鏈霉素在牛奶中殘留的微生物學檢測方法

1、鏈霉素在牛奶中殘留的微生物學檢測方法蔡金華，劉雅妮，顧欣（上海市獸藥飼料監(jiān)察所，上海 201103） 摘要 目的 建立鏈霉素在牛奶中殘留的微生物學檢測方法。方法 采用微生物測定法定量檢測牛奶中鏈霉素殘留量，樣品前處理用10%（m/v）三氯乙酸作為提取液，采用冷凍離心，使牛奶中殘留鏈霉素得到提取和分離。結果 鏈霉素在0.103. 蔡金華（1978），男，漢族，本科，從事獸藥、飼料檢測工作。20u/mL的濃度范圍內(nèi)具有良好線性關系（r=0.9981）,牛奶中3種添加濃度0.20、0.80、1.60 u/g的平均回收率為 97.6%（n=9）， 3種添加濃度0.20、0.80、1.60u/g 各自的

2、RSD為：1.6 %，3.7 %，1.2 %（n=3）。結論 本方法可用于牛奶中鏈霉素殘留的檢測。關鍵詞 鏈霉素；牛奶；微生物學檢測；三氯乙酸；冷凍離心 鏈霉素屬于氨基糖苷類抗生素，用于革蘭氏陰性菌和結核桿菌感染，在治療家畜感染性疾病中發(fā)揮了重要作用，但抗生素的耐藥性日益增強，并且毒副作用比較大1。為了加強獸藥殘留管理工作，保證畜產(chǎn)品質(zhì)量安全，農(nóng)業(yè)部于1999年發(fā)布了動物性食品中獸藥最高殘留限量的通知，并規(guī)定牛奶中鏈霉素的最高殘留限量（MRL）為200 ug/kg。然而，相應的鏈霉素檢測技術并不完備，由于氨基糖苷抗生素缺少發(fā)色基團，應用到HPLC時常要對其衍生化，設備條件過高，難以普及；并且其

3、理化測定方法相當復雜和通用性差2。本文采用被測樣品經(jīng)10%（m/v）三氯乙酸提取液震蕩、浸泡，冷凍離心，沉淀，將樣品中的鏈霉素提取于上清液中，再以枯草芽孢桿菌為檢定菌，用微生物檢定一劑量法測定鏈霉素的殘留量。1 材料和設備1.1 試藥 鏈霉素標準品（中國藥品生物制品鑒定所 批號：0308-200012 含量：731u/mg），其余均為分析純。1.2 試劑 10%（m/v）三氯乙酸，25%（m/v）NaOH ，0.2mol/L NaOH，0.1mol/L磷酸，磷酸鹽緩沖液（PH7.8）， 鏈霉素標準品貯備液（精密稱取適量標準品，用磷酸鹽緩沖液（PH7.8）溶解，配成1000u/mL濃度的溶液）。

4、1.3 培養(yǎng)基 營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基（PH7.2）（中國獸藥典二000年版 附錄68頁），抗生素檢定培養(yǎng)基II（PH8.0）（中國獸藥典二000年版 附錄68頁）。1.4 試驗菌種 枯草芽孢桿菌（BaciLLus SubtiLis,CMCC 63501）。1.5 牛津杯 不銹鋼管（外徑（7.80.1）mm，內(nèi)徑（6.00.1）mm，高（100.1）mm）。1.6 設備 高速冷凍離心機(Sigma公司)，高壓蒸汽滅菌鍋（日本TOMY），生化培養(yǎng)箱(SANYO公司)，抑菌圈測定儀ZY-300IV（北京先驅(qū)威鋒技術開發(fā)公司）。2 方法2.1 菌懸液的制備 取工作用菌斜面，用適量無菌生理鹽水洗下菌苔，接種于

