豬傳染性胃腸炎病毒TaqMan熒光定量RT_PCR檢測方法的建立_圖文

1、畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào) 2007, 38(5 :476481A ct a V eteri nari a et Zootechnica S i nica豬傳染性胃腸炎病毒 T aqMan 熒光定量 RT 2PCR 檢測方法的建立白興華 1, 馮 力 13, 陳建飛 1, 時(shí)洪艷 1, 孫東波 1, 吳波平 1,2, 高秀春 1,2(1. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所 獸醫(yī)生物技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室豬傳染病研究室 ,哈爾濱 150001; 2. 東北農(nóng)業(yè)大學(xué) , 哈爾濱 150030摘 要 :根據(jù)豬傳染性胃腸炎病毒和豬肌動(dòng)蛋白的基因序列設(shè)計(jì)合成了引物和探針 , R T 2PCR 反 應(yīng)條件的優(yōu)化 , 建立了

2、TaqMan 熒光定量 R T 2PCR 檢測 T GEVR T 2PCR 方法 、 T GEV 抗原快速檢測試劑盒比較 。 結(jié)果 , L , 且具有很好的特 異性和重復(fù)性 , 而常規(guī) R T 2PCR 方法只能檢測到(檢出 17份 比常規(guī) R T 2PCR 方法 ( 和 (免疫層析法 , 檢出 10份 的敏感性 高 。關(guān)鍵詞 :; 熒光定量 R T 2PCR中圖分類號(hào) 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 :A 文章編號(hào) :036626964(2007 0520476206Development of T aqMan Fluorescence Q uantitative RT 2PCR Assay forDetect

3、ion of T ransmissible G astroenteritis Virus of SwineBA I Xing 2hua 1,FEN G Li 13,C H EN Jian 2fei 1,SH I Hong 2yan 1,SUN Dong 2bo 1,WU Bo 2ping 1,2, GAO Xiu 2chun 1,2(1. Dep artment of S w i ne I nf ectious Diseases , N ational Key L aboratory of V eteri nary B iotechnolog y , H arbi n V eteri nary

4、 Research I nstit ute , Chi nese A ca dem y ofA g ricult ural S ciences , H arbi n 150001, Chi na; 2. N ort heast A g ricult uralU ni versit y , H arbi n 150030, Chi na Abstract :The p rimers and probes were designed and synt hesized according to t he sequences of t ransmissible gast roenteritis vir

5、us and 2actin , and t hen reaction requirement s were optimized to develop a TaqMan fluorescence quantitative R T 2PCR assay. Meanwhile ,37field samples were de 2 tected and t he result s were compared wit h t hat of routine R T 2PCR and antigen rapid test kit. It was showed t hat t he fluorescence

6、quantitative R T 2PCR assay could detect 15. 3copies/L of plas 2 mid DNA and it s specificity and rep roducibility were very good ,while t he sensitivity of t he routine R T 2PCR was 1. 53×103copies/L. The result s of field test also showed t hat it s sensitivity was higher t han t hat of t he

7、routine R T 2PCR and T GEV antigen rapid test kit (chromatograp hic im 2 munoassay .K ey w ords :t ransmissible gast roenteritis virus of swine ; TaqMan probe ; fluorescence quantitative R T 2PCR收稿日期 :2006207228作者簡介 :白興華 (19822 , 男 , 山東莒南人 , 主要從事病毒分子生物學(xué)診斷研究3通訊作者 :馮 力 ,E 2mail :fengli_h163. com 5期 白興

8、華等 :豬傳染性胃腸炎病毒 TaqMan 熒光定量 R T 2PCR 檢測方法的建立 豬傳染性胃腸炎 (Transmissible gastroenteritis of swine , T GE 是由豬傳染性胃腸炎病毒 (Trans 2 missible gast roenteritis virus of swine , T GEV 引起 的一種高度接觸傳染性的腸道疾病 , 以引起 1周齡 以下仔豬嘔吐 、 水樣腹瀉和高死亡率 (通常 100% 為主要特征 。 T GEV 屬冠狀病毒科冠狀病毒屬成 員 , 是單股正鏈 RNA 病毒 , 基因組全長 28. 6kb , 共 有 7個(gè)開放閱讀框 (

