超聲波提取野菊花總黃酮及含量測定

1、畢 業(yè) 設(shè) 計（論文）2011 屆題 目 超聲波提取野菊花總黃酮及含量測定專 業(yè) 制藥工程學(xué)生姓名 李明艷學(xué) 號 07092206指導(dǎo)教師論文字?jǐn)?shù)完成日期 20 年 月 日湖 州 師 范 學(xué) 院 教 務(wù) 處 印湖州師范學(xué)院學(xué)士學(xué)位論文超聲波提取野菊花總黃酮及含量測定07092206 李明艷（湖州師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，湖州 313000）摘要：本實(shí)驗(yàn)主要利用超聲波提取技術(shù)提取野菊花中的總黃酮，用有機(jī)溶劑乙醇提取野菊花總黃酮的工藝路線，對所提取的總黃酮進(jìn)行驗(yàn)證，并用分光光度計法測定其含量。在單因素提取的基礎(chǔ)上，采取正交優(yōu)化試驗(yàn)，探討乙醇體積分?jǐn)?shù)、液料比、提取時間對野菊花總黃酮提取工藝的影響，結(jié)果表

2、明，影響野菊花總黃酮超聲提取的主要因素為提取時間，其次為液料比、乙醇體積分?jǐn)?shù)。最佳提取工藝條件為乙醇體積分?jǐn)?shù)60，液料比25:1，提取時間80min，測得野菊花總黃酮為5.62%。在優(yōu)選的工藝條件下進(jìn)行提取，并利用紫外可見分光光度法對野菊花總黃酮的含量進(jìn)行測定。該提取工藝簡單，易操作。關(guān)鍵詞：野菊花，總黃酮，超聲波，提取Extraction of total flavonoids from chrysanthemum byultrasonic and content determination07092206 Li MingYan（School of Life Science，Huzhou T

3、eachers College，Huzhou 313000 ）Abstract：This experiment using ultrasonic technology to extract the flavonoid in wild chrysanthemum. This process route is using organic solvent of ethanol to extract the flavonoids in wild chrysanthemum, to verify the extracting flavonoids, and its content determined

4、by spectrophtometry. On the basis of single factor extraction orthogonal test be taken. The optimum extraction parameters of total flavonoids from Chrysanthemum indicum by ultrasonic were investigated including, the ratio of liquid and material, extraction timeIt was found that the orders of paramet

5、ers affecting extraction efficiency were extraction time，the ratio of material and liquid and alcohol content. The optimal extraction conditions were obtained as followed：alcohol content 60, the ratio of liquid and material 25:1 and time 80 minUnder these conditions, the content of flavonoids reache

6、d 5.62. Extraction in the optimal process conditions, and used the Ultraviolet spectrophotometry for determination the content of the flavonoid in wild chrysanthemum. The extraction process is simple and easy to operate .Key words：chrysanthemum indicum；total flavonoids；ultrasonic；extraction湖州師范學(xué)院學(xué)士學(xué)

7、位論文目 錄1 引言 ················································&

8、#183;·················································&

9、#183;····································· 11.1 野菊花簡介 ··········&

10、#183;·················································&

11、#183;·················································&

12、#183;··· 11.1.1 野菊花物化性質(zhì)1.1.2 野菊花藥理作用1.1.3 野菊花的臨床應(yīng)用1.1.4 野菊花的不良反應(yīng)1.2 黃酮類化合物 ···································

13、··················································

14、························· 11.2.1 黃酮類化合物簡介1.2.2 黃酮類化合物的理化性質(zhì)1.2.3 黃酮類化合物的藥理活性1.3 超聲波簡介 ···············

15、··················································

16、················································· 31.3.

