基因測序技術(shù)概述(共9頁)

1、精選優(yōu)質(zhì)文檔-傾情為你奉上基因測序技術(shù)概述摘要：基因測序技術(shù)是一種發(fā)展迅速和應(yīng)用廣泛的現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)之一。本文基于國內(nèi)外基因測序技術(shù)的發(fā)展現(xiàn)狀，綜合評述了四代基因測序技術(shù)，歸納了它們各自的特點與優(yōu)缺點，以及應(yīng)用現(xiàn)狀、范圍及其在實際應(yīng)用中的優(yōu)勢和不足，總結(jié)了當(dāng)前出現(xiàn)的基因測序新方法，并對該項技術(shù)的發(fā)展趨勢進行展望。關(guān)鍵詞：基因測序技術(shù)；發(fā)展；應(yīng)用；前景Abstract: Gene sequencing technology is a kind of modern molecular biology techniques with rapid development and wide appl

2、ication .In this paper, it is based on the current development of gene sequencing technology at home and abroad, a comprehensive review is given on the four generations of gene sequencing technology, it sums up their respective characteristics ， advantages and disadvantages, as well as their applica

3、tion about status, scope and its advantages and disadvantages in practical application, it summarizes the new gene sequencing method, and points out the development trend of itself. Key words: Gene sequencing technology; Development; Application; Prospects基因測序技術(shù)，又稱DNA測序技術(shù)，是分子生物學(xué)研究中最常用的技術(shù)，它的出現(xiàn)極大地推動了生

4、物學(xué)的發(fā)展成熟。該技術(shù)始于20世紀70年代中期。1977年Maxam和Gilbert報道了通過化學(xué)降解測定DNA序列的方法。1同一時期，Sanger發(fā)明了雙脫氧鏈終止法。20世紀90年代初出現(xiàn)的熒光自動測序技術(shù)將DNA測序帶入自動化測序的時代。這些技術(shù)統(tǒng)稱為第一代基因測序技術(shù)。最近幾年發(fā)展起來的第二代基因測序技術(shù)則使得DNA測序進入了高通量、低成本的時代。目前，基于單分子讀取技術(shù)的第三代測序技術(shù)已經(jīng)出現(xiàn)，該技術(shù)測定DNA序列更快，并有望進一步降低測序成本。2第一代DNA測序技術(shù)包括傳統(tǒng)的化學(xué)降解法、雙脫氧鏈終止法、基于Sanger原理而發(fā)展的熒光自動測序技術(shù)，以及雜交測序技術(shù)等3。隨著人類基因

5、組計劃的完成，進入功能基因組時代后，傳統(tǒng)的第一代測序技術(shù)不足以滿足深度測序和重復(fù)測序等的需求，因而促進了新一代測序技術(shù)的發(fā)展。第二代測序平臺包括454測序技術(shù)、Solexa技術(shù)和SOLID測序技術(shù)。第三代測序技術(shù)是在第二代測序基礎(chǔ)上增加讀長，提高了測序效率，降低了成本。三代主要是單分子測序，能直接對RNA和甲基化DNA序列進行測序4。第四代測序技術(shù)為納米孔測序技術(shù)，具有長讀長、高通量、低成本和短耗時的優(yōu)勢 5。目前，四代測序技術(shù)在各項研究領(lǐng)域中均有所應(yīng)用，未來測序技術(shù)將會發(fā)揮更大的作用。1國內(nèi)外基因測序技術(shù)1.1第一代測序技術(shù)1.1.1化學(xué)降解法 1977年，Gilbert等提出了化學(xué)降解法。

6、在該方法中，一個末端被放射性標(biāo)記的DNA片段在五組相互獨立的化學(xué)反應(yīng)中分別被部分降解，其中每一組反應(yīng)特定地針對某種堿基。因此生成五個特異性標(biāo)記的分子，每組混合物中均含有長短不一的DNA分子，長度取決于該組反應(yīng)所針對的堿基在原DNA片段的位置。最后，各組混合物通過聚丙烯酰胺凝膠電泳進行分離，再通過放射自顯影來檢測末端標(biāo)記的分子。6化學(xué)降解法剛提出時，因準確性及易掌握性使用比較廣泛。而且化學(xué)降解法有一個獨特的優(yōu)點即用原DNA分子進行測序而不是酶促合成產(chǎn)生的拷貝，排除了合成時造成的錯誤。但由于操作復(fù)雜，之后被Sanger法所代替。1.1.2雙脫氧鏈終止法雙脫氧鏈終止法又稱Sanger法，該方法的原理

