山梨獼猴桃根提取物抗腫瘤活性研究

1、山梨獼猴桃根提取物抗腫瘤活性研究                      作者：林國彪，張雯艷，張鳳芬，陳希慧，黃初升，鐘振國【摘要】  目的 從山梨獼猴桃根中篩選抗腫瘤活性成分。方法采用MTT法、細胞集落形成法篩選山梨獼猴桃根提取物的抗腫瘤活性成分。結(jié)果山梨獼猴桃根提取物用集落形成法R6，R8對胃癌細胞株SGC7901、白血病細胞株L1210、神經(jīng)性腫瘤細胞株NG108-1

2、5、肝癌細胞株Bele7404的增殖有抑制作用；用MTT法對NG108-15，SGC7901的增殖有抑制作用。山梨獼猴桃根兩種提取物（R6，R8）對脾淋巴細胞沒有免疫毒性。結(jié)論山梨獼猴桃根提物R6，R8有抗腫瘤活性。 【關鍵詞】  山梨獼猴桃根提取物； 抗腫瘤活性成分篩選； 腫瘤細胞株Abstract：ObjectiveTo screen the anti-tumor active components extracted from roots of A. rufa Planch. MethodsThe anti-tumor activity of the components ex

3、tracted from roots of A. rufa Planch was determined by MTT and clone cells assay.ResultsR6,R8 extracted from roots of A. rufa Planch could restrain the cell proliferation in the stomach carcinoma SGC7901, lymphocytic leukemia L1210,  mouse neuroblastomax rat gliom hybrid NG108-15, and human hep

4、atocellular carcinoma Bele7404 cell strain by clone cells and restrain the cell SGC7901, NG108-15 cell strain by MTT. 2 kinds of extracts (R6, R8) had no immunity toxicity to the lymphocyte in spleen. ConclusionThe results show that R6,R8 extracted from roots of A. rufa Planch have the anti-tumor ac

5、tivity.Key words：The active components extracted from Roots of A. rufa Planch;  Screening of the anti-tumor activie components；  Tumor cell strain    山梨獼猴桃根為獼猴桃科獼猴桃植物Actinidia rufa Planch ex Miq.的根或根皮，產(chǎn)于廣西貧困山區(qū)德保、龍勝等縣，一直作為民間中草藥使用，其根經(jīng)藥理實驗證明，具有抗癌活性1。本課題組成員張鳳芬等2對山梨獼猴桃根醇提物及醇提物的正丁

6、醇提取物的體外抗腫瘤活性進行了研究，確定正丁醇提取物有抗腫瘤活性，我們對正丁醇部位用柱層析分離等方法得37種樣品，其中31種粗提物已在另一篇文章介紹，本文就其中6種提取物（單體），用集落形成法研究其對白血病細胞株L1210、人胃癌細胞株SGC7901、神經(jīng)性腫瘤細胞株、人肝癌細胞株Hela7404細胞增殖的抑制作用；用MTT法研究提取物對SGC7901和NG108-15細胞的增殖的抑制作用，并對有抗腫瘤活性的提取物對正常小鼠脾淋巴細胞進行細胞毒實驗?，F(xiàn)報道如下。1  器材1.1  山梨獼猴桃根提取物為山梨獼猴桃根提取的乙醇浸膏的正丁醇溶解部分通過柱層析分離等方法得6種單體(

7、以下以R1R13或代試物表示) 。用蒸餾水溶解后無菌過濾備用。1.2  腫瘤細胞株白血病細胞株L1210、人胃癌細胞株SGC7901、神經(jīng)腫瘤細胞株NG108 -15 等均購自上海細胞生物研究所細胞庫,人肝癌細胞株Hela7404由廣西醫(yī)科大學藥理教研室提供。1.3  試劑MTT(四甲基噻唑藍) 為德國Sigma公司產(chǎn)品，批號020609；FBS(胚胎牛血清) 為美國Hyclone公司產(chǎn)品，批號0405；RPMI1640和DMEM培養(yǎng)基為美國GIBCO公司產(chǎn)品，批號1120708 和0311；Trypsin(胰蛋白酶)由天津市灝洋生物制品有限責任公司提供，批號200503；