9、ORF , 其中編碼核衣殼蛋白的 ORF 6高度保守 1,2。目前 T GEV 只有一個(gè)血清 型 。 T GEV 自 1945年在美國首次報(bào)道后 , 迅速在 北美 、 歐洲 、 亞洲等地蔓延 , 成為一種世界性的豬病 , 給養(yǎng)豬業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟(jì)損失 。 由于它主要引起 1周齡以下仔豬幾乎 100%死亡 ,。目 前 , 檢測 T GEV 、 免 疫熒光抗體試驗(yàn) 、 、 電鏡觀察 、 免疫電 鏡觀察 、 EL ISA 方法 、 核 酸探 針雜交 技術(shù) 和 R T 2 PCR 等 。 1997年 Paton 等 3首先建立了 R T 2PCR 方法檢測 T GEV ;2000年 K im 等 4和

10、2003年 J ung 等 5分別建立了 T GEV 的 R T 2nPCR 檢測方法和多 重 R T 2nPCR 檢測方法 ;2005年 J ung 等 6又建立了 T GEV 的非放射性探針斑點(diǎn)雜交檢測方法 。但是 這些方法都不能滿足特定要求 。1995年美國 PE 公司成功研制了 TaqMan 技 術(shù) ,1996年推出了首臺(tái)熒光定量 PCR 檢測儀 。熒 光定量 PCR 技術(shù)具有能定量 、 高敏感性 、 高特異性 、 高通量等優(yōu)點(diǎn) , 非常適用于病毒感染的檢測 , 尤其是 感染早期檢測 。本研究旨在應(yīng)用 TaqMan 探針建 立一種 T GEV 的熒光定量 R T 2PCR 檢測方法 ,

11、 用于 T GEV 的定量檢測 、 表達(dá)差異及感染后病毒在體內(nèi) 分布等研究 。1 材料與方法1. 1 病毒豬瘟病毒 (CSFV , 由豬傳染病研究室仇華吉 老師惠贈(zèng) ; 雞傳染性支氣管炎病毒 (IBV 由禽傳染 病研究室劉勝旺老師惠贈(zèng) ; 、 豬 輪狀病毒 (PRV (PEDV 均由Gene 3000熒光 定 量 PCR 儀 ; Eppen 2 dorf 分光光度計(jì) ; Eppendorf 金屬恒溫連接儀 。 質(zhì)粒提取試劑盒 , 購自上海生工生物工程有限 公司 ;M 2ML V 反轉(zhuǎn)錄酶購自 Promega 公司 ; Ex T aq 聚合酶 ,p MD 182T 載體均購自大連寶生物工程有 限

12、公司 ; T GEV 抗原快速檢測試劑盒 (免疫層析法 購自韓國 Animal Genetics 公司 。1. 3 引物與探針以本實(shí)驗(yàn)室保存的 T GEV 華毒株的 ORF6作 為靶基因設(shè)計(jì)了引物和 TaqMan 探針 , 目的片段 95 bp ; 同時(shí)本試驗(yàn)設(shè)置了內(nèi)參對照 2actin (2肌動(dòng)蛋 白 , 根據(jù) GenBank 上豬 2actin 的基因序列 (登錄 號(hào) :A Y550069 設(shè)計(jì)了內(nèi)參的引物與 TaqMan 探 針 , 目的片段 117bp 。引物和探針均由大連寶生物工程有限公司合 成 。 引物和探針序列見表 1。表 1 引物和探針序列T able 1 Sequences