5、盛有200mL營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基的克氏瓶中，（361）C培養(yǎng)72h，當有80%芽孢形成時停止培養(yǎng)，用40mL無菌生理鹽水洗下菌苔制成菌懸液，裝入無菌試管中，于65C水浴中加熱30min,此菌懸液置4C冰箱中保存?zhèn)溆茫墒褂?0 d。2.2 雙蝶制備 取平底雙蝶，注入15mL抗生素檢定培養(yǎng)基II（PH8.0）,待其凝固，作為底層，另取抗生素檢定培養(yǎng)基II（PH8.0）適量加熱融化，放冷至60C，加入菌懸液適量，搖勻，在每一個雙蝶中分別加入5mL，在底層上均勻攤布，作為菌層。2.3 菌種菌懸液用量測定和最低檢測限確定 將不同量的同一菌懸液分別加到抗生素檢定培養(yǎng)基II中，作為菌層，制備檢定用雙碟，在雙碟

6、上放置鋼管，并注入250uL 0.10 u/mL工作標準液，于（361）C恒溫培養(yǎng)（161）h，以產(chǎn)生10.00mm以上清晰完整的抑菌圈者為最適菌懸液用量，并以0.10u/mL鏈霉素濃度為最低檢測限，可以滿足牛奶中鏈霉素殘留分析。2.4標準曲線回歸方程制備 用磷酸鹽緩沖液（PH7.8）作為稀釋液，采用抗生素一劑量標準曲線法，即取鏈霉素標準品貯備液（1000u/mL）稀釋成100 u/mL，再把100 u/mL標準品溶液稀釋成10u/mL，最后，10u/mL標準品溶液分別稀釋成所需的各個工作標準濃度點（0.10，0.20，0.40，0.80，1.60，3.20 u/mL），中心濃度標準液設為0.

7、80u/mL。每個工作標準濃度點制備3個碟子，在每個碟子中，間隔的3個鋼管分別滴入250uL中心濃度標準液，另間隔的3個鋼管分別滴入250uL工作標準濃度液，于（361）C恒溫培養(yǎng)（161）h。用抑菌圈測定儀測量抑菌直徑，由電腦軟件得到回歸方程式和標準曲線圖。2.5 樣品提取分離和濃度測定 把保存在4C或溫度更低的牛奶樣品放到室溫恒溫，稱取8.0 g牛奶于30mL聚丙烯離心管中，加入1.4mL 10%(m/v)三氯乙酸，充分震蕩20min，而后樣品冷凍離心（0C，5000rmp,10min），取上清液，并用0.2mol/L NaOH和0.1 mol/L磷酸將其調(diào)整為PH7.8（可以先加0.05

8、-0.10mL 25%(m/v )NaOH），再進行樣品冷凍離心（0C，5000rmp,10min），取上清液，用磷酸鹽緩沖液（PH7.8）定容至10mL，得到樣品提取液。而后采用抗生素一劑量求效價法，即每個樣品制備3個碟子，在每個碟子中，間隔的3個鋼管分別滴入250uL中心濃度標準液，另間隔的3個鋼管分別滴入250uL樣品提取液，于（361）C恒溫培養(yǎng)（161）h。用抑菌圈測定儀測量樣品抑菌直徑，由電腦軟件得到其實際濃度。2.6 添加陽性牛奶回收率實驗 取空白牛奶樣品液（預先用微生物學檢測，無抗菌物質(zhì)殘留的牛奶），置室溫平衡，稱取空白牛奶100.0g，分別加入濃度為1000 u/mL 標準液

9、0.16 mL 和100 u/mL標準液0.80mL、0.20mL，得到添加終濃度為1.60、0.80、0.20 u/g的添加陽性牛奶，而后按2.5方法進行處理。回收率計算公式：回收率=（添加陽性測得值10）/（8.0添加終濃度）。2.7 重復性試驗 取空白陽性牛奶（添加終濃度為0.20，0.80，1.60u/g）各3份，按2.5項下方法操作，比較各級濃度間和總濃度間的相對誤差。3 實驗結果3.1標準曲線回歸方程和線性關系 標準曲線回歸方程為：Y=0.7526+0.1327（X-17.8369），相關系數(shù)r=0.9981。結果表明：鏈霉素在0.10-3.20 u/mL的濃度范圍內(nèi)，抑菌圈直徑與

