第三代腺病毒載體重組構(gòu)建的優(yōu)化

1、摘要】 第三代腺病毒載體以其高容量、長時間轉(zhuǎn)基因表達(dá)及低毒性和低免疫原性的優(yōu)點已經(jīng)廣泛應(yīng)用于基因治療中，目前這種病毒載體的重組構(gòu)建已經(jīng)有許多優(yōu)化和改進(jìn)。 【關(guān)鍵詞】 第三代腺病毒；重組構(gòu)建；優(yōu)化 隨著腺病毒載體的研發(fā)深入，第三代腺病毒載體已經(jīng)克服了前兩代的一些不足，以其高容量、能夠長時間轉(zhuǎn)基因表達(dá)以及低毒性和低免疫原性的優(yōu)點被廣泛應(yīng)用于基因治療的研究。然而，重組構(gòu)建第三代腺病毒載體費工費時，難以大規(guī)模生產(chǎn)，為了改變這種狀況，近年來已經(jīng)研發(fā)出許多優(yōu)化的方案，本文就此予以綜述。一腺病毒的基本結(jié)構(gòu) 腺病毒是無包膜病毒， 它的基因組為線形雙鏈DNA， 長度約為36 kb， 被一個二十面體的蛋白質(zhì)外殼所

2、包裹。腺病毒基因組有編碼區(qū)和非編碼區(qū)兩部分。在編碼區(qū)，根據(jù)DNA復(fù)制周期的不同分為早期基因區(qū)和晚期基因區(qū)， 前者有E1E4區(qū)， 主要編碼病毒的調(diào)節(jié)蛋白。后者分為L1L5五個區(qū)， 編碼病毒的結(jié)構(gòu)蛋白。早期表達(dá)的調(diào)節(jié)蛋白可以調(diào)控晚期基因的表達(dá)。最先表達(dá)的是E1基因，它所表達(dá)的蛋白(包括E2產(chǎn)物) 是腺病毒基因組復(fù)制、病毒包裝和其他蛋白表達(dá)翻譯所必需的， 但其對細(xì)胞的毒性也很強(qiáng)。在非編碼區(qū)， 腺病毒雙側(cè)末端各含有一小段約100bp的末端反向重復(fù)序列(ITR)。ITR含有病毒進(jìn)行復(fù)制和包裝所必需的順式作用元件及DNA復(fù)制起始點， 它是病毒DNA復(fù)制所必需的， 其內(nèi)側(cè)為病毒包裝信號()(圖1)。二前兩代

3、腺病毒載體的重組構(gòu)建 第一代腺病毒載體是由去除腺病毒基因組的E1和(或)E3區(qū)而獲得(圖1)。它可以插入6.5kb的外源基因，去除E1阻止了依賴E1和E2區(qū)功能蛋白的轉(zhuǎn)錄和隨后病毒DNA 復(fù)制及病毒殼體蛋白的產(chǎn)生，但是其增殖必須在能夠反式提供E1區(qū)表達(dá)蛋白的感受態(tài)細(xì)胞中完成。目前可以提供E1區(qū)表達(dá)產(chǎn)物的細(xì)胞株有：293，911，N52.E6和PER.C6。第一代腺病毒載體的優(yōu)點有：在體外的生產(chǎn)效價很高，易感的宿主細(xì)胞范圍廣，病毒基因組整合于細(xì)胞染色體外，可以避免插入誘變的可能。然而盡管這種腺病毒載體不能在活體內(nèi)復(fù)制，但由于許多感受態(tài)細(xì)胞都含有允許E2基因表達(dá)的E1樣蛋白， 即使其表達(dá)量很低，

