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1、黃連解毒湯三成分提取及定量考察【關(guān)鍵詞】 黃連解毒湯;,配方顆粒;,提取定量摘要:目的優(yōu)選黃連解毒湯梔子苷、鹽酸小檗堿和黃芩苷3種成分的提取方法,對(duì)該方配方顆粒組方湯劑與傳統(tǒng)湯劑所含3種成分定量,并比較兩種湯劑3種成分的提取率。方法考察不同溶劑、不同提取時(shí)間及溶劑用量改變對(duì)梔子苷、鹽酸小檗堿和黃芩苷提取含量影響,采用高效液相色譜法測(cè)定。結(jié)果提取條件為250 倍量75%乙醇超聲處理15 min即可同時(shí)有效提取復(fù)方中3種成分。配方顆粒組方湯劑梔子苷、鹽酸小檗堿、黃芩苷平均提取率依次約為傳統(tǒng)湯劑相應(yīng)成分平均提取率的70%,145%及123% 。結(jié)論優(yōu)選得到的提取方法簡(jiǎn)便易行,穩(wěn)定性好。測(cè)定結(jié)果可客觀

2、反應(yīng)該方兩種湯劑3種成分提取率。關(guān)鍵詞:黃連解毒湯; 配方顆粒; 提取定量Extraction and Determination of Three Components in Huanglianjiedu DecoctionAbstract:ObjectiveTo optimize the extraction process of geniposide, berberine hydrochloride and baicalin in Huanglianjiedu Decoction, and analyze the content and compare the extraction ra

3、te of three components between refine granule decoction and traditional decoction.MethodsHPLC method was used for researching the effect of different solutions, extraction time and solution volume fold on geniposide, berberine hydrochloride and baicalin. ResultsThe optimum extraction conditions were

4、 250 fold of 75% ethanol, supersonic extraction 15 minutes. The extration rates of geniposide, berberine hydrochloride and baicalin in refine granule decoction were 70%, 145% and 123% of traditional decoction respectively. ConclusionThe optimized method is simple, stable and efficient. The determina

5、tion results can reflect the extraction rates of three components objectively. Key words:Huanglianjiedu Decoction; Refine granule; Extraction and determination 黃連解毒湯出自唐代王燾所著外臺(tái)秘要,主治一切實(shí)熱火毒,三焦熱盛之證。傳統(tǒng)用法為加水煮取藥液服用,由于此法臨床運(yùn)用不便,現(xiàn)代產(chǎn)生以單味藥材提取制備成配方顆粒、按需配伍混合、沸水沖泡服用的方式。黃連解毒湯傳統(tǒng)湯劑臨床應(yīng)用已有上千年,其功效歷經(jīng)年代考驗(yàn)得以公認(rèn),改變傳統(tǒng)湯劑為配方顆粒沸

6、水沖泡液(即配方顆粒湯劑)是否影響其內(nèi)在成分含量,本文選取組方藥材中具代表性的成分作為定量指標(biāo)進(jìn)行檢測(cè)并比較。1 組方劑量及復(fù)方湯劑煎法考察1.1 古方劑量換算原方組成為黃連三兩,黃柏二兩,黃芩二兩,梔子十四枚(擘)。據(jù)唐代與現(xiàn)今用藥劑量換算1,唐代用藥小兩制計(jì),一兩約為今之13.814 g,組方各藥用量即黃連42 g,黃柏28 g,黃芩28 g,梔子42 g,藥量比近似為(3223)。1.2 煎煮方法古方煎法為“上四味切,以水六升,煮取二升”,即有四升水被蒸發(fā),根據(jù)現(xiàn)代對(duì)水蒸發(fā)量實(shí)考2及唐代小制一升約合現(xiàn)代200 ml 計(jì)1,煎沸1 h 即可。由于方藥為根莖、果實(shí)類(lèi),古方只煎1次,有相當(dāng)多成

7、分還未能提出,現(xiàn)代煎法多為浸泡后煎23次3。結(jié)合實(shí)驗(yàn)中考察本方藥材平均吸水率196%(ml /g)(為方便計(jì)算,以200%計(jì)),由此確定黃連解毒湯煎提方法為:按上述“古方劑量換算”所得比例,取組方諸藥混合得140 g,加水1 200 ml,浸泡1 h,煎煮保持微沸1 h ,趁熱分出煎液,藥渣再各加920 ml水依次煎沸45,30 min ,合并3次煎液,即得。2 材料與方法2.1 藥材來(lái)源組方用藥材購(gòu)自本地濟(jì)仁堂藥店,由貴陽(yáng)中醫(yī)學(xué)院何順志老師鑒定。見(jiàn)表1。表1 組方藥材品種來(lái)源(略)2.2 樣品制備2.2.1 傳統(tǒng)湯劑干膏制備按“煎煮方法”項(xiàng)下確定的三煎法操作制備得黃連解毒湯傳統(tǒng)復(fù)方湯劑,再減