17、1 超聲波提取技術(shù)1.3.2 超聲波提取的原理1.3.3 超聲波提取的優(yōu)點(diǎn)1.4 野菊花總黃酮提取方法研究概況 ········································

18、3;····································· 41.4.1 熱水提取法1.4.2 有機(jī)溶劑提取法1.4.3 堿液提取法1.4.4 微波輔助提取法1.4.5 超聲波輔助提取法1.4.6 大孔樹脂吸附

19、法2 材料與方法 ················································

20、83;·················································

21、83;························· 52.1 實(shí)驗(yàn)材料 ······················

22、3;·················································

23、3;············································· 52.1.1 試劑與儀器2.2 實(shí)驗(yàn)方法的確定

24、83;·················································

25、83;·················································

26、83;····· 52.2.1 對照品及對比實(shí)驗(yàn)溶液的制備2.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作2.2.3 供試液含量的測定2.2.4 對比實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析湖州師范學(xué)院學(xué)士學(xué)位論文2.3 實(shí)驗(yàn)方法與評價指標(biāo) ······························

27、;··················································

28、;·················· 72.3.1 實(shí)驗(yàn)具體操作方法2.3.2 實(shí)驗(yàn)評價指標(biāo)3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論 ·························

29、83;·················································

30、83;········································ 73.1 提取中主要影響因素的確定 ······&#

31、183;·················································&#

32、183;····························· 73.1.1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對總黃酮含量的影響3.1.2 乙醇體積對總黃酮含量的影響3.1.3 超聲波提取時間對總黃酮含量的影響3.2 正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計 ········

33、;··················································

34、;··················································

35、; 103.2.1 考察因素及水平3.2.2 試驗(yàn)與結(jié)果3.2.3 小結(jié)3.3 穩(wěn)定性考察（驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)） ·········································&#

36、183;·············································· 11 4 總結(jié)與展望 ·&#

37、183;·················································&#

38、183;·················································&#

39、183;···················· 124.1 總結(jié) ···························

40、3;·················································

41、3;·············································· 124.1.1 溶劑的選擇4.1.2 實(shí)驗(yàn)

42、方法的選擇4.1.3 實(shí)驗(yàn)流程4.1.4 各實(shí)驗(yàn)條件確定4.1.5 實(shí)驗(yàn)條件優(yōu)勢4.2 展望 ··········································&

43、#183;·················································&

44、#183;······························· 12 參考文獻(xiàn) ················

45、3;·················································

46、3;·················································

47、3;····· 13 致 謝 ···········································&#

48、183;·················································&#

49、183;···························· 15湖州師范學(xué)院學(xué)士學(xué)位論文1 引言1.1 野菊花簡介1.1.1 野菊花物化性質(zhì)野菊花為菊科植物野菊（Chrysanthemum indicum L）、北野菊（Chrysanthemum boreale Mak）或巖香菊（Chrysan themum l

50、avandulaefolium FischMak）的頭狀花序1，別名為野黃菊花、苦薏、山菊花、甘菊花。野菊花頭狀花序類球形，直徑1.52.5cm，棕黃色?？偘?5層，外層苞片卵形或卵狀三角形，長2.53mm，外表面中部灰綠色或淡棕色，常被有白毛，邊緣膜質(zhì)；中層苞片卵形；內(nèi)層苞片長橢圓形?？偘坑械臍埩艨偦ü！Ｉ酄罨╨輪，黃色，皺縮卷曲，展平后，舌片長l1.3cm，先端全緣或23齒；筒狀花多數(shù)，深黃色，氣芳香，性味微寒，味苦、辛?，F(xiàn)代藥理研究證明：野菊花富含萜類和揮發(fā)油2、黃酮類化合物以及綠原酸等。野菊花尚含有山萮酸甘油酯、棕櫚酸、多糖3、-胡蘿卜素、蛋白質(zhì)、氨基酸、嘌呤、膽堿、水蘇堿、鞣質(zhì)