4、仍可增強(qiáng)病毒DNA 復(fù)制、晚期結(jié)構(gòu)蛋白合成及可復(fù)制腺病毒(RCA)的產(chǎn)生，激活細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)對受感染細(xì)胞的免疫反應(yīng)，從而最終導(dǎo)致轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞被消除， 使治療基因表達(dá)失敗2。 為解決第一代病毒載體生產(chǎn)中出現(xiàn)的問題，并提高插入基因的量，根據(jù)RCA 的產(chǎn)生機(jī)制，如腺病毒載體有多處缺失可以降低RCA出現(xiàn)機(jī)率，減少宿主的免疫反應(yīng)性，利于載體的長期和重復(fù)應(yīng)用，研究者將不同的早期基因如E1E3或E2/E4去除，研制生成第二代腺病毒載體(圖1)，構(gòu)建出E1E3和E4 區(qū)雙缺失載體(E1E4)以及E1E3和E2區(qū)雙缺失載體(E1E2)3。由于早期基因區(qū)的缺失，載體便可容納14kb的基因序列，擴(kuò)大了載體

5、的克隆能力。然而，與第一代腺病毒載體相比，第二代腺病毒仍然不能避免殘余病毒基因表達(dá)物在體內(nèi)的免疫反應(yīng)和細(xì)胞毒性，并且它從頭合成蛋白的能力也會受到抑制。不過E1E2 載體延長了基因的表達(dá)時間4。三第三代腺病毒載體的重組構(gòu)建及優(yōu)化 1第三代腺病毒載體的概況 第三代腺病毒，也稱為裸腺病毒(Gutless adenovirus)。由于它去除了所有病毒編碼基因，僅保留了5和3末端反向重復(fù)序列(ITR)與野生型腺病毒的包裝信號()(圖1)，需要輔助病毒提供編碼序列，所以也稱輔助病毒依賴性腺病毒(helper-dependent adenoviral vectors)。因為其具有可以容納36kbDNA的超大

6、容量，也有人將其稱為高容量腺病毒(High-Capacity Gutless Adenoviral Vectors)。 重組構(gòu)建第三代腺病毒載體需要三個部分，分別是第三代腺病毒載體(構(gòu)建攜帶目的基因載體的成分)，輔助病毒(反式提供病毒復(fù)制包裝等功能)和感受態(tài)細(xì)胞株(病毒包裝的場所)。由于載體殼體的包裝僅僅需要整個腺病毒基因組的75-105%即可完成，而作為治療表達(dá)基因的殼體通常不到36kb，所以為了完成基因組大小的殼體化，還必須借助填充片段DNA(stuffer DNA)。最初stuffer DNA被認(rèn)為只參與了病毒基因載體的包裝，主要有-噬菌體、酵母、細(xì)菌和非人源DNA5。目前研究發(fā)現(xiàn)使用包

7、含基質(zhì)附著區(qū)(MAR)元素的次黃嘌呤磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶基因(HPRT)內(nèi)含子序列作為stuffer DNA可以提高DNA的穩(wěn)定性，且不會引起免疫反應(yīng)，并且MAR還可使腺病毒基因組穩(wěn)定進(jìn)入細(xì)胞核，從而延長基因的表達(dá)時間，所以值得推薦6。 2第三代腺病毒載體的重組構(gòu)建 由于第三代腺病毒去除了所有編碼基因和基因組復(fù)制所需的蛋白，所以殼體的生成和包裝均需反向提供。這就需要第三代腺病毒與輔助病毒同時感染，但由于輔助病毒和第三代腺病毒具有相同的殼體，所以在純化前必須將兩者分離，并盡量減少輔助基因組自身的包裝效率。可通過使包裝信號突變，利用基因組不同大小使其過大或過小而不能有效包裝，以及載體生產(chǎn)過程中將輔助病