8、壓濃縮干燥,適當(dāng)粉碎,得傳統(tǒng)湯劑干膏。2.2.2 配方顆粒湯劑干膏制備分別取單味藥材,按傳統(tǒng)復(fù)方湯劑制法用水比例加水同法浸泡、煎提、濃縮、干燥、粉碎,制備各單味藥材配方顆粒,并計(jì)算干膏率。根據(jù)各單味藥材干膏率換算(表2)并稱(chēng)取相當(dāng)于傳統(tǒng)湯劑組成藥材用量的各單味藥材配方顆粒,混勻,得配方顆粒湯劑干膏。表2 樣品干膏率(略)2.3 提取方法考察梔子苷、黃芩苷、鹽酸小檗堿常作為相應(yīng)藥材梔子、黃芩、黃連和黃柏具代表性的定量成分4,故此本文以這3種成分作為2種復(fù)方湯劑定量考察指標(biāo),通過(guò)超聲處理法提取,并以高效液相色譜法檢測(cè)。2.3.1 不同提取溶劑考察取配方顆粒湯劑干膏適量,研細(xì),精密稱(chēng)取0.2 g,置

9、100 ml量瓶中,加入不同溶劑稍低于刻度,超聲處理30 min,取出,冷卻,以相應(yīng)溶劑定容,搖勻,濾過(guò),取續(xù)濾液測(cè)定。圖1顯示,溶劑變化對(duì)梔子苷含量影響較小,75 %乙醇作溶劑提取鹽酸小檗堿和黃芩苷含量較高。圖1 不同提取溶劑考察(略)2.3.2 溶劑用量考察75%乙醇作溶劑,檢測(cè)溶劑用量(ml)與配方顆粒湯劑干膏(g)比約為1001,2501,5001時(shí)超聲處理30 min 3種成分含量變化(圖2),用量比1001樣品液較濃,故確定2501較宜。圖2 溶劑用量考察(略)2.3.3 提取時(shí)間考察75%乙醇作溶劑分別超聲處理15,30,45,60 min,考察配方顆粒湯劑干膏梔子苷、鹽酸小檗堿

10、、黃芩苷含量變化(圖3),超聲處理15 min即可。圖3 超聲處理時(shí)間考察(略)2.3.4 上述考察結(jié)果顯示75%乙醇作溶劑,溶劑用量與稱(chēng)樣量比2501,超聲處理15 min即可同時(shí)有效提取復(fù)方中梔子苷、鹽酸小檗堿、黃芩苷。2.4 方法學(xué)考察2.4.1 儀器與試藥HP1100型高效液相色譜儀(美國(guó)惠普)。KQ-250型超聲波清洗器(昆山市超聲波儀器廠)。原料藥材來(lái)源、傳統(tǒng)湯劑干膏及配方顆粒湯劑干膏制備同上。含量測(cè)定用對(duì)照品梔子苷(749200108)、鹽酸小檗堿(07139906)、黃芩苷(715200010)均購(gòu)于中國(guó)藥品生物制品檢定所,并經(jīng)五氧化二磷減壓干燥至恒重。甲醇、乙醇、磷酸、三乙胺

11、,四氫呋喃(重蒸)均為分析純,水為純凈水,乙腈為色譜純。 2.4.2 色譜條件選用相同分析柱Agilent Extend-C18(5 m,4.6 mm250 mm),不同流動(dòng)相和檢測(cè)波長(zhǎng)對(duì)3種成分進(jìn)行分離。具體條件見(jiàn)表3。表3 高效液相色譜分離條件(略)B相配制: 每100 ml 濃度為0.05%(g/ml)磷酸二氫鉀水溶液(其中含體積濃度0.05%三乙胺),加入7 ml 四氫呋喃,再以磷酸調(diào) pH至32.4.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)制備分別精密稱(chēng)取適量干燥對(duì)照品,以75 %乙醇配制得濃度為0.250 mg/ml梔子苷對(duì)照品溶液、0.650 mg/ml鹽酸小檗堿對(duì)照品溶液及0.520 mg/ml黃芩苷對(duì)照