51、、維生素、葉綠素等成分。另外，不同品種和產(chǎn)地的野菊花都含有人體必需的多種微量元素，而且B、Ca、Mg、Fe的含量比菊花中的高。1.1.2 野菊花藥理作用 抗病原微生物作用4,5 野菊花水提物和揮發(fā)油都具有抗菌的活性。 對心血管系統(tǒng)的作用6 野菊花黃酮具有明顯的心臟保護(hù)作用。 具有降壓作用7 有一定的降壓效果而且降壓作用緩慢、持久，是較理想的降血壓藥物。 對血小板聚集的影響 對血小板聚集功能有較強(qiáng)的抑制作用和解聚作用。 抗炎和免疫作用8,9 野菊花提取物和揮發(fā)油都有顯著的抗炎、免疫抑制作用。 具有良好的解熱作用 研究表明野菊花注射液具有良好的解熱效果。1.1.3 野菊花的臨床應(yīng)用目前野菊花具有散

52、風(fēng)清熱、消炎解毒、平肝明目、祛痰止咳、理氣止痛、涼血止血、抗菌、抗病毒等功效10，臨床多用于治療各種急慢性感染性疾?。ò甭院粑栏腥?、泌尿生殖系統(tǒng)感染、急性乳腺炎、急性淋巴管炎以及急性感染性肝炎等疾?。嘤糜谥委熌[瘤、高血壓病和高脂血癥，以及對感冒、流行性腦膜炎的預(yù)防。此外，野菊花煎液口服或外用治療皮膚癰毒癤腫療效顯著11。野菊花對心臟、肝腎功能無明顯影響，除偶有嘔吐現(xiàn)象、胃部不適、食欲減退，腸鳴泄瀉等癥1.1.4 野菊花的不良反應(yīng) 狀，注射劑偶可引起腹瀉，陰道后穹窿注射時，有一定刺激作用。臨床不良反應(yīng)少見。慢性給藥亦無蓄積中毒現(xiàn)象。1.2 黃酮類化合物1.2.1 黃酮類化合物簡介黃酮

53、類化合物廣泛分布于植物界，而且生物活性多種多樣，引起了國內(nèi)外的廣泛重視，菊花中含有的黃酮類化合物主要包括黃酮及其苷、黃酮醇及其苷，是菊花藥用的重要活性部位。黃酮類化合物泛指兩個具有酚羥基的苯環(huán)（A-與B-環(huán)）通過中央三碳原子相互連結(jié)而成的一系列化合物，其基本母核為2-苯基色原酮（如圖1-1）。黃酮類化合物結(jié)構(gòu)中常連接有酚羥基、甲氧基、甲基、異戊烯基等官能團(tuán)。此外，它還常與糖結(jié)合成苷。 多數(shù)科學(xué)家認(rèn)為黃酮的基本骨架是由三個丙二酰輔酶A和一個桂皮酰輔酶A生物合成而產(chǎn)生的。經(jīng)同位素標(biāo)記實(shí)驗(yàn)證明了A環(huán)來自于三個丙1湖州師范學(xué)院學(xué)士學(xué)位論文二酰輔酶A，而B環(huán)則來自于桂皮酰輔酶A。 OO圖1-1 2-苯基

54、色原酮化學(xué)結(jié)構(gòu)式目前發(fā)現(xiàn)菊花中所含的黃酮類化合物有香葉木素、木犀草素、芹菜素、香葉木素7-O-D- 葡萄糖、木犀草素7-O-D- 葡萄糖苷、金合歡素7-O-D-葡萄糖苷、刺槐苷、金合歡素7-O-（6-O-乙酰）-D- 葡萄糖苷、金合歡素、山奈酚和異澤蘭黃素。1.2.2 黃酮類化合物的理化性質(zhì)黃酮類化合物多為結(jié)晶性固體，少數(shù)為無定型粉末。黃酮類化合物的顏色與分子中存在的交叉共軛體系及助色團(tuán)（-OH、-CH3）等的類型、數(shù)目及取代位置有關(guān)。一般來說，黃酮、黃酮醇及其苷類多呈灰黃至黃色，查爾酮為黃色至橙黃色，而二氫黃酮、二氫黃酮醇、異黃酮類等因不存在共軛體系或共軛很少，故不顯色?；ㄉ丶捌滠赵念伾?/p>

