westernblot問(wèn)題匯總

1、WesternBlot問(wèn)題解答1 .凝膠腫脹或卷曲：注意轉(zhuǎn)膜之前，切割下來(lái)的凝膠一定要在轉(zhuǎn)膜緩沖液中浸泡平衡5-10分鐘，要含有20%的甲醇。2 .條帶歪斜、或漂移因?yàn)檗D(zhuǎn)膜儀使用時(shí)間太長(zhǎng)，兩塊板之間的海綿由于長(zhǎng)期使用變得很薄。當(dāng)按照陰極-海棉-濾紙-膠-膜-濾紙-海綿依次放好后兩塊板不能壓緊，因而在膠和膜之間可能存在潛在的間隙，電轉(zhuǎn)移時(shí)蛋白從膠和膜之間的空隙中流走，形成如圖所示的形狀。 使用十幾張普通的草紙墊在兩塊海棉之間，條帶就可以變得非常的漂亮。另外，轉(zhuǎn)膜時(shí)轉(zhuǎn)膜液一定要浸沒(méi)凝膠和膜，否則也可能出現(xiàn)上述情況。3.單個(gè)或多個(gè)白點(diǎn)：轉(zhuǎn)膜時(shí)在膜與膠之間有氣泡。做三明治時(shí)一定要逐層壓緊，趕盡氣泡。同

2、時(shí)轉(zhuǎn)膜液要提前配置好，加好甲醇，保證轉(zhuǎn)膜前夜體內(nèi)氣泡排凈。氣泡存在的局部會(huì)抵抗蛋白轉(zhuǎn)膜，降低轉(zhuǎn)膜效率。4、轉(zhuǎn)膜緩沖液過(guò)熱：緩沖液離子強(qiáng)度太低，或電壓及電流過(guò)高。按照上述方式配液，同時(shí)轉(zhuǎn)膜過(guò)程中注意降溫。我在冰水混合物中轉(zhuǎn)膜，效果很好。5背景過(guò)高！1）封閉不全，我用 5%-10%的光明脫脂奶粉，效果還可以，現(xiàn)在做基本上沒(méi)什么背景。如果你覺(jué)得不夠可以加點(diǎn) BSA,1%吧。2） 一抗或者是封閉液與膜蛋白的交叉反應(yīng)。這種情況通?？梢酝ㄟ^(guò)加入 TWEEN-20或多次洗膜加以解決。如果問(wèn)題不能解決，那么降低一抗?jié)舛龋蚋鼡Q封閉液種類(lèi)可能解決3） 一抗二抗中某些不純的物質(zhì)也可以造成背景。4）抗體濃度太高，或

3、孵育時(shí)間太常都可能遇到這種情況。那么可以適當(dāng)降低一抗二抗的濃度，或是用提高溫度的方式來(lái)代替雜交時(shí)間的延長(zhǎng)；另外，少量多次得洗膜效果要優(yōu)于多量而長(zhǎng)時(shí)間得洗膜效果。5）曝光時(shí)間的控制。通常我們線(xiàn)曝光一分鐘試試，條帶清晰背景也強(qiáng)，可以縮短曝光時(shí)間，或者過(guò)一段時(shí)間等熒光減弱以后再發(fā)光，一般也可以發(fā)出比較好的條帶。 如果背景強(qiáng)于條帶，那么肯定是前面默默個(gè)原因的一種，這是可以將膜在 TBST中漂洗以下再發(fā)光， 有時(shí)會(huì)有比較好的效果（僅限于國(guó)外較好的試劑盒，國(guó)產(chǎn)的不行，洗一下啥也沒(méi)了！）這個(gè)時(shí)候可以洗膜，洗膜后重新發(fā)光。6、沒(méi)有信號(hào)：1）用單抗時(shí)比較容易出現(xiàn)這種情況。因?yàn)閱慰怪饕轻槍?duì)天然蛋白，這個(gè)時(shí)候.T