10、效價濃度的對數(shù)呈良好的線性關系。線性圖（見圖1，注：圖1以抑菌圈直徑為橫坐標，以鏈霉素溶液濃度的對數(shù)為縱坐標）如下：圖1 鏈霉素標準曲線3.2 回收率和重復性實驗結果 鏈霉素在牛奶中回收率達到要求（80%110%） ，檢出重復性良好 見表1表1 鏈霉素在牛奶中回收率和重復性實驗 編號 添加終濃度（u/g） 測得值（u/mL） 回收率（%） RSD（%） 平均回收率（%）RSD（%）1 0.20 0.15 93.8 2 0.20 0.16 96.9 1.6 3 0.20 0.15 95.4 4 0.80 0.59 91.8 5 0.80 0.63 98.8 3.7 97.6 6.3 6 0.80

11、 0.61 95.0 7 1.60 1.29 100.7 8 1.60 1.33 104.1 1.2 9 1.60 1.30 101.6 4討論和小結4.1 本方法樣品牛奶前處理實用、快速、有效。10%（m/v）三氯乙酸不僅能使牛奶中的蛋白質(zhì)等變性，而且能穩(wěn)定提取和保護牛奶中的鏈霉素。冷凍離心能快速、有效地析出、沉淀樣品液中的蛋白質(zhì)、脂肪等固形體。4.2 本方法通過調(diào)節(jié)菌懸液和培養(yǎng)基的使用量，完全可以使0.10u/mL的標準鏈霉素產(chǎn)生大于10.00mm的抑菌圈，并以此把0.10u/mL標準濃度作為最低檢測限3，4，5，所以，本方法靈敏度能夠滿足農(nóng)業(yè)部規(guī)定的牛奶中鏈霉素最高殘留限量為200ppb

12、的檢測要求。4.3 本方法能反映抗生素真實的抗菌效能，操作性強、費用低廉、普及快、準確度高。雖然理化測定牛奶中鏈霉素殘留的方法有許多，但基本上都需精密儀器，并且還要對鏈霉素進行各種衍生化等處理，實驗條件苛刻，衍生技術不一1，6，7，難以規(guī)范化和普及。而采用本文的方法完全能滿足牛奶中鏈霉素殘留篩選檢測，并且容易為制定其標準技術提供依據(jù)。參 考 文 獻：1 于船，王萬欽.中國獸藥知識大全M.四川：四川科學技術出版社，1997.736-737，747.2 李俊鎖，邱月明，王超.獸藥殘留分析M.上海：上海科學技術出版社，2002.344-350.3 孟昭赫.食品衛(wèi)生檢驗方法注解M.北京：人民衛(wèi)生出版社

13、,1990.849.4 中華人民共和國國家進出口商品檢驗局.出口禽肉中桿菌肽殘留量檢驗方法 SN 0295-93S.5 陳光哲，朱慰先，陳家斌.肉類食品鏈霉素殘留量檢測方法研究J.江蘇農(nóng)業(yè)科學，2001，5：56.6 Hassan Abbasi,Karl-Erik Hellens.Modified determination of dihydrostreptomycin in kidney,muscle and milk by HPLCJ.Analyst,1998,123:2725-2727.7 Gertraud Suhren,Karin Knappstein.Detection of inc

14、uured dihydrostreptomycin residues in milk by liquid chromatography and preliminary confirmation methodsJ. Analyst,1998,123:2797-2801.Determination of streptomycin residues in milk by microbiologic inhibition testsCAI Jin-hua,LIU Ya-ni,GU Xin (Shanghai Municipal Supervisory Institute Veterinary Drug

15、s and Feedstuffs ,Shanghai 201103 )Abstract: A method is presented for the determination of streptomycin residues in milk by microbiologic inhibition tests.The new sample work-up procedures include 10% trichloroacetic acid denaturalization of protein,e.t.and precipitation of protein and fats by free

16、zing centrifuging.The standard curves of streptomycin were all linear in the range of 0.103.20 u /mL (r=0.9981,n=6) .The RSD for repetition of the concentrations (0.20,0.80,1.60u/g ) spiked with streptomycin standard solution for milk was 1.6%, 3.7%,1.2 %(n=3), respectively and these average spiked recover