烏頭簡(jiǎn)單序列重復(fù)區(qū)間擴(kuò)增條件的優(yōu)化

1、烏頭簡(jiǎn)單序列重復(fù)區(qū)間擴(kuò)增條件的優(yōu)化<                          作者：張?jiān)婪?萬(wàn)里翔 侯大斌【摘要】   目的保證烏頭ISSR-PCR的穩(wěn)定性、提高對(duì)烏頭遺傳多樣性,親緣關(guān)系分析、種質(zhì)鑒定的可靠性。方法收集西南地區(qū)23個(gè)烏頭材料，以Mg2+，dNTP，引物和聚合酶建立L9（34）正交設(shè)計(jì)，并同時(shí)考察模板和甲酰

2、胺濃度及退火溫度，建立適宜的ISSR-PCR體系。結(jié)果以Mg2+2.0 mmol/L、dNTP 0.25 mmol/L、引物0.3 mol/L、rTaq酶1U、模板1.5 ng/l、甲酰胺2%及退火溫度（Tm-3）的ISSR反應(yīng)體系最優(yōu)。結(jié)論實(shí)驗(yàn)建立的ISSR-PCR體系反應(yīng)穩(wěn)定，能用于烏頭的ISSR分析。 【關(guān)鍵詞】   烏頭 簡(jiǎn)單序列重復(fù)區(qū)間 優(yōu)化Abstract：ObjectiveTo keep the stability of ISSR_PCR and reliability of genetic diversity, sibship analysis and source

3、assessing for Aconitum carmichael Dexb. Methods23 kinds Aconitum carmichael Dexb. samples in southwest of China were selected to carry out 4 factors(Mg2+，dNTP，primer and Taq polymerase) and 3 levels(concentration) orthogonal design experiment. Meanwhile separated experiments for forma-mide, template

4、 concentration and annealing temperature affect were carried out.ResultsISSR_PCR reaction system could be well established through orthogonal design experiment by 23 samples ISSR-PCR reaction assessing.ConclusionThe optimized ISSR-PCR reaction system can be stably used for Aconitum carmichael Dexb.

5、genetic analysis.Key words：Aconitum carmichael Dexb.;   Inter-Simple Sequence Repeat;   Optimization    烏頭Aconitum carmichael Dexb為毛茛科烏頭屬植物，別名五毒根1。為毛茛科植物烏頭，在 中國(guó) 西南地區(qū)四川盆地有較大栽培面積，其母根叫烏頭或川烏，為鎮(zhèn)痙劑，可用于治風(fēng)痹、風(fēng)濕神經(jīng)痛。側(cè)根（子根）入藥，稱附子(Radix Aconiti Lateralis Preparata)。  

6、 ISSR-PCR技術(shù)，簡(jiǎn)單序列重復(fù)區(qū)間(Inter-Simple Sequence Repeat，ISSR)，是Zietkiewicz等21994年創(chuàng)建的，引物是根據(jù)基因組內(nèi)某一重復(fù)序列設(shè)計(jì)出一系列特異性引物，包括雙核苷酸、三核苷酸和四核苷酸等微衛(wèi)星片段。這種技術(shù)除具有RAPD優(yōu)點(diǎn)外，比RAPD技術(shù)更具有明確的針對(duì)性，同時(shí)由于PCR擴(kuò)增條件中的退火溫度較高(50左右)，保證了PCR擴(kuò)增的可重復(fù)性，結(jié)合了SSR和RAPD的優(yōu)點(diǎn)?？梢钥焖佟⒏咝Ш挽`敏地檢測(cè)出基因組DNA的多態(tài)性, 有很好的重復(fù)性, 操作簡(jiǎn)單、成本較低, 適合大樣本的檢測(cè)3。關(guān)于野生烏頭的RAPD的優(yōu)化與遺傳分析已有報(bào)道4，川烏I

7、SSR遺傳分析也有報(bào)道5。因此建立穩(wěn)定好、重復(fù)性強(qiáng)的ISSR反應(yīng)體系對(duì)烏頭遺傳學(xué)、種質(zhì)資源、分類學(xué)與種系發(fā)生學(xué)等方面具有重要意義。 1  材料    從四川綿陽(yáng)安縣曉壩（海拔850 m）已建立的附子資源圃200份附子種質(zhì)資源類型中篩選出優(yōu)勢(shì)代表材料23份（見(jiàn)表1），上年種植，200707采摘頂部功能嫩葉數(shù)片，置4保存，提取DNA所用。表1  烏頭樣品引種來(lái)源（略） 2  方法 2.1  DNA提取采用陳亮6并稍加改良的CTAB方法提取DNA，通過(guò)紫外和瓊脂糖電泳檢測(cè)其純度、濃度和完整性后，用以ISSR-PCR優(yōu)化實(shí)驗(yàn)。2.2

