四環(huán)素金霉素強力霉素殘留量的測定高效液相色譜熒光檢測法

1、ICS 67.050X 04DB33浙江省地方標(biāo)準(zhǔn)DB33/T 6912008水產(chǎn)品中土霉素、四環(huán)素、金霉素和強力霉素殘留量的測定 高效液相色譜熒光檢測法Determination of Oxytetracycline, Tetracycline,Chlortetracycline and Doxycycline residues in aquatic productHPLC with fluorescence detector2008-03-12 發(fā)布2008-04-12 實施浙江省質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局發(fā)布DB33/T 691 2008前言本標(biāo)準(zhǔn)附錄 A為資料性附錄。本標(biāo)準(zhǔn)由浙江省水產(chǎn)標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委

2、員會提出并歸口。本標(biāo)準(zhǔn)起草單位：浙江省海洋水產(chǎn)品質(zhì)量檢驗中心、舟山市富丹旅游食品有限責(zé)任公司。本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人：王萍亞、周勇、張薇英、黃鸝、戴意飛、王維潔、江旭華。IIDB33/T 691 2008水產(chǎn)品中土霉素、 四環(huán)素、 金霉素和強力霉素殘留量的測定 - 高效液相色譜熒光檢測法1 范圍本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了水產(chǎn)品中土霉素、四環(huán)素、金霉素、強力霉素殘留量的高效液相色譜熒光測定方法。本標(biāo)準(zhǔn)適用于水產(chǎn)品中土霉素、四環(huán)素、金霉素、強力霉素殘留量的測定。2規(guī)范性引用文件下列文件中的條款通過本標(biāo)準(zhǔn)的引用而成為本標(biāo)準(zhǔn)的條款。凡是注日期的引用文件，其隨后所有的修改單（不包括勘誤的內(nèi)容）或修訂版均不適用于本標(biāo)準(zhǔn)，然而

3、，鼓勵根據(jù)本標(biāo)準(zhǔn)達(dá)成協(xié)議的各方研究是否可使用這些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本適用于本標(biāo)準(zhǔn)。GB/T 6682分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法3原理樣品經(jīng)檸檬酸緩沖液提取，正己烷脫脂，固相萃取柱凈化，用高效液相色譜熒光檢測器檢測，外標(biāo)法定量。4 試劑與材料4.1除另有規(guī)定外，所有試劑均為分析純，實驗用水應(yīng)符合GB/T 6682 中一級水標(biāo)準(zhǔn)。4.2甲醇：色譜純。4.3正己烷。4.4檸檬酸。4.5磷酸氫二鈉（ Na2 HPO4）。4.6乙二胺四乙酸二鈉（ EDTA-2Na ）。4.7磷酸二氫鈉（ NaH 2PO4?2H 2O）。4.8磷酸二氫鉀（ KH 2PO4）。4.9咪唑。4

4、.10醋酸鎂。4.11冰醋酸：優(yōu)級純。4.12檸檬酸緩沖液：準(zhǔn)確稱取檸檬酸（4.3） 21.0g，用水溶解稀釋至1000mL （ A 液）。準(zhǔn)確稱取磷酸氫二鈉（ 4.4） 71.6g，用水溶解稀釋至1000mL （ B 液）。準(zhǔn)確稱取乙二胺四乙酸二鈉（4.5） 1.86g，用307mL A 液和 193mLB 液溶解混勻。4.130.01mol/L 磷酸二氫鈉溶液：準(zhǔn)確稱取1.56g 磷酸二氫鈉 (4.6) ，加適量水溶解，定容至1000mL 。4.141.36%磷酸二氫鉀溶液：準(zhǔn)確稱取13.6g 磷酸二氫鉀（ 4.7），加適量水溶解，定容至1000mL 。4.15咪唑緩沖溶液：準(zhǔn)確稱取68.

5、06 g 咪唑（ 4.8）、 0.37g 乙二胺四乙酸二鈉（ 4.5）及 10.27 g 醋酸鎂（ 4.9）溶于 800 mL 水中，用冰醋酸（4.10）調(diào) pH 至 7.2，再用水定容至1000mL ，以微孔濾膜（ 0.45 m）過濾后備用。4.16標(biāo)準(zhǔn)品：土霉素（ OTC）、四環(huán)素（ TC）、金霉素（ CTC）、強力霉素（ DOTC），純度 99%。4.17混合標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液： 準(zhǔn)確稱取土霉素10.0mg、四環(huán)素 10.0mg、金霉素 20.0mg ，強力霉素20.0mg ，溶于磷酸二氫鈉（ 4.12）溶液中，定容至100.0mL ，此溶液每毫升含土霉素100 g、四環(huán)素100 g、1DB3