4、WEEN-20的作用就顯現(xiàn)出來(lái)了，它可以增加抗原抗體復(fù)合物與膜的結(jié)合。2）確信你的蛋白表達(dá)3）確信蛋白高效的轉(zhuǎn)移到你的膜上4） 一抗二抗的效價(jià)問(wèn)題。無(wú)論哪個(gè)無(wú)效都不能發(fā)光，因此預(yù)實(shí)驗(yàn)一定要從最低的稀釋度開(kāi)始，以排除抗體的因素5）ECL試劑盒質(zhì)量的問(wèn)題，不可小覷。偶親身經(jīng)歷。碰到一批次品。兩個(gè)月白搭！7、微量進(jìn)樣器堵了怎么辦？首先從預(yù)防入手，每次用后的進(jìn)樣器及時(shí)用蒸儲(chǔ)水清洗！如果堵了，不要緊，有辦法：可以用如下辦法解決：1）首先反復(fù)推拉上樣針，看是否可將堵塞物吹出來(lái)；2）方法1不靈，若是25或50ul的針，把針從后側(cè)拔出，然后重新插入，使其內(nèi)部產(chǎn)生氣壓，可能壓出堵塞物質(zhì)；3）如上述方法不靈可以在

5、拔出后注入些清水，然后重新插入，用水壓排出，4）最后的方法，最靈的方法：開(kāi)始步驟同第3種方法中，在加入水后，將上樣器的前端針部放在酒精燈上煨燒至紅色（估計(jì)在什么位置堵的），注意燒紅部分不要距離玻璃過(guò)近，然后，趁熱突然推 針，將水強(qiáng)行推出，通道打開(kāi)后，再通過(guò)稀酸或稀堿沖洗即可！5）或者放在超聲清洗儀里，超聲試試注意，切記在推拉過(guò)程中小心不要把針弄彎8、關(guān)于SDS蛋白電泳的一點(diǎn)心得最近在做蛋白電泳時(shí)候遇到了些麻煩，在這里發(fā)了帖子，并且得到了很多同人的恢復(fù)。本人在看過(guò)回帖后，結(jié)合自己的試驗(yàn)，重新設(shè)計(jì)了方案，得到了滿(mǎn)意的結(jié)果，同時(shí)感覺(jué)有必要拿來(lái)和大家分享：1）蛋白電泳中出現(xiàn)的縱向條帶：原因主要是由于電

6、泳樣品或是電極緩沖液中有沒(méi)有溶解的樣品顆粒所致，上樣前充分將樣品離心，或重新使用新配電極緩沖液即可解決。2）電泳條帶前沿在染色脫色后呈尖形。原因是由于上樣量大且工作電壓過(guò)大引起，我實(shí)驗(yàn)中采用90/120,后來(lái)改用了 80并且不換電壓；同時(shí)減少上樣量到原來(lái)的一半，得到了滿(mǎn)意的結(jié)果（我的樣品分子量 18000 Da, 15%的分離膠）；3）電泳結(jié)束后，染色脫色結(jié)果整個(gè)膠面呈現(xiàn)藍(lán)色，背景很重怎么也脫不去，改用新配的電極緩沖液。問(wèn)題解決。是電極緩沖液污染的結(jié)果（平時(shí)本人有個(gè)壞毛?。合矚g在緩沖液中涮上樣針，導(dǎo)致緩沖液污染）。9.分別用多大電流轉(zhuǎn)膜？1） 一般跟你的分離膠的濃度有關(guān)。2）與你的轉(zhuǎn)印系統(tǒng)型號(hào)