13、of the primers and the probes名稱 Name 序列 Sequence 位置 Location 堿基數(shù) /bp Length T GEV 2F 5 2T GGGGA GA T GAA TCCACCAAAAC 23 4923T GEV 2R 5 2A GGGT TA T GGGGT T GAA GAA T GAA 23 14324T GEV 2P 5 FAM 2CGT GGTCGCTCCAA T TCCCGT GGT 2TAMRA 3 73242actin 2F 5 2GCA GCCA TCACAA TCCCCT T T 23 1706212actin 2R 5 2TC

14、TCAA GTCA GT GTACA GGTAA GC 23 1822242actin 2P 5 ROX 2CCTCCGCACCTCAACCCGCTCCTA 2ECL IPSE 3 1790241. 4 病毒 RNA 的提取及 cD NA 的合成RNA 提取 :按照 TRIzol (Invit rogen 公司 說明 書從 T GEV 細(xì) 胞 培 養(yǎng) 物 和 組 織 樣 品 中 提 取 總 RNA 。cDNA 的合成 (25L 體系 :用 13L DEPC 處 理的水溶解 RNA , 并加入 1L Oligo d T (18 (0. 5 774 畜 牧 獸 醫(yī) 學(xué) 報(bào) 38卷 g/L ,70

15、作用 5min , 迅速置冰上 。加入 5×M 2ML V 反轉(zhuǎn)錄 Buffer 5L ,dN TPs (2. 5mmol/L 4L ,M 2ML V (200U/L 1L , Ribonuclease In 2hibitor (40U/L 1L ,42 水浴中 1. 5h ,95 水浴中 10min , 置于 -20 待用 。1. 5 標(biāo)準(zhǔn)品的制備將 T GEV 和內(nèi)參的目的片段克隆到 pMD182T載體上并轉(zhuǎn)化到 T G1大腸桿菌中 , 搖菌提取質(zhì)粒 ,PCR 鑒 定 、 測 序 , 證 明 目 的 基 因 已 成 功 克 隆 入p MD182T 載體中 。 測定質(zhì)粒的 OD 2

16、60值 , 并換算質(zhì)粒濃度到拷貝數(shù) /L , -20 保存作為標(biāo)準(zhǔn)品備用 。1. 6 R eal time PCR 反應(yīng)條件的優(yōu)化用矩陣法對熒光定量 PCR 、度 、 Mg 2+,定量 PCR 反應(yīng)條件1. 7質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品 10, 在 Rotor 2Gene 3000熒光定量 PCR 儀上檢測 , 得出各自的動(dòng)力學(xué)曲線 , 儀器軟件自動(dòng)生成標(biāo)準(zhǔn)曲線 。1. 8 敏感性試驗(yàn)陽性質(zhì)粒 10倍梯度稀釋到最低濃度為每微升幾個(gè)拷貝 , 以此作為未知模板在 Rotor 2Gene 3000熒光定量 PCR 儀上檢測 , 得出熒光定量 PCR 所能檢出的最低模板拷貝數(shù) 。同時(shí) PCR 產(chǎn)物用 2. 5%瓊脂糖

17、凝膠電泳觀察 , 電泳結(jié)果作為常規(guī) R T 2PCR的敏感性與熒光定量 R T 2PCR 的敏感性進(jìn)行比較 。1. 9 特異性試驗(yàn)提取 CSFV 、 PRV 、 IBV 和 PEDV 的病毒 RNA并反轉(zhuǎn)錄得到 cDNA , 在 Rotor 2Gene 3000熒光定量 PCR 儀檢測 , 同時(shí)設(shè)陰 、 陽性對照 。1. 10 重復(fù)性試驗(yàn)用熒光定量 R T 2PCR 方法對來自遼寧 、 河南 、上海的 3份糞便樣品及 1份病毒的細(xì)胞培養(yǎng)物進(jìn)行批內(nèi)重復(fù)性試驗(yàn)和批間重復(fù)性試驗(yàn) 。 批內(nèi)試驗(yàn)每個(gè)樣品設(shè) 4個(gè)重復(fù) , 批間試驗(yàn)是在兩個(gè)不同的時(shí)間 (第1天和第 2天 對 4份樣品進(jìn)行檢測 。對檢測結(jié)果進(jìn)

