粉防己堿對炎癥白細(xì)胞游出及前列腺素與白三烯合成的影響

1、    粉防己堿對炎癥白細(xì)胞游出及前列腺素與白三烯合成的影響        摘要目的：觀察粉防己堿(Tet)的抗炎作用及其作用機(jī)制。方法：應(yīng)用實(shí)驗性胸膜炎模型觀察滲液量和中性粒細(xì)胞(Neu)數(shù)，用福林-酚法測定蛋白含量，用高效液相色譜法測定白三烯B4(LTB4)，用放射免疫法測定前列腺素E2 (PGE2)。結(jié)果：在角叉菜膠(Car)所致大鼠胸膜炎模型，Tet劑量依賴性地減少滲液量以及單位滲液的Neu含量，但對單位滲液的蛋白含量無明顯影響。地塞米松（Dex）和吲哚美辛（Ind）

2、也有類似的抗炎作用。Tet和Dex明顯地降低LTB4與PGE2的合成，但是Ind僅減少PGE2生成。結(jié)論：Tet通過抑制Neu游出，降低血管通透性發(fā)揮抗炎作用，它的作用機(jī)制與環(huán)氧酶抑制劑Ind不同，而與Dex相似，可能與抑制磷脂酶A2 (PLA2)活性有關(guān)。關(guān)鍵詞粉防己堿;中性粒細(xì)胞;前列腺素E2;白三烯B4中分類號R963 EFFECTS OF TETRANDRINE ON NEUTROPHIL EMIGRATION AND SYNTHESIS OF LTB4 AND PGE2Li Xinfang(Dept of Clinical Pharmacy,Bethune International

3、 Peace Hospital,Shijiazhuang050082)Lu Jinsheng，Zhang Lezhi，Zhang Min，Huang Yuehua(Dept of Pharmacol,Third military Medical College,Chongqing400038)AbstractAIM The anti-inflammatory action of Tetrandrine(Tet) and the mechanism were investigated in this study.METHODS Experimental pleuritis of rats was

4、 used.The neutrophil amount and protein content of the pleural exudate were measured by routine method and Folin-phenol assay respectively.Leukotriene B4(LTB4) and prostaglandin E2(PGE2) synthesized by Neu were determined by HPLC or RIA.RESULTS In rat pleuritis induced by carrageenan,Tet reduced exu

5、date volume and Neu count per litre in exudate in a dose-dependent manner,but protein content per litre in exudate is not reduced. Dexamethasone(Dex) and indomethacin (Ind) also inhibited inflammatory reaction.Tet and Dex markedly inhibited LTB4 and PGE2 synthesis that induced by Neu, but Ind only r

6、educed PGE2 levels.COCLUSION The anti-inflammatory action of Tet was produced by inhibiting Neu emigration and lowering permeability of capillaries,which is different from cyclooxygenase inhibitor Ind.Tet,like Dex,could producing anti-inflammatory action through inhibiting activity of phospholipase

7、A2(PLA2)Key wordsTetrandrine;Neutrophil;Leukotriene B4;Prostaglandin E2研究發(fā)現(xiàn)粉防己堿(tetradrine,Tet)對多種炎癥模型具有抗炎作用1。在角叉菜膠（carrageenan,Car）致大鼠背部氣囊炎癥模型中，Tet能抑制中性粒細(xì)胞(neutrophil,Neu)游出，-葡萄糖醛酸酶的釋放和氧自由基的生成2、3。在體外能抑制A23187誘導(dǎo)的兔Neu合成白三烯B4(leukotrine B4)和血栓素A2 (thromboxane A2, TXA2)4。本研究在Car致大鼠胸膜炎模型，觀察Tet對炎癥滲出液中WBC

