菌種鑒定手段

1、.菌種鑒定手段（ 1）常規(guī)鑒定常規(guī)鑒定內(nèi)容有形態(tài)特征和生理生化特征。形態(tài)特征包括顯微形態(tài)和培養(yǎng)特征；理化特性包括營養(yǎng)類型、碳氮源利用能力、各種代謝反應(yīng)、酶反應(yīng)等。（ 2） BIOLOG 碳源自動分析鑒定BIOLOG 鑒定系統(tǒng)以微生物對不同碳源的利用情況為基礎(chǔ)， 檢測微生物的特征指紋圖譜，建立與微生物種類相對應(yīng)的數(shù)據(jù)庫。 通過軟件將待測微生物與數(shù)據(jù)庫參比，得出鑒定結(jié)果。該系統(tǒng)已獲美國 FDA 認(rèn)可，已逐步應(yīng)用于食品和飲品企業(yè)、環(huán)保、海洋生物 /水產(chǎn)品、制藥、農(nóng)業(yè)微生物、生物治理、化妝品、臨床等領(lǐng)域的微生物鑒定試驗中。BIOLOG 是一種微生物菌種快速鑒定系統(tǒng)，涉及革蘭氏陰性菌、革蘭氏陽性菌、厭氧

2、菌、酵母、絲狀真菌在內(nèi)近 2000 種微生物。（ 3）分子生物學(xué)鑒定應(yīng)用分子生物學(xué)方法從遺傳進(jìn)化角度闡明微生物種群之間的分類學(xué)關(guān)系， 是目前微生物分類學(xué)研究普遍采用的鑒定方法。 CICC 擁有微生物菌種分類鑒定的分子生物學(xué)實(shí)驗室， 配有 PCR 儀、高速冷凍離心機(jī)、 電泳儀、 HPLC、凝膠成像系統(tǒng)、紫外控溫分析系統(tǒng)等先進(jìn)儀器設(shè)備，以及DNAMAN 、BIOEDIT 、CLUSTALX 、TREEVIEW 等序列分析軟件。目前 CICC 可采用核酸序列分析法分析細(xì)菌 16S rDNA/16S-23S rDNA 區(qū)間序列、酵母 18S rDNA/26S rDNA（D1/D2 ）序列及絲狀真菌的

3、18S rDNA/ ITS1-5.8S-ITS2 序列，提供科學(xué)的鑒定結(jié)果。（ 4） API 細(xì)菌數(shù)值鑒定系統(tǒng)API 鑒定系統(tǒng)涵蓋 15 個鑒定系列，約有 1000 種生化反應(yīng)，目前已可鑒定超過600種的細(xì)菌。鑒定過程中， 可根據(jù)細(xì)菌所屬類群選擇適當(dāng)?shù)纳砩b定系列， 通過軟件將待測細(xì)菌與數(shù)據(jù)庫參比，得出鑒定結(jié)果。CICC 目前可應(yīng)用 API 50CH 系列、 API 20 E 系列、 API Staph 系列對乳酸桿菌（ Lactobacillus sp.）和相關(guān)細(xì)菌、芽孢桿菌（ Bacillus sp.）、葡萄球菌屬（ Staphylococcus sp）.、微球菌屬（ Micrococ

4、cus sp.）和庫克菌屬（ Locuria sp.）進(jìn)行鑒定。（ 5）功能性分析及功能基因CICC 不斷致力于工業(yè)微生物資源的功能及其功能基因研究， 目前通過木聚糖酶、纖維素酶、葡萄糖異構(gòu)酶、 -甘露聚糖酶等功能基因的克隆進(jìn)行菌種產(chǎn)酶的功能性分析。應(yīng)用 gyrA 、atpD 及 pheS等看家基因于微生物菌種鑒定，在某些種、亞種、株間有較好的分辨效果。（ 6） RAPD、SSCP技術(shù).隨著微生物菌種應(yīng)用的進(jìn)一步發(fā)展， 在食品安全管理、 生物產(chǎn)品出口認(rèn)證、 知識產(chǎn)權(quán)保護(hù)等行業(yè)需求日益增加， 微生物菌種株水平的鑒別技術(shù)成為一個迫切需要解決的問題。CICC 采用隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA（Randoml

5、y amplified polymorphism DNA ，RAPD ）技術(shù)和單鏈構(gòu)象多態(tài)性 (Single Strand Conformation Polymorphism，SSCP）技術(shù)對微生物菌株進(jìn)行鑒別。如采用 RAPD 技術(shù)能夠?qū)ν痪N原始菌株與誘變菌株進(jìn)行鑒別，對誘變菌株知識產(chǎn)權(quán)保護(hù)具有重要意義；采用 SSCP技術(shù)進(jìn)行工業(yè)酒精酵母菌株的鑒別， 此技術(shù)結(jié)合菌株發(fā)酵特性， 在酒類生產(chǎn)的質(zhì)量控制方面起到積極作用。（ 7） TLC 薄層層析CICC 將 TLC 薄層層析技術(shù)應(yīng)用于微生物菌種鑒定，進(jìn)行細(xì)菌、放線菌細(xì)胞壁化學(xué)組分分析（氨基酸、糖），作為劃分屬特征的重要鑒定技術(shù)手段，起到了良好