18、行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 。1. 11 現(xiàn)地樣品的檢測對上海 、 廣州 、 內(nèi)蒙古 、 遼寧 、 河南等地豬場送檢的 37份糞便病料進(jìn)行處理 , 提取 RNA , 應(yīng)用熒光定量 R T 2PCR 方法檢測 。同時(shí)用常規(guī) R T 2PCR 方法和 T GEV 抗原快速檢測試劑盒檢測 , 比較三者檢測結(jié)果 。2 結(jié) 果2. 1 熒光定量 RT 2PCR 反應(yīng)條件的優(yōu)化PCR 反應(yīng)體系 (25L :篩選出最佳的引物 、 探 針 、 Mg 2+終濃度分別為 0. 4mol/L 、 0. 12mol/L 、 3mmol/L 。PCR 反應(yīng)條件 :95 1min ; 95 15s ,60 30s ,40個(gè)循環(huán) 。2.

19、 2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立如圖 1所示 3、 5分別是模板濃度 98×107、 2. 62×106、 5, 。 它們的循環(huán)閾值分別為 7. 55、 10182、 15. 04、 19. 38、 22. 07。圖 2為數(shù)據(jù)分析后儀 器自動(dòng)生成的標(biāo)準(zhǔn)曲線 , y 軸為循環(huán)閾值 , x 軸為質(zhì) 粒標(biāo)準(zhǔn)品的拷貝數(shù) 。標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率為 -3. 759, x 軸截距為 42. 860, 直線方程為 y =-3. 759lg x + 42. 860 。圖 1 標(biāo)準(zhǔn)品的動(dòng)力學(xué)曲線Fig. 1 Dynamic curve of the stand ards圖 2 圖 1對應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig. 2

20、Stand ard curve of f igure 1874 5期 白興華等 :豬傳染性胃腸炎病毒 TaqMan 熒光定量 R T 2PCR 檢測方法的建立 2. 3 敏感性試驗(yàn) 如表 2所示 , 熒光定量 R T 2PCR 能檢測出的模 板最低濃度為 15. 3拷貝 /L 。與常規(guī) R T 2PCR 相 比 :PCR 產(chǎn)物用 2. 5%瓊脂糖凝膠電泳觀察 , 模板濃 度為 1. 53×103拷貝 /L 標(biāo)準(zhǔn)品的 PCR 產(chǎn)物的電 泳帶很模糊 , 再低濃度的未檢出 (圖 3 。這說明熒 光定量 R T 2PCR 的敏感 性比 常規(guī) R T 2PCR 的 高 100倍 。表 2 熒光

21、定量 RT 2PCR 與常規(guī) RT 2PCR 敏感性比較T able 2 Sensitivity comp arison betw een the fluorescencequ antitative RT 2PCR and the routine RT 2PCR質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品濃度 /(Copies/L Concentration of the standard 熒光定量R T 2PCRR T 2T 2R T 2PCR1. 53×106+1. 53×105+1. 53×104+1. 53×103+1. 53×102+-1. 53×101+-

22、1. 5310-+. Positive ; -. Negative 16. 模板濃度分別為 1. 53×106、 1. 53×105、 1. 53×104、 1. 53×103、 1. 53×102、 1. 53×101拷貝 /L ; 7. 陰性對照 ;8. DL2000marker126. The concentrations of the templates :1.53×106, 1. 53×105,1. 53×104,1. 53×103,1. 53×102,1. 53×