55、，因pH的不同而變，一般呈紅（pH<7）、紫（7<8.5）、藍(lán)（pH>8.5）等顏色。黃酮苷元一般難溶或不溶于水，易溶于甲醇、乙醇、乙酸乙酯、乙醚等有機(jī)溶劑，易溶于稀堿液。黃酮類化合物的羥基糖苷化后，水溶性相應(yīng)加大，而在有機(jī)溶劑中的溶解度相應(yīng)減少。黃酮苷一般易溶于水、甲醇、乙醇、乙酸乙酯、吡啶等溶劑，難溶于乙醚、三氯甲烷、苯等有機(jī)溶劑。黃酮類化合物因分子中多有酚羥基而呈酸性，故可溶于堿性水溶液、吡啶、甲酰胺及二甲基甲酰胺中。1.2.3 黃酮類化合物的藥理活性 心血管系統(tǒng)活性12-14不少治療冠心病有效的中成藥均含黃酮類化合物，研究發(fā)現(xiàn)蘆丁、槲皮素、葛根素以及人工合成的立可定（

56、recordil）等均有明顯的擴(kuò)冠作用；槲皮素、蘆丁、金絲桃苷、葛根素、燈盞花素、葛根總黃酮、銀杏葉總黃酮對缺血性腦損傷有保護(hù)作用；金絲桃苷、水飛薊素、木犀草素、沙棘總黃酮對心肌缺血性損傷有保護(hù)作用；銀杏葉總黃酮、葛根素、大豆苷元等對心肌缺氧性損傷有明顯保護(hù)作用。此外，沙棘總黃酮、苦參總黃酮、甘草黃酮（主要為甘草素和異甘草素）具有抗心律失常作用。 抗菌及抗病毒活性木犀草素、黃岑苷、黃岑素等均有一定的抗菌作用；槲皮素、二氫槲皮素、桑色素、山柰酚等具有抗病毒作用；從菊花、獐牙菜中分離得到的黃酮單體對HIV病毒有較強(qiáng)抑制作用，大豆苷元、染料木素、雞豆黃素A對HIV病毒也有一定抑制作用。 抗腫瘤活性黃

57、酮類化合物的抗腫瘤機(jī)制多種多樣15，如槲皮素的抗腫瘤活性與其抗氧化作用、抑制相關(guān)酶的活性、降低腫瘤細(xì)胞耐藥性、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡及雌激素樣作用等有關(guān)；水飛薊素的抗腫瘤活性與其抗氧化作用、抑制相關(guān)酶活性、誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯等有關(guān)。 抗氧化自由基活性17,18大多數(shù)黃酮類化合物均有較強(qiáng)的抗氧化自由基作用，是一類極具開發(fā)前景的天然有機(jī)抗氧化劑16，而黃酮類化合物的一些藥理活性也往往與其抗氧化自由基相關(guān)12-14。2湖州師范學(xué)院學(xué)士學(xué)位論文 抗炎19、鎮(zhèn)痛活性蘆丁、羥基蘆丁、二氫槲皮素等對角叉菜膠、5-HT及PGE誘發(fā)的大鼠足爪水腫、甲醛引起的關(guān)節(jié)炎及棉球肉芽腫等均有明顯抑制作用；金蕎麥中的雙聚原矢車菊苷