8、DMSO(二甲基亞砜)由天津匯英化學試劑有限公司提供，批號20030526；Wrights stain(瑞氏色素)購自上海三愛思試劑有限公司，批號20011026；Giemsas stain(吉氏染色素)購自上海試劑三廠，批號20000324。ConA(刀豆蛋白A) Sigma(進口分裝) 購自廣州達新生物技術開發(fā)有限公司 批號：0504。LPS(大腸桿菌脂多糖) Sigma(進口分裝) 購自廣州達新生物技術開發(fā)有限公司，批號0406。1.4  儀器CO2 培養(yǎng)箱(Thermo Forma)，美國產(chǎn)，型號381；倒置顯微鏡(Olympus)，日本產(chǎn)，型號CK40；酶標儀(Biocel

9、l)，澳地利產(chǎn)，型號Sunrise。2  方法32.1  MTT 法測定在96孔培養(yǎng)板（NUNC）中每孔加入200l（含有5 000個/ ml腫瘤細胞）10%FBS RPMI1640（NG108用DMEM）培養(yǎng)液，置CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，實驗組分別加入樣品，對照組則加入等體積溶劑，每組4孔。置CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)5 d后，棄去上清液（L1210離心處理），加入200 l/孔新鮮配制的含0.2 mg/ml MTT的無血清培養(yǎng)液，37繼續(xù)培養(yǎng)4 h。棄上清液，加入200 l，振蕩混勻后，用酶標儀（波長為570nm，參比波長為450nm）測定OD值。重復4次。結(jié)果。按下式計算

10、藥物對腫瘤細胞生長的抑制率:    腫瘤細胞生長抑制率（%）=（1-實驗組平均OD值對照平均OD值）×%2.2  集落形成法采用SGC 7901，NG 108-15，Bele 7404，L1210四株腫瘤細胞株。其中L1210用半固體軟瓊脂集落培養(yǎng)法，取35 mm培養(yǎng)皿，4個為一組，實驗組分別加入代試物，對照組加入等體積的培養(yǎng)液，進行相應的處理。蓋上培養(yǎng)皿蓋，置3710%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)7 d，在16×的顯微鏡下計數(shù)直徑大于75 m(50個細胞以上)的集落。其余3種腫瘤細胞株用貼壁法，用10% FBS RPMI1640 培養(yǎng)液配成含5

11、00個/ ml 細胞懸液，每皿加2 ml。實驗組分別加入代試物，對照組加入等體積的培養(yǎng)液。置3710%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)7 d，棄去培養(yǎng)液，用瑞氏-吉姆薩染色后計數(shù)含50個細胞以上的細胞集落數(shù)。重復4次。按下式計算集落形成率：1         集落形成率（%）=克隆數(shù)/接種細胞數(shù)×100%4 2.3  對小鼠脾臟淋巴細胞增殖反應的影響52.3.1  脾臟淋巴細胞的制備頸椎脫臼處死昆明種小鼠，用75%的酒精浸泡5 min，無菌操作取出脾臟，在RPMI 1640液中將脾臟剪碎成12 mm3

12、小塊，用0.2%的胰酶37消化制成單個細胞懸液，用含10%小牛血清RPMI 1640完全培養(yǎng)基制成3×106/ml的脾細胞懸液。2.3.2  脾臟淋巴細胞增殖活性的檢測將懸液以160 l/孔加入培養(yǎng)板中。在脾細胞的培養(yǎng)板中分別加入T、B淋巴細胞增殖的刺激因子Con A和LPS，每孔20 l。待測樣品每孔加20 l，每組4平行孔，培養(yǎng)板在37含5%CO2的培養(yǎng)箱中孵育48 h后，用MTT法測定T、B淋巴細胞增殖的活細胞數(shù)。MTT測定方法同。3  結(jié)果3.1  MTT法 本實驗是在本課題組成員張鳳芬等的實驗基礎上，對山梨獼猴桃根正丁醇提取物進行再提

13、取，得6種單體（分別為C1C13，其中R2，R3，R7，R9，R10，R11，R12標本量太少）。在0.0051g/ml的范圍內(nèi)，對SGC7901，NG108-15腫瘤細胞株增殖的影響，山梨獼猴桃根6種提取物對SGC7901，NG108-15細胞增殖的影響見表1。表1  山梨獼猴桃根6種單體對SGC7901、NG108-15細胞抑制的影響（略）    從表1可以看出，在0.0051 g/ml的范圍內(nèi)，R6，R8兩種單體對SGC7901腫瘤細胞株的抑制率均大于50且IC50小于30 g/ml，抑制率分別為86.43，93.23，IC50分別為25.4，25