12、品溶液。再分別稀釋成6個(gè)不同濃度,不同濃度同種對(duì)照品溶液取同體積進(jìn)樣,按相應(yīng)色譜條件測(cè)定峰面積,以峰面積積分值(Y)對(duì)含量(X)作線(xiàn)性回歸,回歸方程見(jiàn)表4。表4 線(xiàn)性關(guān)系測(cè)定結(jié)果(略)2.4.4 精密度實(shí)驗(yàn)精密吸取對(duì)照品溶液10 l,重復(fù)進(jìn)樣6 次,梔子苷、鹽酸小檗堿、黃芩苷峰面積RSD分別為0.97%,0.83%,1.41% 。2.4.5 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)按“樣品含量測(cè)定”項(xiàng)方法制備樣品供試液,精密吸取同一瓶樣品供試液,于20 h內(nèi)分別進(jìn)樣,按相應(yīng)色譜條件測(cè)定并計(jì)算梔子苷、鹽酸小檗堿、黃芩苷含量,各測(cè)6次,RSD 依次為1. 58 %,1. 42 %,1. 75 %。三成分穩(wěn)定性良好。2.4.6

13、重復(fù)性實(shí)驗(yàn)取同一批配方顆粒湯劑干膏,按樣品測(cè)定項(xiàng)方法處理,平行制備9份樣品液,同法測(cè)定,用外標(biāo)法計(jì)算梔子苷、鹽酸小檗堿、黃芩苷含量,平均值依次分別為4.00%(RSD3.05%),5.66 %(RSD1.30 %),5.07 %(RSD1.52%)。 2.4.7 回收率實(shí)驗(yàn)精密稱(chēng)取已知含量的配方顆粒湯劑干膏0.1 g ,分別加入樣品中對(duì)應(yīng)成分含量80,100,120的對(duì)照品,按“樣品含量測(cè)定”項(xiàng)下方法處理,同法測(cè)定。平均回收率分別為:梔子苷99.60%,RSD1.91%;鹽酸小檗堿101.66%,RSD2.11%;黃芩苷100.31%,RSD2.57%。2.4.8 樣品含量測(cè)定取配方顆粒湯劑干

14、膏適量,研細(xì),精密稱(chēng)取0.2 g,置50 ml量瓶中,加入75 %乙醇約45 ml,超聲處理15 min,取出,冷卻,75 %乙醇定容,搖勻,濾過(guò),取續(xù)濾液,分別按相應(yīng)色譜條件測(cè)定梔子苷、鹽酸小檗堿及黃芩苷(表5)。配方顆粒組方湯劑梔子苷、鹽酸小檗堿、黃芩苷平均提取率依次約為傳統(tǒng)湯劑相應(yīng)成分平均提取率的70%,145%及123%。2.4.9 水液及75 %乙醇提取液含量比較取黃連解毒湯傳統(tǒng)湯劑水煎液上清液及配方顆粒組方湯劑沸水沖泡液上清液檢測(cè),并與上法75 %乙醇提取液比較(表6),上清液所含鹽酸小檗堿和黃芩苷明顯低于醇提液。由于水煎湯劑及沸水沖泡液含大量沉淀,此兩種成分有大部分存在于沉淀中,水液檢測(cè)結(jié)果未能反應(yīng)沉淀部分兩種成分含量。表5 黃連解毒湯樣品含量測(cè)定(以傳統(tǒng)復(fù)方藥材計(jì))(略)提取率是與相同投料量復(fù)方藥材相應(yīng)成分含量比較計(jì)算而得;n=3表6 黃連解毒湯水液與醇提液樣品含量比較(略)n=33 討論3.1 考慮到配方顆粒湯劑未經(jīng)過(guò)混合加熱煎煮過(guò)程,故其定量成分的提取不采用加熱回流、索氏提取等需加熱的方法處理,而選用超聲處理法提取。3.2 本實(shí)驗(yàn)水液(上清液)檢測(cè)結(jié)果并未真實(shí)反應(yīng)湯劑相關(guān)檢測(cè)成分含量,且水提物穩(wěn)定性較差,因此在比較多種溶劑提取影響后選用75 %乙醇作為適宜的提取溶劑。3.3 多成分共存及助溶作用能增加中藥復(fù)方湯劑各成分在水中的煎出量,但水溶性較差或相互作用可產(chǎn)

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