7、有關(guān)！3）與目的蛋白的分子量有關(guān)1一般50KD左右的蛋白，50mA, 1.5h;10 .好幾個(gè)蛋白，我做免疫熒光都做得很好，抗體說(shuō)明也是可以用于western的，可是就做不出來(lái)！顯影后只有很弱的非特異帶。而另一個(gè)蛋白，perk卻做得很好，操作都是一樣的，抗體稀釋也是按廠(chǎng)家說(shuō)明的。1）你用的是單克隆抗體嗎？如果是的話(huà)，請(qǐng)注意 western是在蛋白質(zhì)變性的條件下進(jìn)行的， 活性狀態(tài)下可以反映的抗體在變形狀態(tài)下卻不一定特異性很強(qiáng)，可能其他的蛋白質(zhì)變性之后產(chǎn)生了能與之反映的抗原決定簇！另外，要做好對(duì)照！抗體是什么公司的？有的公司會(huì)將康體稀釋后再賣(mài)（奸商），所以抗體的滴度，根據(jù)公司的要求也不一定準(zhǔn)！2）

8、如果是單抗，western blotting電泳后蛋白變性，構(gòu)象表位可能消失，僅存在線(xiàn)性表位，單 抗可能不識(shí)別。所以 WESTERN BLOTTING 做不出來(lái)了。11 .我的WESTERN為什么出現(xiàn)了多條帶， 每個(gè)加樣槽中 都出現(xiàn)了多條帶， 而且好象都很有 規(guī)律，為什么？是封閉時(shí)間不夠嗎？請(qǐng)指教我做WESTERN是想知道處理后細(xì)胞分泌細(xì)胞因子數(shù)量的變化，這樣必須要內(nèi)參嗎？可能性1）一抗、或二抗抗體濃度太高2）多克隆抗體本身的非特異性反應(yīng)3）抗體的特異性不強(qiáng)4）蛋白異構(gòu)體或降解！5）你的目的蛋白經(jīng)過(guò)處理后發(fā)生變化，而內(nèi)參的條帶基本均勻一致。這樣才有說(shuō)服力，表明 的確是處理因素造成目的蛋白的變化

9、而不是加樣誤差或認(rèn)為的造成目的條帶濃度的變化。所以嚴(yán)格意義上說(shuō)，內(nèi)參事必須做的。12 .轉(zhuǎn)膜的時(shí)候，最下端的蛋白條帶很清楚，可是上邊啥都沒(méi)有看見(jiàn)，社么原因？1）可能是時(shí)間不夠，因?yàn)橐话闶欠肿恿啃〉南绒D(zhuǎn)上去的，大的后轉(zhuǎn)，看你的目的蛋白了，如小的話(huà)，最后不要太長(zhǎng)時(shí)間2）轉(zhuǎn)膜的時(shí)間要根據(jù)你的目標(biāo)蛋白大小和膠濃度而定。蛋白越大、膠濃度越高，時(shí)間就要越 長(zhǎng)。經(jīng)當(dāng)是：12% 18%的膠、418kD的蛋白用100V衡壓/350mA衡流7590min的條 件都可以成功轉(zhuǎn)膜3）主要是轉(zhuǎn)膜時(shí)間不夠，若想證明這個(gè)問(wèn)題，可把原來(lái)的SDS-PAGE ,做一下染色，看看大分子量的蛋白是否仍在膠上。另外，做 western

10、時(shí)，轉(zhuǎn)膜并不是最復(fù)雜的，但無(wú)疑是很重要 的，如果膠上殘存的目的蛋白過(guò)多，會(huì)使與抗體結(jié)合的蛋白負(fù)荷不足，而影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果，因而要反復(fù)摸索轉(zhuǎn)膜時(shí)的時(shí)間、電壓/電泳，直到獲得滿(mǎn)意轉(zhuǎn)膜效果。WB的關(guān)鍵點(diǎn)我覺(jué)得有一下幾個(gè)：一是樣品的處理；二是電泳和轉(zhuǎn)膜條件的摸索；三是保證 試劑、抗體的質(zhì)量。13 .western blot怎樣做內(nèi)參照阿？1）可以轉(zhuǎn)膜后先用目的蛋白的抗體做雜交，將抗體洗掉，再用內(nèi)參蛋白的抗體重新雜交， 結(jié)果顯示信號(hào)亮度一致，認(rèn)為上樣量一致；。2）同樣條件做兩塊膠，等量上樣，同時(shí)轉(zhuǎn)膜；一塊做內(nèi)參蛋白，一塊做目的蛋白。3）只做一塊膠，用蛋白 marker做標(biāo)記，轉(zhuǎn)膜后用麗春紅染色，可見(jiàn)到 42