7、是：由于雙脫氧核苷三磷酸（ddNTP)的2和3都不含羥基，在DNA反應(yīng)中不能合成磷酸二酯鍵，因此可以被用來中斷DNA合成反應(yīng)。7核酸模板在DNA聚合酶、引物、四種單脫氧核苷三磷酸（dNTP,其中的一種用放射性P32標(biāo)記）存在條件下復(fù)制時，在四管反應(yīng)系統(tǒng)中，分別按比例引入四種ddNTP,因為雙脫氧核苷沒有3-OH,所以只要雙脫氧核苷滲入鏈的末端，該鏈就停止延長，若鏈端摻入單脫氧核苷，鏈就可以繼續(xù)延長。如此每管反應(yīng)體系中便合成以各自的雙脫氧堿基為3端的一系列長度不等的核酸片段。反應(yīng)終止后，分四個泳道進行凝膠電泳，分離長短不一的核酸片段，長度相鄰的片段相差一個堿基。經(jīng)過放射自顯影后，根據(jù)片段3端的雙

8、脫氧核苷，便可依次閱讀合成片段的堿基排列順序（圖1A）。Sanger法因操作簡便，得到廣泛的應(yīng)用。后來在此基礎(chǔ)上發(fā)展出多種DNA測序技術(shù)，其中最重要的是熒光自動測序技術(shù)。1.1.3毛細管電泳和熒光測序熒光自動測序技術(shù)基于Sanger原理,用熒光標(biāo)記代替同位素標(biāo)記,并用成像系統(tǒng)自動檢測,從而大大提高了DNA測序的速度和準確性。在1990年，毛細管凝膠電泳-質(zhì)譜測序技術(shù)被Zagursky和McCornick建立。毛細管凝膠電泳技術(shù)將凝膠電泳對大分子的高分辨率與毛細管電泳的快速微量相結(jié)合。電泳中凝膠的抗對流性大大提高了分辨率。目前,應(yīng)用最廣泛的美國應(yīng)用生物系統(tǒng) (Applied Biosystems

9、, ABI) 公司的3730系列自動測序儀即是基于毛細管電泳和熒光標(biāo)記技術(shù)的 DNA測序儀。 8，91.1.4雜交測序技術(shù)雜交測序是20世紀80年代末出現(xiàn)的一種測序方法，該方法不同于化學(xué)降解法和Sanger法，而是利用DNA雜交原理，將一系列已知序列的單鏈寡核苷酸片段固定在基片上，把待測的DNA樣品片段變性后與其雜交，根據(jù)雜交情況排列出樣品的序列信息。雜交測序檢測速度快，采用標(biāo)準化的高密度寡核苷酸芯片能夠大幅度降低檢測的成本，具有部分第二代測序技術(shù)的特點。但該方法誤差較大，且不能重復(fù)測定。第一代測序法準確率高和讀長長，適合對新物種進行基因組長距離的框架構(gòu)建及測序長度KB-MB級別的小規(guī)模項目；

10、可用于已知或未知的基因突變檢測，常被用作標(biāo)準的鑒定方法以及最終確定突變的確切位點與突變性質(zhì)的手段；該法特別適用于單基因病的基因診斷和產(chǎn)前診斷。10但其通量小，只能逐段測序即只能分析單個的 DNA 片段，無法完成全基因組層面的分析，且測序成本高，數(shù)據(jù)分析量大,自動化程度不高或需手工操作。第一代測序技術(shù)，不管是Sanger的雙脫氧鏈終止法還是 Maxam 和 Gilbert 的化學(xué)裂解法，都需要放射性同位素標(biāo)記，操作繁瑣且不能自動化，故無法滿足大規(guī)模測序的要求。另外，毛細管微陣列DNA 測序在成本與耗時方面亦無法滿足基因組學(xué)的發(fā)展需要。11,12 1.2第二代測序技術(shù)高通量測序技術(shù)，又名二代測序或