8、計數(shù)、蛋白含量以及滲出的Neu合成LTB4及PGE2的影響，并與消炎痛(indomethacin,Ind)和地塞米松(dexamethasone,Dex)的作用比較，探討Tet的抗炎作用機(jī)制。1材料與方法1.1動物Wistar大鼠，150g±20g，(第三軍醫(yī)大學(xué)動物所供給，醫(yī)動字24301050號）。1.2藥品Tet(浙江金華制藥廠產(chǎn)品，批號 921206)，Car(遼寧藥物研究所)，Ind(石家莊第一制藥廠產(chǎn)品，批號 911204)，Dex(天津華津制藥廠，批號 910805)，用生理鹽水配成所需要的濃度。LTB4標(biāo)準(zhǔn)品(英國倫敦大學(xué)醫(yī)學(xué)院供給)，前列腺素B2(PGB2)(Sig

9、ma產(chǎn)品)。PGE2的放射免疫測定盒(購自解放軍總醫(yī)院)。 Percoll液(華美生物工程公司進(jìn)口分裝)。其余試劑均為分析純。1.3儀器高效液相色譜系統(tǒng)，M116雙波長紫外檢測器(法國Gilson公司)；FJ-2107液體閃爍計數(shù)儀(西安262廠)；7510分光光度計(上海第三分析儀器廠)。1.4方法1.4.1將大鼠隨機(jī)分為Car致炎對照組、Tet20、40、80mg.kg-1和Ind5mg.kg-1、Dex5mg.kg-1給藥組，每組8只大鼠。給藥各組于致炎前ig不同藥物，對照組則給予等容量的生理鹽水，給藥30min后ip3%戊巴比妥納麻醉，并立即于右側(cè)胸腔注入1%Car25mg.kg-1，

10、觀察藥物在給藥后不同時間的抗炎作用，并在給藥4h后觀察它們對Neu合成LTB4和PGE2的影響。1.4.2Neu的分離與純化將市售Percoll液按要求配制成應(yīng)用原液，再將其分別配制成d=1.070和d=1.090的Percoll分層液。利用分層液將炎癥滲出液5ml，2500rpm×20min離心后取粒細(xì)胞層，無鈣鎂HBSS洗滌一次，重懸在該緩沖液中。計數(shù)所得細(xì)胞，Neu純度90%，臺盼蘭染色檢查活力95%，調(diào)整Neu懸液的細(xì)胞數(shù)目，Neu為5×106cell.ml-1備用。1.4.3LTB4的生成與測定取上述Neu細(xì)胞懸液1ml，參照文獻(xiàn)5的方法孵育，提取，氮?dú)獯蹈珊笥眉?/p>

11、醇復(fù)溶，取10l迸樣。測定條件：分析型色譜柱(0.46m ×250mn)，固定相ODS-C181Om；流動相甲醇-水-乙酸(80:20:0.2)，用NH4OH調(diào)pH至5.7；流速0.5ml.min-1；檢測波長280nm；回收率PGB2為90.95±4.25%(CV4.67%，n=5)，LTB4為85.22±3.99%(CV4.68%，n=5)1.4.4PGE2的測定取上述白細(xì)胞備用液1ml，參照文獻(xiàn)6的方法溫育、提取，將提取的有機(jī)相，用氮?dú)獯蹈桑?35保存。測定前樣品用pH7.4的磷酸緩沖液復(fù)溶后，用放射免疫法測定PGE2。1.4.5數(shù)據(jù)處理結(jié)果用±s

12、表示，并用雙尾t檢驗統(tǒng)計分析，劑量依賴性采用相關(guān)分析。2結(jié)果2.1角叉萊膠致炎后滲液中WBC的動態(tài)變化及Tet的影響Car致炎后胸腔滲液中WBC隨時間而增加，Tet在2、4h呈劑量依賴性的抑制WBC游出(r分別為-0.9832和-0.9650)，在4h時各劑量組與對照組相比均有統(tǒng)計學(xué)意義。Dex和Ind對WBC游出也有明顯的抑制作用,見表1。表1Tet Ind和Dex對Car致炎后4h內(nèi)胸腔滲液中WBC動態(tài)變化的影響(±s,n=8)組別劑量(mg.kg-1)白細(xì)胞(×109.L-1) 1h2h4h生理鹽水組13.5±7.331.3±20.889.3

