步反應(yīng)。scFv 與MCP-3融合基因片段的制備與克隆以等摩爾量的scFv、MCP-3為模板，以VH 5'、MCP 3'為引物，用重組PCR法分兩步擴(kuò)增MCP-3-scFv融合基因片段。反應(yīng)條件與scFv片段的制備相同。1%瓊脂糖電泳檢測后切膠回收目的DNA片段。用普通Taq酶在擴(kuò)增產(chǎn)物的末端加"A"后, 與T載體連接，實驗操作按Promega T vector systerm說明書進(jìn)行，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)菌DH5，PCR及Sac、Kpn雙酶切鑒定陽性克隆，送大連寶生物公司進(jìn)行測序。篩選出的陽性質(zhì)粒并命名為pGEM / scFv- MCP-3。表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建與表達(dá)經(jīng)測序證實的陽性重組質(zhì)粒pGEM / scFv- MCP-3用Sac、Kpn雙酶切后，回收目的基因片段，然后經(jīng)T4連接酶與同樣處理的表達(dá)質(zhì)粒載體p