23、101copies/L ; 7. Negative control ; 8. DL2000marker圖 3 PCR 產(chǎn)物電泳Fig. 3 The electrophoretic result of PCR products2. 4 特異性試驗(yàn)對 CSFV 、 PRV 、 IBV 和 PEDV 4種不同的病毒 分別提取病毒 RNA , 反轉(zhuǎn)錄后進(jìn)行熒光定量 PCR反應(yīng) , 其擴(kuò)增曲線均為水平線 , 即結(jié)果均為陰性 (圖4 , 說明該反應(yīng)具有很好的特異性 。4. 的動(dòng)力學(xué)曲of CSFV , PRV , IBV and Negative control ; 6. Positive control

24、 4 特異性試驗(yàn)Fig. 4 The result of the specif icity assay2. 5 重復(fù)性試驗(yàn)用來自遼寧 、 河南 、 上海的 3份糞便樣品及 1份 病毒的細(xì)胞培養(yǎng)物進(jìn)行批內(nèi)重復(fù)性試驗(yàn)和批間重復(fù)性試驗(yàn) , 并對檢測結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 , 結(jié)果如表 3、 4。 批內(nèi)重復(fù)性試驗(yàn)和批間重復(fù)性試驗(yàn)的變異系 數(shù)均小于 5%, 說明該方法具有很好的重復(fù)性 。 2. 6 現(xiàn)地樣品的檢測 對地方豬場送檢的 37份糞便病料進(jìn)行了熒光 定量 R T 2PCR 檢測 , 同時(shí)與常規(guī) R T 2PCR 方法和 T GEV 抗原快速檢測試劑盒相比較 , 結(jié)果如表 5。 在 37份待檢病料中

25、, 熒光定量 R T 2PCR 方法檢出 17份為陽性 , 常規(guī) R T 2PCR 方法檢出 12份為陽性 , T GEV 抗原快速檢測試劑盒檢出 10份為陽性 。其中 , 內(nèi)蒙古 、 遼寧和河南等地豬場的 7份病料病毒含 量比較高 ,3種方法均檢為陽性 ; 而廣州某豬場的 13份病料中 , 熒光定量 R T 2PCR 方法檢出 2份為陽 性 , 且病毒含量很低 , 其他 2種方法未檢出 。 這再次 表明熒光定量 R T 2PCR 方法的敏感性明顯高于常 規(guī) R T 2PCR 方法和 T GEV 抗原快速檢測試劑盒 。3 討 論熒光定量 PCR 是在 PCR 反應(yīng)過程中通過連續(xù) 監(jiān)測熒光信號(hào)的

26、強(qiáng)弱來即時(shí)測定特異性產(chǎn)物的量 , 并據(jù)此推斷目的基因的初始量 。 它綜合 PCR 技術(shù) 、 熒光標(biāo)記技術(shù) 、 激光技術(shù) 、 數(shù)碼顯相技術(shù)等于一體 , 因此具有很高的檢測靈敏度 ; 而且它的靶序列由引 物和探針雙重控制 , 特異性高 。 根據(jù)采用的熒光材974 畜 牧 獸 醫(yī) 學(xué) 報(bào) 38卷 表 3 批內(nèi)重復(fù)性試驗(yàn)T able 3 The intra 2assay reproducibility樣品 SampleCt Ct value重復(fù) 1重復(fù) 2重復(fù) 3重復(fù) 4平均 Ct 值A(chǔ)verage Ct value變異系數(shù) /%Coefficient of病毒載量 / (Copies/L 遼寧 22

27、. 3522. 5922. 2922. 8622. 52±0. 521. 156. 24×103河南 22. 9322. 4322. 0423. 4822. 72±1. 242. 735. 88×103上海 20. 9521. 9521. 6321. 5721. 52±0. 842. 239. 33×103細(xì)胞毒 20. 9021. 4621. 0821. 4921. 23±0. 291. 371. 96×106表 4 批間重復(fù)性試驗(yàn)T able 4 The inter 2assay樣品 SampleCt 值 Ct