13、77;23.9Tet組2010.8±5.68.5±13.854.9±28.6b4014.1±9.214.8±14.051.3±21.9c808.6±3.912.9±2.8b41.3±17.6dInd組59.5±4.211.2±4.4b28.4±23.2dDex組57.4±4.910.9±4.9b22.8±12.6d注：與生理鹽水對照組比較，bP<0.05，cP<0.01，dP<0.001 2.2Tet對Car致炎后4h胸腔滲液量

14、、蛋白含量及白細(xì)胞數(shù)的影響Car致炎后4h，大鼠胸腔滲液量達(dá)3.2±0.9ml.rat-1，Tet 20、40、80mg.kg-1呈劑量依賴性地減少滲液量(r=0.999 9)，從表2我們還可觀察到單位滲液中的WBC數(shù)也呈劑量依賴性地減少(r=0.965 0)，而單位滲液中的蛋白含量沒有明顯變化。Ind 5mg.kg-1和Dex 5mg.kg-1也明顯減少滲液量和單位滲液中的WBC數(shù)，見表2。表2Tet Ind和Dex對Car致炎后4h胸腔滲液量蛋白含量及白細(xì)胞數(shù)的影響(±s,n=8）組別劑量(mg.kg-1)滲液量(ml.rat-1)蛋白量(g.L-1)白細(xì)胞(×

15、;109.L-1)生理鹽水組3.2±0.989.2±19.389.3±24.0Tet組202.4±0.885.3±14.454.9±28.6b402.2±0.7b81.3±11.251.3±21.9c802.0±0.8b83.4±14.541.3±17.6dInd51.3±0.6d83.5±15.428.4±23.2dDex50.7±0.7d82.6±14.322.8±12.6d注：與生理鹽水對照組比較，bP<

16、0.05;cP<0.01;dP<0.001 2.3Tet對Car致炎后4h Neu生成LTB4和PGE2的影響Tet 20、40、80mg.kg-1呈劑量依賴性地減少Neu生成LTB4與PGE2（r分別為-0.972 6和-0.982 1）；Dex 5mg.kg-1也減少Neu生成LTB4和PGE2；Ind 5mg.kg-1僅減少PGE2生成，對LTB4的生成沒有明顯影響，見表3。表3Tet Ind和Dex對Car致炎后4h Neu生成LTB4和PGE2的影響(±s,n=8)組別劑量mg.kg-1LTB4(ng.L-1×106)PGE2(pg.L-1×

17、106)生理鹽水組26.82±10.2191.5±13.4Tet組2018.34±8.4172.3±11.2c4013.07±6.96c68.7±12.5c8010.86±4.99c62.6±9.8dInd組518.94±7.1459.2±11.5dDex組59.10±3.45d57.5±9.6d注：與生理鹽水對照組比較，cP<0.01，dP<0.001 3討論3.1Car致炎后胸腔滲液中的WBC隨時間而增加，各藥物在各時間點(diǎn)均有減少WBC游出的趨勢，但到致炎后4

18、h，Tet各劑量組滲液中的WBC減少與對照組相比才具有明顯的統(tǒng)計學(xué)意義。因此我們在Car致炎后4h觀察炎癥各種指標(biāo)的變化。3.2Tet 20、40、80mg.kg-1呈劑量依賴性減少Car致大鼠胸膜炎的滲出液量，表明該藥有降低炎癥部位血管通透性和炎癥滲出的作用。Neu介導(dǎo)的組織損傷是急性炎癥引起組織損傷的主要原因，在心、腦梗塞損傷中起重要作用7、8。游走至靶組織的Neu被活化，通過與內(nèi)皮細(xì)胞黏附、呼吸爆炸和花生四烯酸代謝，釋放氧自由基和炎癥介質(zhì)，加重炎癥反應(yīng)和組織損傷7、9。Tet在減少滲出液量的同時，也減少單位滲液中的Neu數(shù)，表明Tet的抗炎作用是通過抑制Neu的功能而實(shí)現(xiàn)的。由表2可以看