11、kd （ aactin）左右 處有濃染的條帶，在 42kd略上方將膜剪開(kāi)分別作雜交即可。要求目的蛋白和內(nèi)參蛋白大小 有一定的差異。轉(zhuǎn)大分子量的蛋白可以在轉(zhuǎn)膜液中加入SDS至0.05%,并且可以適當(dāng)減少甲醇用量， 如15%的甲醇電泳中SDS是十二烷基硫酸鈉。十二烷基磺酸鈉簡(jiǎn)稱(chēng)為SAS,兩者的區(qū)別是其中 S的化合價(jià)不同，各是多少?zèng)]去考證。由于最初翻譯者將SDS翻譯為十二烷基磺酸鈉，被很多書(shū)籍引用，故十二烷基磺酸鈉為誤稱(chēng)。真正的十二烷基磺酸鈉不能用于WESTERN o14 .膠為什么總是漏？1）每次電泳完后，洗凈玻璃、膠條和其它附件，下次用之前，用75%酒精擦拭玻璃和膠條，能有效防漏，且利于剝膠。2

12、）避免玻璃邊緣（與膠條接觸處）破損很重要，尤其是下面和膠條接觸的地方3）關(guān)鍵是找一塊很平的桌面，使兩塊玻璃底面非常齊就行了4）膠條一定要干，跑完電泳后，膠條就放在實(shí)驗(yàn)臺(tái)上晾著。5）下面的膠條注意不要老化，如果有裂紋的話(huà)用保鮮膜墊在上面，也可以有效防止漏膠，或者反過(guò)來(lái)用6）玻璃在使用過(guò)程中容易造成小的缺口，從而導(dǎo)致封條無(wú)法完全密封，裝好架子后，在玻璃底邊上抹上一層薄薄的凡士林就好了， 兩邊多點(diǎn)（容易從兩邊漏）這樣就不會(huì)漏了， 就算 是用了很久的很多小缺口的玻璃都沒(méi)有問(wèn)題， 然后轉(zhuǎn)移到電泳槽的時(shí)候，去掉封條，把底上的凡士林擦干就 OK 了（注意，一定要擦干凈，尤其是少量進(jìn)入了兩隔玻璃之間空腔的，贏

13、偉凡士林不導(dǎo)電，會(huì)影響第 2相的效果的7）你可以在海綿墊下再墊一些紙，使得它與玻璃貼的更緊密?；蛘咴诓ＡУ撞坑铆傊欠馍稀?）因?yàn)閮蓧K玻板沒(méi)有放的完全對(duì)齊，底部不在同一個(gè)平面，所以封條封不嚴(yán)，重新對(duì)齊后就不漏了。以后每次只要在水平的桌面上仔細(xì)對(duì)齊兩塊玻板，再夾緊。用手感覺(jué)一下確定在同一平面上后，放到灌膠架并壓在封條上，卡緊。注意兩邊均勻用力，一般不會(huì)再漏。9）先把兩塊玻片放在夾子上，不要加緊，放到架子上，使兩塊玻片的底部對(duì)齊，夾緊兩塊 玻片，然后取下再在其下面墊上墊片，這樣一般就不會(huì)漏膠了。 但是如果你放了墊片再對(duì)齊玻片底部，或者在桌子上對(duì)其玻片底部然后放到架子上的話(huà)，經(jīng)常會(huì)漏膠15 .條帶跑