28、 value第 1天 第 2天value/%Coefficient of病毒載量 / (Copies/L 遼寧 24. 52±0. 411. 676. 24×103河南 24. 0424. 28±0. 341. 405. 88×103上海 23. 22. 5923. 83±0. 331. 389. 33×103細(xì)胞毒 21. 2021. 0621. 13±0. 100. 471. 96×106表 5 現(xiàn)地試驗(yàn)結(jié)果T able 5 The results of f ield test病料來源 Sample份數(shù)Amou

29、nts熒光定量 R T 2PCRThe fluorescence常規(guī) R T 2PCRThe routine R T 2PCR試劑盒 The kit內(nèi)蒙古 33/33/33/3遼寧 22/22/22/2河南 22/22/22/2上海 178/175/173/17廣州 132/130/130/13總量 3717/3712/3710/37料不同 , 熒光定量 PCR 分為 S Y BR Green I 染料法 、 TaqMan 探針法 、 分子信標(biāo)法 、 雜交探針法等 7。其 中 ,S Y BR Green I 染料與任何雙鏈 DNA 都結(jié)合 , 易產(chǎn)生非特異性熒光 , 而 TaqMan 探針法對

30、目標(biāo)序 列有很高的特異性 , 與分子信標(biāo)法等相比設(shè)計(jì)相對 簡單 , 且重復(fù)性好 , 因此被普遍使用 。 本研究利用了 TaqMan 探針法 。熒光定量 PCR 由于其具有能定 量 、 靈敏度高和重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn) , 被廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué) 檢測 、 基因表達(dá)研究 、 病原體檢測 、 病毒荷載量測定 和食品衛(wèi)生檢疫等方面 。但是熒光定量 PCR 儀器 和探針的合成價(jià)格昂貴 , 檢測成本比較高 , 這也限制 了它的普遍應(yīng)用 。熒光定量 PCR 技術(shù)應(yīng)用于 T GEV 檢測 , 能在 病毒隱性感染 、 發(fā)病豬早期快速確診和實(shí)時(shí)監(jiān)測等 方面發(fā)揮重要的作用 。但是國內(nèi)外的報(bào)道較少 。 Chen 等 8以 Inv

31、it rogen 公司的 L U X (Light upon extensio n ,L U X 引物為基礎(chǔ)建立了檢測 T GEV 的 熒光定量 PCR 方法 , 敏感性比常規(guī) R T 2PCR 方法 提高了 10倍 。 Escors 等 9利用建立的熒光定量 PCR 方法以及免疫純化技術(shù)研究 T GEV 病毒蛋白 合成和 RNA 殼體化的過程 。本研究以高度保守的 ORF6為靶基因成功建 立了 T GEV 的 TaqMan 熒光定量 R T 2PCR 檢測方 法 , 并應(yīng)用于臨床現(xiàn)地病料的檢測 。本方法的檢測 敏感性達(dá)到 15. 3拷貝 /L , 比常規(guī) R T 2PCR 的敏感 性高了 1

32、00倍 , 優(yōu)于 Invit rogen 公司的 L U X 引物 法 。 與常規(guī) R T 2PCR 相比 , 本方法特異性更高 , 假 陽性低 , 不易污染 , 且擴(kuò)增與檢測一步完成 , 不需要084 期 5 對產(chǎn)物進(jìn)行電泳等后期處理 ,操作更簡便 。 熒光定量 R T2PCR 檢測 T GEV 的方法不僅能 進(jìn)行定性檢測 ,更能準(zhǔn)確定量 ,這就為 T GEV 感染 、 增殖規(guī)律的研究及病毒復(fù)制轉(zhuǎn)錄過程的研究奠定了 重要的基礎(chǔ) 。另外 , 熒光定量 PCR 技術(shù)能對點(diǎn)突 變、 等位基因和單核苷酸多態(tài)性 ( SN P 進(jìn)行分析 ,本 方法的建立也為建立區(qū)分 T GEV 強(qiáng)弱毒的熒光定 量 PC