11、深度測序，可以一次性測定幾十萬甚至幾百萬條序列，是傳統(tǒng)測序技術(shù)的一次革命，主要有454測序平臺和Solexa測序平臺。高通量測序技術(shù)屬于一類循環(huán)陣列合成測序的技術(shù)群。這類技術(shù)首先都是將基因組DNA隨機片段化并制備文庫，通過對數(shù)以萬計克隆陣列的延伸反應(yīng)產(chǎn)生信號的檢測，最終獲取測序的信息。該技術(shù)有兩個方面的突出優(yōu)勢：其一，通過使用微陣列配置實現(xiàn)大規(guī)模的并行化測序，提高測序效率；其二，無需電泳分離過程和細菌轉(zhuǎn)染、質(zhì)粒制備等克隆過程，設(shè)備趨于微型化，從而降低了各環(huán)節(jié)的成本，節(jié)省了時間和人力。該技術(shù)的發(fā)展使人類對各種病原或物種遺傳多樣性的評價達到了前所未有的詳細程度，它已成為現(xiàn)代科研中必不可少的技術(shù)之一

12、。第二代測序技術(shù)最顯著的特征是高通量，一次能對幾十萬到幾百萬條DNA分子進行序列測序，方便了對一個物種的轉(zhuǎn)錄組測序或基因組深度測序。13高通量測序技術(shù)進入市場，使DNA測序技術(shù)在2005年發(fā)生了重要轉(zhuǎn)折，改變了測序的規(guī)模化進程。瑞士羅氏（Roche）公司和美國應(yīng)用生物系統(tǒng)(Applied Biosystems, ABI)公司都推出了各自的新一代DNA測序儀，主要技術(shù)革新有以下幾點：采用矩陣分析技術(shù)，實現(xiàn)了大規(guī)模并行化，使得矩陣上的DNA樣本可以被同時并行分析：不再采用電泳技術(shù)，使得DNA測序儀得以微型化，測序成本大大降低；邊合成邊測序，測序速度大幅提高（圖1B）。141.3第三代測序技術(shù)第三代

13、測序技術(shù)是高通量、單分子測序，單分子測序儀被應(yīng)用于第三代的測序（圖1C）。太平洋生物科學(xué)（Pacific Biosciences）公司的單分子實時測序（SMRT）技術(shù)和牛津納米孔公司正在研究的納米孔單分子測序技術(shù)逐漸向著高通量、低成本、長讀取長度的方向發(fā)展。不同于第二代測序依賴于DNA模板與固體表面相結(jié)合，然后邊合成邊測序，第三代分子測序不需要進行PCR擴增。15,16單分子實時測序（SMRT）測序技術(shù)是先將DNA聚合酶固定在測序芯片的反應(yīng)孔底部，當(dāng)加入的DNA測序單鏈進入反應(yīng)孔被DNA聚合酶捕獲后，四種不同熒光標(biāo)記的dNTP 加在反應(yīng)孔的上端，根據(jù)標(biāo)記熒光基團發(fā)射波長的不同，可以識別延伸的堿

14、基種類。 21,221.4第四代測序技術(shù)第四代測序技術(shù),即納米孔測序技術(shù),該方法不同于其他測序方法,不需要對DNA進行生物或化學(xué)處理,而采用物理辦法直接讀出 DNA序列。原理可以簡單的描述為: 單個堿基通過納米尺度的通道時, 會引起通道電學(xué)性質(zhì)的變化。理論上, A, C, G, T 四種不同的堿基化學(xué)性質(zhì)的差異會導(dǎo)致它們穿越納米孔時引起的電學(xué)參數(shù)的變化量也不同,對這些變化進行檢測可以得到相應(yīng)堿基的類型。目前用于 DNA測序的納米孔可以大致分為兩類:生物納米孔和固態(tài)納米孔。典型的生物納米孔和固態(tài)納米孔的結(jié)構(gòu)如圖1D所示。由于DNA鏈的直徑非常小(雙鏈DNA直徑約為2nm,單鏈DNA直徑約為1nm

15、),所以對所采用的納米孔的尺寸有著近乎苛刻的要求。生物納米孔多采用的是溶血素(一般嵌入在雙層脂膜當(dāng)中),其最窄處直徑尺寸約為1.5nm,恰好允許單鏈DNA分子通過,并且大小嚴格一致。然而生物納米孔在膜穩(wěn)定性、電流噪聲等方面的問題，在一定程度上限制了其發(fā)展。牛津納米孔公司在蛋白納米孔的應(yīng)用方面取得了一定進展，他們的Grid ION 和 Min ION 系統(tǒng)就是基于蛋白納米孔的測序平臺。固態(tài)納米孔主要是利用硅及其衍生物制造而成，一般使用離子束或電子束在硅或其他材料薄膜表面鉆出納米尺度的孔洞,再進一步對孔的形狀和大小進行修飾而成。相比于生物納米孔，固態(tài)納米孔在穩(wěn)定性、電流噪聲、工藝集成方面有著顯著的