19、出，Tet能減少滲出液量和單位滲液中的Neu數(shù)，但對單位滲液中的蛋白含量無明顯影響，表明在炎癥過程中，Neu游出是一個主動過程，從而造成血管通透性增加，而蛋白的滲出只是血管通透性增加的結(jié)果。在ip Car所致的大鼠腹膜炎模型，血漿蛋白滲出量隨循環(huán)的Neu被氮芥或60 Co耗竭 而減少10，與我們的實(shí)驗結(jié)果相一致。值得說明的是以往的研究多采取向滲液中加入等量生理鹽水，使?jié)B液不成比例地稀釋10、11，從而造成滲液越少蛋白含量越低、滲液越多蛋白含量越高的假象，與本實(shí)驗對單位滲液中的蛋白含量無明顯影響不同。Ind 5mg.kg-1和Dex 5mg.kg-1也有類似的抗炎作用。3.3細(xì)胞膜磷脂經(jīng)PLA2

20、作用釋放花生四烯酸(arachidonic acid,AA),AA經(jīng)環(huán)氧酶和脂氧酶兩條途徑代謝成PGs和LTs，其中PGE2可增加血管通透性12，LTB4可致白細(xì)胞趨化、聚集、脫顆粒和產(chǎn)生超氧陰離子13，引起和加重炎癥反應(yīng)。表3的結(jié)果還表明,Tet既抑制PGE2的合成，又抑制LTB4的合成，具有較好的抗炎作用。環(huán)氧酶抑制劑Ind僅抑制PGE2的合成。Dex減少PGE2和LTB4的生成，Tet與Dex的作用相類似。已知Dex通過脂皮素抑制PLA2活性，從而對花生四烯酸的環(huán)氧酶、脂氧酶兩條代謝途徑均有抑制作用14，推測Tet對PLA2有抑制作用。Tet對血小板活化因子15和鈣調(diào)素16的抑制作用支持

21、了這種推測，因為血小板活化因子也為PLA2作用于細(xì)胞膜磷脂的產(chǎn)物14，而PLA2的激活需要鈣調(diào)素。注：國家自然科學(xué)基金資助項目No.38970906作者簡介：李新芳，男，醫(yī)學(xué)碩士，主任藥師。碩士研究生導(dǎo)師，河北省藥理學(xué)會副理事長。作者單位：李新芳（中國人民解放軍白求恩國際和平醫(yī)院藥劑科石家莊050082）呂金勝，張樂之，張敏，黃鉞華（中國人民解放軍第三軍醫(yī)大學(xué)藥理教研室重慶400038）參考文獻(xiàn)：1張樂之，李新芳，呂金勝等.粉防己堿的抗炎作用.中藥藥理與臨床，1992;11(增刊)：382何風(fēng)慈，唐汝愚，姚丹帆.粉防己堿對炎癥血管通透性和嗜中性白細(xì)胞功能的影響.中國藥理學(xué)報，1989;10（3

22、）:2493何風(fēng)慈，唐汝愚，姚丹帆.粉防己堿抑制中性粒細(xì)胞溶酶體酶釋放與鈣的關(guān)系.中國藥理學(xué)通報,1990；12（4）：2214杜澤英，黃鉞華.粉防己堿對兔多形核白細(xì)胞花生四烯酸代謝的影響.第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報,1990；12（4）:295朱秀媛，程桂芳.抗炎及抗過敏實(shí)驗方法與技術(shù).見張均田.現(xiàn)代藥理實(shí)驗方法(下冊).北京醫(yī)科大學(xué)中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)聯(lián)合出版社,北京：1998；13826Chang JX,Duan Jh Han FY，et al.Radioimmunoassay For Prostaglandin E2 (PGE2).Acta Acod Med Sin,1987;9:2297李新芳,唐汝愚.白細(xì)胞在炎癥滲出和組織損傷中的作用及藥物防治.見周金黃.免疫藥理學(xué)進(jìn)展.第一版.中國科學(xué)技術(shù)出版社，北京:1993;5158江濤，戴黎萌，載欽舜.白細(xì)胞、巨噬細(xì)胞與缺血再灌流后繼發(fā)腦損傷.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床，199