8、毒的包裝信號特異性消除等方法實現(xiàn)7-9。早期利用含有不完全包裝信號的依賴輔助腺病毒，雖基因組序列廣泛被刪除，但仍具有一些編碼序列7。使用野生型腺病毒作為輔助病毒與第三代腺病毒共同轉(zhuǎn)染使兩種病毒都被繁殖，在幾代之后，使用氯化銫密度梯度方法進(jìn)行第三代腺病毒的純化，但是輔助病毒和兩種病毒的多種重組序列都可以被檢出。這樣大規(guī)模生產(chǎn)和純化就存在嚴(yán)重的不足，所以出現(xiàn)了一系列優(yōu)化方法。 (1) Cre-loxP重組系統(tǒng) 使用Cre重組酶將包裝信號特異性除去是重要改進(jìn)。Parks等9提出在輔助病毒的包裝信號兩側(cè)各插入一個loxP位點，擴(kuò)增在Cre重組酶表達(dá)細(xì)胞株(293Cre)中進(jìn)行。當(dāng)輔助病毒進(jìn)入細(xì)胞后，它

9、的包裝信號便被切斷從而阻止它的基因組進(jìn)入到病毒顆粒中，但保留了生產(chǎn)第三代腺病毒所需重要蛋白的所有編碼序列。利用這一方法只能將輔助病毒污染控制在0.1-10%的水平，可能是由于重組酶的活力較低和內(nèi)源性較差導(dǎo)致消除包裝信號的效率較低； 也可能是由于腺病毒引起宿主細(xì)胞關(guān)閉或Cre重組酶較高的細(xì)胞毒性所致。盡管輔助病毒污染率較低，但是輔助病毒引起的潛在細(xì)胞毒性仍值得注意，尤其在需要大劑量輔助病毒時10。Palmer7對Cre-loxP系統(tǒng)進(jìn)行了改進(jìn)，為了避免在第三代腺病毒載體重組過程中具有RCA的生成，將輔助病毒包裝信號進(jìn)行逆轉(zhuǎn)，使輔助病毒污染率降低至0.02-0.1%。 (2) FLP- frt 重

10、組系統(tǒng) FLP重組酶是酵母特異性位點重組酶，可以剪切包裝蛋白。Philip等11研發(fā)出新型的FLP表達(dá)細(xì)胞株(239FLP和239CreFLP)，并在輔助病毒包裝信號兩側(cè)加入了frt位點，構(gòu)成FLP-frt重組系統(tǒng)。據(jù)報道12FLP 重組酶對DNA 的剪切效率接近100%，而Cre 重組酶的只能達(dá)到80%，所以使用FLP-frt 系統(tǒng)可能優(yōu)于Cre-LoxP系統(tǒng)。Umana13對FLP-frt系統(tǒng)進(jìn)一步改進(jìn)，發(fā)現(xiàn)應(yīng)用色譜純化技術(shù)可以大批量生產(chǎn)出第三代腺病毒載體，并且不需要傳統(tǒng)的氯化銫梯度離心法純化即可得到高效價的病毒載體。然而，Cre和FLP是刪除包裝信號的雙向重組酶，它們還可使包裝信號再次表

11、達(dá)，增加輔助病毒污染率，提高它們的刪除能力也會增加反向的作用，所以必須使用單向重組酶14。 (3) C31-attB/attP重組系統(tǒng) Alba14提出使用單向重組酶，C31便是減低輔助病毒污染率的另一個重組酶，由于它能夠識別attB/attP的同源染色體序列，所以也具有293細(xì)胞株Cre同樣的剪切能力。當(dāng)C31切去包裝信號兩側(cè)插入的attB/attP序列時，便可得到attR/attL而阻止反向重組，所以蘊(yùn)含有attB/attP包裹包裝信號的輔助病毒可能會引出一個新的第三代腺病毒生成系統(tǒng)。 (4) 容量限制型蛋白IX缺失輔助細(xì)胞 Sargent等8利用腺病毒包裝容量的限制來降低輔助病毒的污染率