6、3/T 691 2008金霉素200 g、強力霉素 200 g。本溶液于 0 4保存，一周內(nèi)有效。4.18混合標(biāo)準(zhǔn)中間溶液：準(zhǔn)確移取4.16 中的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液10.0mL ，用水定容至 100.0mL ，配成每毫升含土霉素10 g、四環(huán)素 10 g，金霉素 20 g、強力霉素20 g 的混合標(biāo)準(zhǔn)中間溶液。4.19混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液：以混合標(biāo)準(zhǔn)中間溶液（4.10）配制土霉素、四環(huán)素標(biāo)準(zhǔn)使用濃度系列：0.05、0.25、0.50、1.0、2.5、 5.0 g/mL；以混合標(biāo)準(zhǔn)中間溶液（ 4.10）配制金霉素、強力霉素標(biāo)準(zhǔn)使用濃度系列： 0.10、 0.50、 1.0、 2.0、 5.0、 10.0g

7、/mL。此標(biāo)準(zhǔn)工作液臨用時現(xiàn)配。4.20微孔濾膜， 0.45 m。5 儀器與設(shè)備5.1高效液相色譜儀：配有熒光檢測器。5.2 pH 計。5.3電子天平：感量為0.0001g 和 .01g。5.4高速組織搗碎機。5.5聚丙烯離心管。5.6均質(zhì)器： 10000 rpm 。5.7離心機： 5000 rpm 。5.8固相萃取柱： Waters Oasis HLB 小柱（ 6mL ， 200mg）或同類型小柱。5.9固相萃取裝置帶負(fù)壓抽濾器。5.10旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀。6 分析步驟6.1樣品制備從原始樣品中取出部分有代表性的樣品，高速組織搗碎機（5.4 ）搗碎。四分法縮分出不少于500g樣品，混勻，均分成兩份。

8、裝入清潔容器，加封，標(biāo)明標(biāo)記。-18 以下冷凍保存。6.2提取稱取約 5g 樣品（精確至 0.01g）置于 50mL 聚丙烯離心管 （ 5.5）中，加入檸檬酸緩沖液 （ 4.11）30mL ，以 10000rpm 均質(zhì) 3min ，再于室溫下以 3000 rpm 離心 10min ，上清液移入 100mL 分液漏斗中，殘留物用 20mL 檸檬酸緩沖液同法均質(zhì)1-3min（ 10000rpm），3000 rpm 離心 10min ，合并上清液于 100mL 分液漏斗中，加入 20mL正己烷，振蕩 5min，靜置，水相轉(zhuǎn)移至50mL 容量瓶中，用檸檬酸緩沖液定容至刻度備用。6.3 凈化固相萃取小柱

9、（5.8）預(yù)先依次用 10mL 甲醇、 10mL 蒸餾水、 5mL 檸檬酸緩沖液活化，取25mL 提取液 (6.2 提取 )上樣，控制速度在20 滴 /min ， 10mL 蒸餾水洗滌，真空抽干，再用15mL 甲醇洗脫，收集洗脫液于 100mL 的蒸發(fā)瓶中。40以下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至近干，用1mL 磷酸二氫鉀溶液（ 4.13）溶解，經(jīng)0.45m 微孔濾膜過濾，供液相色譜測定。6.4 色譜測定6.4.1色譜條件6.4.1.1色譜柱： C18 柱，粒度5 m， 4.6mm（ id）× 250mm，或性能相當(dāng)者。6.4.1.2檢測器：熒光檢測器，Ex=380nm ，Em=520nm 。6.4.1.

10、3流速： 1.0mL/min 。6.4.1.4進樣量： 50 L。6.4.1.5柱溫： 40。6.4.1.6流動相：咪唑緩沖溶液（4.14 ）甲醇 (78+22， v/v) 。6.4.2測定2DB33/T 691 2008標(biāo)準(zhǔn)工作溶液和樣液中待測組分響應(yīng)值均應(yīng)在儀器檢測線性范圍內(nèi)。標(biāo)準(zhǔn)工作溶液和樣液等體積參插進樣測定。在上述色譜條件下，土霉素的保留時間約為5.09 min ，四環(huán)素的保留時間約為6.85 min ，強力霉素的保留時間約為11.94 min ，金霉素的保留時間約為16.70 min 。標(biāo)準(zhǔn)品的色譜圖見附錄A。6.5空白試驗除稱取樣品外，均按上述測定條件和步驟進行。7 計算按式（

11、1）計算樣品中土霉素、四環(huán)素、金霉素、強力霉素的含量，計算結(jié)果需扣除空白值。2C iVX i（1）m式中：Xi 樣品中待測組分含量，單位為毫克每千克（mg/kg ）；Ci 樣品溶液中待測組分濃度，單位為微克每毫升（g/mL）；m樣品質(zhì)量，單位為克（g）；V樣品提取液最終定容體積，單位為毫升（mL ）。8 檢出限、回收率、精密度8.1檢出限本方法檢出限為土霉素 0.01mg/kg ，四環(huán)素 0.01mg/kg ，金霉素 0.03mg/kg ，強力霉素 0.03mg/kg 。 8.2 回收率在樣品中分別添加0.02mg/kg 0.5mg/kg 土霉素、四環(huán)素、金霉素、強力霉素時，回收率均為70%120% 。8.3