8、  反應(yīng)體系正交實(shí)驗(yàn) 采用L9(34)正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，對(duì)Mg2+（大連TaKaRa提供），dNTP（TaKaRa），引物（上海生工提供）和rTaq聚合酶（TaKaRa）進(jìn)行4因素3水平7篩選，方案如表2。根據(jù)表2制備總體積為20 l的反應(yīng)體系，體系中還存在1×PCR緩沖液和30 ng模板DNA，其余用過(guò)柱超純水補(bǔ)充，引物選用哥倫比亞UBC系列847號(hào)引物，在德國(guó)Eppendorf Mastercycler Gradient儀上擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?4預(yù)變性3 min，94變性30 s，Tm8473(52.8-3=49.8)退火45 s，72延伸2 min，40個(gè)循環(huán)；72

9、延伸10 min，4保存。    擴(kuò)增結(jié)束后，PCR產(chǎn)物在1.5%的含溴化乙錠(0.5 g/ml)瓊脂糖凝膠電泳，電極緩沖液為0.5×TBE,電壓3V/cm,電泳結(jié)束在Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)分析并拍照。2.3   模板DNA濃度篩選   應(yīng)用 表2中最佳組合，選用引物UBC846，20 l體系中模板濃度分別置為0.5，1.5，3.0 ng/l和6 ng/l共4個(gè)濃度處理。2.4  甲酰胺對(duì)擴(kuò)增穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)選定的正交最佳反應(yīng)體系,選用引物UBC846，20 l體系中設(shè)空白對(duì)照；甲酰胺(綿陽(yáng)榮盛AR)濃度分

10、別為0.5%，1.0%，2.0%和4.0%。表2  ISSR-PCR正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)（略）2.5  不同復(fù)性溫度影響   根據(jù)正交最佳體系，結(jié)合引物UBC846用梯度PCR儀設(shè)定PCR退火溫度梯度范圍4555。 3  結(jié)果 3.1  PCR正交實(shí)驗(yàn)分析PCR擴(kuò)增結(jié)果是由Mg2+，dNTP引物和DNA聚合酶綜合交互共同決定的，從圖1中可以看出，各種因素的濃度差異，擴(kuò)增結(jié)果有顯著的差別。其中8，7，9號(hào)譜帶依次增強(qiáng)，其原因是由于rTaq酶的增加。2，4，8酶量相同，PCR產(chǎn)物隨Mg2+和dNTP的濃度的增加而增加，當(dāng)濃度過(guò)高時(shí)候就會(huì)產(chǎn)生條帶亮

11、度增大，出現(xiàn)模糊的邊緣，甚至產(chǎn)生背景使條帶的混連。3號(hào)譜帶較弱可能是因?yàn)镸g2+濃度過(guò)低而dNTP濃度偏高，由于dNTP能夠和Mg2+結(jié)合使得游離Mg2+進(jìn)一步減少，影響了rTaq的活性。5，7，9號(hào)譜帶彌散是因?yàn)镸g2+濃度過(guò)高而引起。在dNTP濃度相同時(shí)，過(guò)量的酶或Mg2+會(huì)造成嚴(yán)重的背景干擾和非特性產(chǎn)物的擴(kuò)增。第6泳道非常清晰，背景很小。通過(guò)比較以特異譜帶多態(tài)性高、背景干擾低、主帶清晰、副帶明顯為原則，同時(shí)考慮實(shí)驗(yàn)成本，即采用Mg2+2.0 mmol/L，dNTP 0.25 mmol/L，引物0.3 mol/L，rTaq聚合酶1 U的最佳20 l反應(yīng)體系。圖1  正交設(shè)計(jì)ISS

12、R_PCR反應(yīng)結(jié)果（略）3.2   模板濃度的確定   由圖2可以見(jiàn)，當(dāng)20 l反應(yīng)體系中，模板量從0.56 ng/l均有擴(kuò)增，但到了濃度達(dá)到6 ng/l條帶變得異常模糊，1.5 ng/l濃度的模板擴(kuò)增效果很清楚，因此反應(yīng)體系中模板濃度確定為1.5 ng/l。圖2  不同模板濃度對(duì)擴(kuò)增影響（略）3.3  甲酰胺濃度的確定在篩選引物的時(shí)候，發(fā)現(xiàn)有些引物尤其是Tm較低的非錨定引物，擴(kuò)增時(shí)有非特異拖帶，其原因是引物在模板上滑動(dòng)的結(jié)果。因此在體系中加入甲酰胺，結(jié)果如圖3，表明0.5%濃度過(guò)低，幾乎無(wú)效果，其它濃度均有一定的效果，其中以2%降低背景效果最明顯。圖3  不同甲酰胺濃度對(duì)擴(kuò)增影響（略）3.4  退火溫度的確定梯度退火結(jié)果(圖4)顯示,