33、R 方法奠定了重要的基礎(chǔ) 。 參考文獻(xiàn) : 1 ,劉景華 . 動(dòng)物病毒學(xué) M . 第 2 版 . 北京 : 科學(xué) 殷 震 出版社 ,1997. 681688. 2 斯特勞 B E. 豬病學(xué) M . 趙德明 ,張中直 ,沈建忠 , 譯 . 第 8 版 . 北京 : 中國農(nóng)業(yè)大學(xué)出版社 ,2000. 305338 . 3 Paton D , Ibata G , Sands J . Detection of t ransmissible f ro m po rcine respirato ry coronavirus J . J Vir Met , 1997 , 66 :303309. 4 Kim

34、L ,Chang K , Sestak K. Develop ment of a reverse 美國發(fā)生桃拉綜合征 2007 年 4 月 25 日 ,美國向 O IE 報(bào)告了該國的桃拉綜合征疫情 。疫情始于 2007 年 3 月 16 日 ,并于 4 月 18 日確認(rèn) , 不是臨床病例 , 系依靠實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)作出診斷 ,NV SL 和 Arizo na2 Tucso n 大學(xué)水產(chǎn)病原實(shí)驗(yàn)室的 Real2time PCR 結(jié)果均呈陽性 。疫區(qū)位于夏威夷州 Oahu 的養(yǎng)殖場 , 感染動(dòng)物是甲殼綱動(dòng)物 , 發(fā)病率和死亡 ( 摘譯自 O IE 網(wǎng)站 率均為 0 。H I 水產(chǎn)養(yǎng)殖發(fā)展計(jì)劃旨在保證養(yǎng)殖

35、場無病原并采取定期監(jiān)測 。在監(jiān)測中 ,養(yǎng)蝦場的地上混凝土 池塘和含易感動(dòng)物的排放池的確證樣品檢出了桃拉綜合征病毒 ,該養(yǎng)殖場現(xiàn)已被隔離 。陽性樣品的同群蝦 已在得出檢測結(jié)果前上市供人消費(fèi) 。感染來源尚不清楚 。美國采取的措施為國內(nèi)限制移動(dòng)和檢疫 ,即將進(jìn) 行設(shè)施及設(shè)備消毒 。美國上一次發(fā)生桃拉綜合征是 2004 年 6 月 10 日 。 塞爾維亞和黑山共和國發(fā)生新城疫 2007 年 4 月 25 日 ,塞黑向 O IE 報(bào)告了該國的新城疫疫情 。疫情始于 2007 年 3 月 29 日 ,并于當(dāng)天得到 確認(rèn) 。病原是新城疫病毒 。此次發(fā)病屬臨床病例 , 依靠臨床診斷 、 實(shí)驗(yàn)室診斷和剖解作出診

36、斷 。Novi Sad 科學(xué)獸醫(yī)研究所的病毒分離試驗(yàn)呈陽性 。疫區(qū)位于 VOJ VODINA 省 Srednjebanat ski 地區(qū)的 Taras Zrenja2 nin 村 ,感染動(dòng)物是庭院養(yǎng)殖的家禽 ,有 155 只易感禽 ,42 例病例 ,死亡 35 例 ,銷毀 120 例 。目前流行病學(xué)調(diào) 查正在進(jìn)行中 ,感染來源尚不清楚 。塞黑采取的措施 : 國內(nèi)限制移動(dòng) 、 篩選 、 緊急免疫 、 設(shè)施及設(shè)備消毒 、 浸 洗/ 噴霧 、 、 檢疫 撲殺和區(qū)域化 。La Sota 苗被用于該省 3 331 只禽的免疫 。塞黑上一次發(fā)生新城疫是 2007 年 2 月 1 日。 fo r differential diagno sis of t ransmissible gast roenteri2 tis virus and porcine respirato ry co ronavirus f ro m feces t ranscriptio n2nested polymerase chain reactio n a