16、優(yōu)勢,但是因為受限于如今的半導(dǎo)體工藝制造水平,固態(tài)納米孔的制造還較為復(fù)雜與昂貴。納米孔測序的優(yōu)點十分明顯,與前幾代技術(shù)相比在成本、速度方面有著很大優(yōu)勢,但是目前還處在起步階段,從測序原理到制造工藝都存在許多問題,例如：研究者們在實驗中遇到的一個普遍問題就是DNA分子的運動難以控制，還有納米孔的表面性質(zhì)，如表面粗糙度、電荷分布、電荷密度、親水疏水特性等,會對DNA 分子的運動、噪聲信號大小產(chǎn)生很大影響,這時就需要選擇合適的材料對納米孔進行表面修飾，這也有待更好的研究發(fā)現(xiàn)。目前還有相當(dāng)多的困難，許多技術(shù)也都只停留在理論階段，距離真正的商業(yè)化應(yīng)用還有很長一段路要走。圖1.(A)雙脫氧鏈終止法測序，在

17、四管反應(yīng)系統(tǒng)引入ddNTP,每管反應(yīng)體系合成長度不等的核酸片段；之后進行凝膠電泳，經(jīng)過放射自顯影，根據(jù)片段3端的雙脫氧核苷，便可依次閱讀合成片段的堿基排列順序。(B)454測序, 采用矩陣分析技術(shù)，使得矩陣上的DNA樣本可以被同時并行分析。(C)單分子測序儀,工作時先將DNA聚合酶固定在測序芯片的反應(yīng)孔底部，DNA聚合酶捕獲加入的DNA測序單鏈，四種不同熒光標(biāo)記的dNTP 加在反應(yīng)孔的上端，根據(jù)標(biāo)記熒光基團發(fā)射波長的不同，可以識別延伸的堿基種類。(D)生物納米孔和固態(tài)納米孔的結(jié)構(gòu)，a: 溶血素，溶血素內(nèi)孔徑大小剛好允許單鏈DNA 分子通過，是十分理想的納米孔材料;b:固態(tài)納米孔,根據(jù)采用的工藝

18、不同,納米孔的幾何形狀和尺寸也有所不同,一般用于DNA測序的納米孔直徑要求小于 5 nm。2基因測序技術(shù)應(yīng)用測序技術(shù)有利于我們更好地進行科學(xué)研究。第一代DNA測序技術(shù)就在人類基因組計劃中有著至關(guān)重要的作用，加快了人類基因組計劃的實現(xiàn)17。其作為早期測序技術(shù)有著自身優(yōu)缺點，現(xiàn)如今還在被人們使用。但隨著第二代測序技術(shù)的出現(xiàn)，用第二代測序技術(shù)解決科學(xué)問題成為更普遍的事情。當(dāng)今，高通量測序開始在尋找疾病的候選基因上應(yīng)用廣泛。第二代測序技術(shù)使得核酸測序的單堿基成本與第一代測序技術(shù)相比急劇下降,測量通量明顯提高。18因此，第二代測序技術(shù)加快了基因組研究的進展步伐，讓所有實驗室皆可開展基因組測序工作。目前，

19、一些測序技術(shù)被主要應(yīng)用于科研院所、企業(yè)研發(fā)部門等。例如，半導(dǎo)體測序是通過檢測DNA鏈在延伸的過程中產(chǎn)生的H+，實現(xiàn)邊合成邊測序。19,20,HeliScope測序技術(shù)是基因組DNA經(jīng)過剪切、多聚腺苷酸加尾并固定于測序芯片表面后，A、C、G、T四種熒光修飾的dNTP 依次循環(huán)流加至芯片上，當(dāng)堿基互補延伸后，采集熒光信號獲得堿基信息，之后酶切去除熒光基團，隨之進行下一輪反應(yīng)。納米孔測序技術(shù)利用鑲嵌于脂質(zhì)雙分子層中的經(jīng)過基因工程改造過的-溶血素蛋白作為納米孔道，并在-溶血素蛋白孔道上部和中部分別連接一個核酸外切酶和一個氨基化環(huán)糊精配體。在測序反應(yīng)開始時，核酸外切酶逐個切割單鏈DNA分子上的脫氧核糖核