14、得比正常的窄？1）可能因?yàn)槟z凝的不均勻，聚合的不是很好，灌膠的時(shí)候盡量混勻2）是不是有窄有寬？可能與你拔梳子的時(shí)候有關(guān)，拔梳應(yīng)該迅速，沖洗加樣孔的時(shí)候要小心，以免把上樣帶扭曲； 膠配好了用槍吹幾下再灌膠，還有就是要等指示劑跑到兩層膠交界成一線(xiàn)時(shí)，再調(diào)高電壓。3）可能是你樣品的問(wèn)題，如果鹽濃度較高，便會(huì)擠壓其它條帶，致使條帶寬窄不一，由于 同樣的原因，樣品在凝膠中的速度會(huì)很慢，造成條帶走的較慢，好像與你的預(yù)想不一致4）常見(jiàn)的原因是：每孔上樣量不均勻，應(yīng)確保每孔中上樣量一致5）可能是系統(tǒng)的ph出了問(wèn)題，有可能是你的電極緩沖液，也有可能是凝膠緩沖液，更新緩 沖液看看，看是否能成功16 .為什么會(huì)有

15、微笑”和倒微笑”這樣的效果呢？1）“微笑”是因?yàn)槟愎嗄z的時(shí)候冷卻不均勻，中間部分冷卻不好，導(dǎo)致凝膠中的分子有不同的遷移率所致。這種情況在較厚的凝膠以及垂直電泳時(shí)常常發(fā)生。倒微笑 也稱(chēng) 皺眉 現(xiàn)象常常是由于垂直電泳時(shí)電泳槽的裝置不合適引起的，特別是當(dāng)凝膠和玻璃板組成的三明治底部有氣泡或靠近隔片的凝膠聚合不完全便會(huì)產(chǎn)生這種現(xiàn)象2）書(shū)上說(shuō)出現(xiàn) 微笑”是因?yàn)檎麄€(gè)膠冷凝的不均勻， 中間部分和兩端受熱不一樣而致成了 倒 文案大全微笑”可能是因?yàn)閮啥说哪z凝的不好，力口APS和TEMED后應(yīng)該混合均勻。3）樣品中鹽濃度過(guò)高？點(diǎn)樣量太多或每孔點(diǎn)樣量不均勻？電泳電壓不穩(wěn)定或過(guò)高？17 .Western-blot制

16、膠時(shí)好多泡泡怎么辦？1）首先，玻璃板一定要洗干凈，用洗潔凈洗，沖干凈后再用雙蒸水沖一，晾干。配膠的時(shí) 候沿管壁緩緩加入各個(gè)成分，混勻的時(shí)候用手輕輕搖勻， 如果用槍吹打時(shí)要緩慢且不要打到頭。2）配膠時(shí)混勻要輕，盡量不產(chǎn)生氣泡，上膠時(shí)要快，槍也不打到底。加完分離膠后用雙蒸 水封，待其凝固。即使在上膠時(shí)液面上有氣泡，加水后也會(huì)浮上來(lái)。分離膠凝好后，倒掉里 面的水，用吸水紙吸干，再加濃縮膠，迅速插梳子。3）倒膠的時(shí)候，用1ml的槍沿一側(cè)緩緩加入，不要打到頭，以免帶入氣泡！4）將膠在小燒杯里配好后，將電泳槽略微傾斜，將燒杯的嘴靠在玻璃邊緣，直接倒進(jìn)去，速度快，而且不容易產(chǎn)生氣泡，不妨試試5）用雙蒸水封時(shí)