12、。因為重組腺病毒基因組長度在野生型腺病毒的75-105%之間時才能夠被包裝形成病毒顆粒，超出這一范圍腺病毒基因就會發(fā)生重排，使最終基因長度維持在2737.8%，所以推測殼體蛋白的不穩(wěn)定是限制外基因發(fā)生重排的主要原因。IX蛋白(pIX)參與腺病毒殼體的穩(wěn)定，在包裝全長病毒基因組中起著重要作用。當(dāng)腺病毒缺失pIX時，它的殼體就會變得對熱敏感而不穩(wěn)定，包裝容量降低至35kb。根據(jù)以上原則，設(shè)計出序列長度大于35kb但缺失了pIX的輔助病毒，該病毒能夠在提供pIX的293 細(xì)胞中復(fù)制，但由于生成的輔助病毒太大而無法包裝，從而降低輔助病毒的污染。 (5) 非腺病毒載體作輔助病毒 Cheshenko15利

13、用包含有大部分腺病毒基因的桿狀病毒作為輔助病毒感染293Cre細(xì)胞。Cre重組酶作用于桿狀病毒上的LoxP 位點，將桿狀病毒分為骨架部分和腺病毒兩部分。前者保持在轉(zhuǎn)錄水平，不會被復(fù)制；而后者則可以提供第三代腺病毒的輔助病毒所有功能，與攜帶目的基因的質(zhì)粒一起構(gòu)建出第三代腺病毒載體。這種設(shè)計使第三代腺病毒避免了輔助病毒的污染，但是在終病毒中出現(xiàn)了RCA。 (6) Av1S4BflxFE3輔助病毒 Sakhuja等16重組構(gòu)建出一種新的輔助病毒Av1S4BflxFE3，并在PER.C6基礎(chǔ)上生產(chǎn)出一種新的替代細(xì)胞株P(guān)ER.C6-Cre細(xì)胞株。Av1S4BflxFE3輔助病毒包含整個AD5的E3編碼區(qū)

14、，擁有從細(xì)菌人工染色體克隆C0500H20得到的4370 bp的stuffer DNA，但去除了轉(zhuǎn)基因表達(dá)盒。使用這種新的輔助病毒可以進(jìn)一步優(yōu)化載體生產(chǎn)過程。Av1S4BflxFE3擁有較大的基因組(37.3kb)，容易與第三代病毒分離，轉(zhuǎn)染后第二代使用氯化銫滴度離心法即可使菌株純化，避免第三代之后載體制備中污染的進(jìn)一步擴(kuò)大，從而提高了產(chǎn)品的效價。采用PER.C6-Cre細(xì)胞株的最大優(yōu)點就是避免了以前構(gòu)建方法中同源重組產(chǎn)生RCA的問題，因為在這種細(xì)胞株中輔助病毒、第三代病毒和細(xì)胞系之間的所有同源物質(zhì)已經(jīng)被清除，所以生產(chǎn)的第三代病毒中沒有RCA出現(xiàn)。由于PER.C6-Cre細(xì)胞株可以高效表達(dá)Cr

15、e重組酶，適用于任何血清懸浮培養(yǎng)液，從而使第三代病毒在生物反應(yīng)器中的生產(chǎn)具有了可行性。通過PCR測定混有輔助病毒的第三代病毒擴(kuò)增物，發(fā)現(xiàn)不管完整的還是突變的以及缺乏包裝信號的輔助病毒均可被檢測出來。研究顯示該系統(tǒng)不僅有較高的生產(chǎn)率，而且輔助病毒(包括突變的和未突變的) 的污染大大降低，也沒有RCA 出現(xiàn)。 另外，有研究者對第三代病毒載體質(zhì)粒和輔助基因組質(zhì)粒(病毒)共轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)染/感染等生產(chǎn)方法進(jìn)行了比較，發(fā)現(xiàn)用具有相同復(fù)制原點的第三代病毒載體質(zhì)粒和輔助基因組質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染生產(chǎn)體系可以提高病毒的生產(chǎn)17。如將基因組與腺病毒的末端蛋白相連后，載體的生產(chǎn)效率要比無末端蛋白時高數(shù)倍；并且Cre重組酶表達(dá)細(xì)胞株的限制性暴露，可以有效減少輔助病毒