6、的輔助作用。（ 8）全細(xì)胞脂肪酸分析鑒定系統(tǒng)采用 Sherlock 全自動細(xì)菌鑒定系統(tǒng)， 通過對不同菌株的脂肪酸圖譜進(jìn)行分析， 并與標(biāo)準(zhǔn)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對， 來鑒定細(xì)菌及酵母。 該技術(shù)是細(xì)菌或酵母種水平鑒定的有效手段之一。（ 9）（ GC）mol及 DNA/DNA 雜交CICC 通過采用 DU800 核酸蛋白分析儀測定Tm 值，從而得到微生物菌株的（G C）mol，并與模式菌株進(jìn)行 DNA/DNA 同源性分析，該鑒定技術(shù)手段是多相鑒定的重要組成部分。（ 10）實(shí)時熒光定量 PCR實(shí)時熒光定量 PCR 儀是特異性靶基因檢測與定量的一體化系統(tǒng)，其將PCR 熱循環(huán)、熒光檢測和各種應(yīng)用分析軟件結(jié)合在一起，

7、可以動態(tài)觀察 PCR 每一循環(huán)各反應(yīng)管中 PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物逐漸增加的情況。根據(jù)熒光強(qiáng)度確定 PCR 產(chǎn)物的定量法主要有熒光染料（ SYBR Green I）法和熒光探針（ Taqman probes）法。與常規(guī)PCR 相比，它具有特異性更強(qiáng)、有效解決 PCR 污染問題、自動化程度更高等特點(diǎn)。實(shí)時熒光定量 PCR 技術(shù)目前已得到廣泛應(yīng)用，包括基于相對定量分析的基因表達(dá)分析，以標(biāo)準(zhǔn)曲線為基礎(chǔ)的菌株絕對定量分析，定性的 PCR 擴(kuò)增后核酸序列的 SNP 基因型分析，以及以陽性內(nèi)對照為基礎(chǔ)的陽性 /陰性結(jié)果判定等。（ 11）微生物菌群分析（ DGGE）DGGE(denaturing gradient

8、gel electrophoresis)，即變性梯度凝膠電泳， 是根據(jù) DNA 在不同濃度的變性劑中解鏈行為的不同而導(dǎo)致電泳遷移率發(fā)生變化， 從而將片段大小相同而堿基組成不同的 DNA 片段分開。 DGGE 已廣泛用于分析自然環(huán)境中細(xì)菌、藍(lán)細(xì)菌、古菌、微型真核生物、真核生物和病毒群落的生物多樣性。這一技術(shù)能夠提供群落中優(yōu)勢種類信息并同時分析多個樣品， 具有可重復(fù)和操作簡單.等特點(diǎn)，適合于調(diào)查種群的時空變化， 并且可通過對條帶的序列分析或與特異性探針雜交分析鑒定群落組成。（ 12）微生物菌群分析（克隆文庫構(gòu)建）當(dāng)微生物菌群中含有不可培養(yǎng)或難培養(yǎng)菌種， 且其豐度較低時， 要全面解析菌群結(jié)構(gòu)及多樣性

9、，只采用傳統(tǒng)的平板分離或 PCR-DGGE 分析難以達(dá)到理想結(jié)果，這時可以結(jié)合構(gòu)建 16S rDNA 克隆文庫的方法。細(xì)菌 16S rDNA 擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng) 0.8的瓊脂糖凝膠電泳， EB 染色，在 UV 下顯現(xiàn)，從膠上切取 DNA 條帶，經(jīng)純化后，鏈接到 pGEM?-T Easy 載體，并轉(zhuǎn)化入大腸桿菌（ Escherichia coli）。待長出白色菌落后，挑選白色菌落進(jìn)行菌落 PCR-DGGE（16S rDNA V3）輔助篩選，得到特定菌群中的所有克隆菌， 再經(jīng)質(zhì)粒提取， 基因測序后， 便可得到特定微生物菌群信息。（ 13）細(xì)菌呼吸醌組分測定細(xì)菌細(xì)胞膜上的呼吸醌有甲基萘醌（ menaquin

10、one， MK ）和泛醌（ ubiquinone，輔酶 Q）。對革蘭氏陽性的放線菌而言，通常只含有甲基萘醌。常用來分析呼吸醌的方法有薄板層析法和高壓液相色譜法等。 醌分子中的多烯側(cè)鏈長度及氫飽和度對于細(xì)菌具有重要的分類學(xué)意義。（ 14）細(xì)菌磷酸類脂分析磷酸類脂（ phospholipioides）屬極性脂（ polar lipid ），與蛋白質(zhì)、糖等構(gòu)成細(xì)胞膜，對于物質(zhì)運(yùn)輸、 代謝及維持正常的滲透壓都有重要作用。 不同屬菌的磷酸類脂組分是不同的， 它是鑒別屬的重要特征之一， 是化學(xué)分類項目中不可缺少的分類指征。磷脂種類很多，對于放線菌而言，具有分類學(xué)意義的磷酸類脂有 5 種：磷脂酰乙醇胺（phosphatidyl ethanolamine，PE）、磷脂酰膽堿（phosphatidyl choline，P