17、建議用 200ul的槍加水，這樣壓力小，以免把膠沖起來(lái)！6）國(guó)產(chǎn)的只能是緩慢加樣，別把氣泡加進(jìn)去。如果加進(jìn)去了，小心把整個(gè)板在桌上敲敲可 以讓氣泡浮上來(lái)。7）分離膠中的氣泡與插梳子有關(guān)，垂直插容易產(chǎn)生氣泡，且不容意排除。將梳子傾斜5-10度插入，即使產(chǎn)生氣泡也可以也可以通過(guò)輕輕晃動(dòng)梳子使氣泡從一側(cè)逸出。8）pinghw還有一個(gè)制膠起泡泡的原因，就是配膠的液體全部在四度存放，室溫制膠時(shí)由于溫差及凝膠聚合反應(yīng)放熱的關(guān)系，液體中微小的氣泡在凝固的凝膠中也會(huì)放大成可見(jiàn)的較大的泡泡，這種情況在夏天室溫較高時(shí)更容易出現(xiàn)。避免的方法是將制膠成分中除催化劑外的部分配置后放室溫下靜置一會(huì)兒，減小溫差后再加入催化

18、劑制膠。18 .一些瑣碎的細(xì)節(jié)，但卻是實(shí)驗(yàn)中可能經(jīng)常遇到的令人頭痛的問(wèn)題：1 ）安裝好的制膠裝置， 最好先用配置電泳緩沖液的水加滿(mǎn)檢驗(yàn)一下是否漏水，檢驗(yàn)確認(rèn)不漏水的裝置再用于制備凝膠。確認(rèn)不漏水后，倒出水，然后使其盡量流出，其實(shí)殘留的一點(diǎn)水并不影響結(jié)果，而且還會(huì)使電泳好的凝膠容易剝落下來(lái)。漏水的裝置制作的凝膠盡管可以使用，但它會(huì)造成電泳時(shí)候電流的分流，不但影響電流的效率， 而且還會(huì)使部分加樣孔的條帶歪曲。2）制膠時(shí)最好最后加入 AP,這樣可以避免偶然情況下不能馬上灌膠而導(dǎo)致膠的聚合，確 認(rèn)所有的東西準(zhǔn)備齊全了，再最后加入AP,混合均勻后馬上灌膠。一定要使配膠的幾種溶液混合均勻，這是制得性質(zhì)均一

19、的凝膠的前提。3 ）進(jìn)口的AP可以很快使膠凝聚。所以， AP的用量最好比書(shū)上推薦的用量少點(diǎn)，這樣可 以使膠的溶液慢慢聚合，這更有利于形成均勻一致的凝膠。也不會(huì)使操作變得手忙腳亂。4）有時(shí)候，梳子拉出以后，明明看不到加樣孔中有凝膠，但是就是加不進(jìn)去樣品，這主要 是由于梳子與較大的那塊玻璃之間的縫隙中存留的制膠溶液凝聚后形成的很薄的一層凝膠 造成的。由于很薄，當(dāng)梳子拉出后，它就會(huì)和玻璃分離，剛好將加樣孔的口封住了，如果用 20ul的加樣器加樣的話(huà)， 這層凝膠很容易將樣品堵在外面，只要將這層凝膠除去， 就可以順利加樣了。如果用專(zhuān)門(mén)的微量進(jìn)樣器，不會(huì)存在這樣的問(wèn)題。5）薄膜原因可能是由于梳子和slide的厚度不是十分一致，而這可能是無(wú)法避免的。除此之外，也有由于拔出梳子時(shí)候造成的堵塞現(xiàn)象， 個(gè)人認(rèn)為，這樣的堵塞現(xiàn)象可以通過(guò)插入梳 子時(shí)先用水（配置電泳緩沖液的水）濕潤(rùn)梳子的方法避免，這樣還有利于形成整齊的加樣孔。 不管怎么做，一定要等膠完全聚合好了再拉出梳子。如果孔的形狀變化了，扭曲了，肯定會(huì)導(dǎo)致條帶不一致，結(jié)果不好。6） wangjun2002274主任的：加樣的時(shí)候也是用專(zhuān)門(mén)的微量進(jìn)樣器，是寧波出的，50ul容量,每次都是用20ul的上樣量。以前等膠干后拔出梳子，