20、苷酸分子，切割后的脫氧核糖核苷酸分子進入納米孔，經(jīng)過氨基化環(huán)糊配體時，將會引起電流的變化。由于四種脫氧核糖核苷酸與甲基化嘧啶脫氧核糖核苷酸引起電流變化幅度不同，從而可以區(qū)分不同的堿基，進而測定DNA 鏈的序列。作為新興的第四代 DNA測序技術(shù)，具有低成本、高讀長、易集成等優(yōu)勢。如今，隨著半導(dǎo)體工藝技術(shù)的飛速發(fā)展，小型化、高速度、大通量的納米孔測序芯片的實現(xiàn)成為可能。目前，具代表性的第二代測序平臺有瑞士羅氏（Roche）公司的454，美國Illumina公司的基因組測序儀、HiSeq2000和MiSeq，美國應(yīng)用生物系統(tǒng)(Applied Biosystems,ABI)公司的寡聚物連接檢測測序55

21、00XL，美國生命科技（Life Technologies）公司半導(dǎo)體測序個人化操作基因組測序儀（表1）；第三代測序平臺有美國螺旋生物科學(xué)（Helicos Biosciences）公司的Heli-Scope遺傳分析系統(tǒng)和太平洋生物科學(xué)（Pacific Biosciences）公司的單分子實時測序（SMRT）技術(shù)；第四代測序技術(shù)有英國牛津納米孔 (Oxford Nanopore Technologies) 公司的納米孔測序技術(shù)。25表1：公司名稱技術(shù)原理商業(yè)模式Illumina合成測序測序儀、試劑耗材銷售，測序及解讀服務(wù)Life Tech基于磁珠的大規(guī)模并行鏈接DNA測序測序儀、試劑耗材銷售Ro

22、che大規(guī)模并行焦磷酸合成測序測序儀、試劑耗材銷售，2013年停產(chǎn)3基因測序技術(shù)前景展望基因測序技術(shù)的出現(xiàn)對生命科學(xué)和醫(yī)學(xué)的發(fā)展起到了革命性作用，自1977年Sanger發(fā)明鏈終止雙脫氧鏈終止法、Maxam和Gilbert發(fā)明化學(xué)降解法的第一代測序技術(shù)以來，基因測序技術(shù)不斷發(fā)展。隨著技術(shù)革新，DNA測序技術(shù)得到了不斷的創(chuàng)新，在保證測序準確度的前提下，逐步優(yōu)化操作程序，使得測序速度逐漸提高，測序成本也呈下降趨勢，下一代測序技術(shù)（Next-generation sequencing，NGS）就應(yīng)運而生，23NGS技術(shù)又稱大規(guī)模平行測序或深度測序，24包括第二代、第三代和第四代測序技術(shù)。第三代和第四

23、代測序技術(shù)目前處于發(fā)展階段，雖讀長比Sanger 測序法長十幾倍，但Pac Bio RS 單分子實時測序系統(tǒng)和Min ION 測序儀錯誤率高，還有待改進。26基因測序技術(shù)向?qū)⑾蚋咄?、更高精度、更低成本的方向發(fā)展，測序速度達到1萬個堿基/秒、測序成本不到1000美元的小型基因組測序儀呼之欲出；一次并行測定數(shù)百種微生物的低價測序也不是夢想。更高通量與精度、更低成本的測序技術(shù)定會出現(xiàn)，全民個體化健康的時代也必將到來。27 基因測序技術(shù)對揭示基因組的結(jié)構(gòu)和功能已經(jīng)并正在發(fā)揮重要的推動作用，基因測序技術(shù)的日漸成熟，在功能基因組、系統(tǒng)生物學(xué)和藥物基因組的研究中將會發(fā)揮廣泛作用。比如說，新一代基因測序技

24、術(shù)能鑒定出更多新的與腫瘤相關(guān)的基因，且成本更低，這為腫瘤的個體化基因治療提供條件，28,29此外，微生物在調(diào)節(jié)人體的內(nèi)分泌系統(tǒng)及免疫系統(tǒng)中發(fā)揮重要作用，30隨著基因測序技術(shù)的發(fā)展，有望實現(xiàn)從基因水平及分子結(jié)構(gòu)掌握其功能作用的機理，對今后的健康管理有一定指導(dǎo)作用?？傊驕y序技術(shù)的發(fā)展無疑推動了生物、醫(yī)療、化學(xué)和計算機等多領(lǐng)域的發(fā)展，將使生命科學(xué)研究進入新的紀元！參考文獻1MaxamAM,GilbertW.AnewmethodforsequencingDNA.ProcNatlAcadSciUSA,1977,74(2):.2SangerF,NicklenS,CoulsonAR.DNAsequen

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