14、.4 g/ml，有強的細胞毒性；其余4種對SGC7901腫瘤細胞株的抑制率均小于50且IC50大于30 g/ml，有較弱的細胞毒性。R6、R8兩種單體對NG108-15腫瘤細胞株的抑制率均大于50且IC50小于30 g/ml，抑制率分別為99.85，87.1，IC50分別為22，29.6 g/ml，有強的細胞毒性；其余4種對NG108-15腫瘤細胞株的抑制率均小于50且IC50大于30 g/ml，有較弱的細胞毒性。3.2  集落形成法實驗中，先選取山梨獼猴桃根兩種正丁醇再提取物進行再篩，為進一步驗證，對其中增殖抑制率大于50，IC50小于30 g/ml且對兩個細胞株有作用的山梨獼猴桃

15、根2單體（R6，R8），用4株腫瘤細胞株NG108-15，Bele7404，L1210，SGC7901用集落形成法進行再篩選。結(jié)果見表23。表2  兩種單體對4種腫瘤細胞增殖的集落形成率的影響（略） 表3  兩種單體對4種腫瘤細胞增殖的抑制率（略）     從表23可以看出，山梨獼猴桃根提取物山R6，R8對SGC7901細胞集落形成率分別為28.39，28.89，與陰性對照組比較，有顯著性差異（P<0.01）；對NG108-15細胞集落形成率分別為28.36，30.25，與陰性對照組比較，有顯著性差異（P<0.01）；對B

16、ele7404細胞集落形成率分別為27.42，28.97，與陰性對照組比較，有顯著性差異（P<0.01）；對L1210細胞集落形成率分別為26.42，27.64，與陰性對照組比較，有顯著性差異（P<0.01）。其中R6對4株腫瘤細胞的增殖抑制率都大于50%；R8對SGC7901增殖抑制率為49.17外，對其余3株腫瘤細胞的增殖抑制率均大于50%。集落形成法的結(jié)果顯示，各組腫瘤細胞的集落形成率跟陰性對照組相比較P<0.01，表明山梨獼猴桃根正丁醇的再提物對SGC7901，NG108-15，Bele7404，L1210腫瘤細胞株集落形成有抑制作用。所得結(jié)果與MTT法結(jié)果相吻合。3

17、.3  2種單體對小鼠脾臟T、B淋巴細胞增殖反應的影響從6種單體中篩選出對4種腫瘤細胞株增殖的抑制的作用較強、抑瘤譜較廣的R6，R8，并對它們進行對正常免疫細胞增殖影響的測試。將小鼠脾臟細胞用有絲分裂原ConA、LPS刺激后，分別加入不同濃度的R6，R8，檢測其對小鼠T、B淋巴細胞增殖的影響。結(jié)果見表4。表4  山梨獼猴桃根兩種單體對脾細胞增殖的影響（略）    從表4可以看出，山梨獼猴桃根提取物R6、R8對小鼠脾臟T淋巴細胞增殖IC50分別為172.7，193.4 g/ml，抑制率均小于50。山梨獼猴桃根提取物R6，R8對小鼠脾臟B淋巴細胞增

18、殖IC50分別為144.3，121.4 g/ml，抑制率均小于50。4  討論    廣西是我國中草藥資源和品種最豐富的省份之一。據(jù)民間藥方和記載6，廣西一些特產(chǎn)及珍稀中草藥具有抗癌功效，如獼猴桃根常以單方形式用于鼻咽癌、骨癌、肝癌、乳腺癌等多種癌癥疾病。因此，有必要對地方特產(chǎn)的具有抗癌活性的中草藥植物，在系統(tǒng)的抗癌藥理研究的配合下，開展有效活性成分的研究。在篩選思路上結(jié)合美國國立癌癥研究院（NCI）針對疾病的篩選思路和模式，先用較為敏感的細胞株進行初篩，繼而對初篩中活性較強的提取物用多株細胞株進行擴大篩選，最后用小鼠脾淋巴細胞對抗腫瘤活性強、抗瘤譜廣的提取物進行了免疫毒性測試。本研究對活性化合物的篩選時，也對其免疫毒性進行評價。刀豆蛋白A (ConA)主要是作用于T淋巴細胞引起細胞增殖轉(zhuǎn)化,而大腸桿菌脂多糖(LPS)主要引起B(yǎng)淋巴細胞的活化7。本研究通過用ConA，LPS誘導脾T，B淋巴細胞的增殖對擴大篩選中抗腫瘤活性高，抗瘤譜廣的R6，R8進行檢測。結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩種提取物在0.05 g/l的濃度下，對脾T、B淋巴細胞的增殖IC50均大于30 g