58、元有抗炎、解熱、祛痰等作用；金絲桃苷、蘆丁、槲皮素及銀杏葉總黃酮等有良好的鎮(zhèn)痛作用。 保肝活性水飛薊素對中毒性肝損傷、急慢性肝炎、肝硬化等有良好的治療作用；淫羊藿黃酮、黃岑素、黃岑苷能抑制肝組織脂質(zhì)過氧化、提高肝臟SOD活性、減少肝組織脂褐素形成，對肝臟有保護(hù)作用；甘草黃酮可保護(hù)乙醇所致肝細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的損傷等。 其他此外，大量研究表明黃酮類化合物還具有降壓、降血脂、抗衰老、提高機(jī)體免疫力、瀉下、鎮(zhèn)咳、祛痰、解痙及抗變態(tài)等藥理活性12-14。1.3 超聲波簡介1.3.1 超聲波提取技術(shù)超聲波是指頻率為20千赫50兆赫左右的電磁波，它是一種機(jī)械波，需要能量載體介質(zhì)來進(jìn)行傳播。超聲波在傳遞過程中存在

59、著的正負(fù)壓強(qiáng)交變周期，在正相位時，對介質(zhì)分子產(chǎn)生擠壓，增加介質(zhì)原來的密度；負(fù)相位時，介質(zhì)分子稀疏、離散，介質(zhì)密度減小。也就是說，超聲波并不能使樣品內(nèi)的分子產(chǎn)生極化，而是在溶劑和樣品之間產(chǎn)生聲波空化作用，導(dǎo)致溶液內(nèi)氣泡的形成、增長和爆破壓縮，從而使固體樣品分散，增大樣品與萃取溶劑之間的接觸面積，提高目標(biāo)物從固相轉(zhuǎn)移到液相的傳質(zhì)速率。在工業(yè)應(yīng)用方面，利用超聲波進(jìn)行清洗、干燥、殺菌、霧化及無損檢測等，是一種非常成熟且有廣泛應(yīng)用的技術(shù)。超聲波提取（也稱為萃?。┮云涮崛囟鹊?、提取率高、提取時間短的獨(dú)特優(yōu)勢被應(yīng)用于中藥材和各種動、植物有效含量的提取20（包括提取植物中的生物堿、苷類、生物活性物質(zhì)、動物組

60、織漿的毒質(zhì)等21-23），是替代傳統(tǒng)工藝方法實(shí)現(xiàn)高效、節(jié)能、環(huán)保式提取的現(xiàn)代高新技術(shù)手段。1.3.2 超聲波提取的原理超聲波提取中藥材的優(yōu)越性，是基于超聲波的特殊物理性質(zhì)。主要是主要通過壓電換能器產(chǎn)生的快速機(jī)械振動波來減少目標(biāo)萃取物與樣品基體之間的作用力從而實(shí)現(xiàn)固液萃取分離。 加速介質(zhì)質(zhì)點(diǎn)運(yùn)動。高于20 KHz聲波頻率的超聲波的連續(xù)介質(zhì)（例如水）中傳播時，根據(jù)惠更斯波動原理，在其傳播的波陣面上將引起介質(zhì)質(zhì)點(diǎn)（包括藥材重要效成分的質(zhì)點(diǎn)）的運(yùn)動，使介質(zhì)質(zhì)點(diǎn)運(yùn)動獲行巨大的加速度和動能。質(zhì)點(diǎn)的加速度經(jīng)計算一般可達(dá)重力加速度的二千倍以上。由于介質(zhì)質(zhì)點(diǎn)將超聲波能量作用于藥材中藥效成分質(zhì)點(diǎn)上而使之獲得巨大的

61、加速度和動能，迅速逸出藥材基體而游離于水中。 空化作用。超聲波在液體介質(zhì)中傳播產(chǎn)生特殊的“空化效應(yīng)”，“空化效應(yīng)”不斷產(chǎn)生無數(shù)內(nèi)部壓力達(dá)到上千個大氣壓的微氣穴并不斷“爆破”產(chǎn)生微觀上的強(qiáng)大沖擊波作用在中藥材上，使其中藥材成分物質(zhì)被“轟擊”逸出，并使得藥材基體被不斷剝蝕，其中不屬于植物結(jié)構(gòu)的藥效成分不斷被分離出來。加速植物有效成份的浸出提取。 超聲波的振動勻化（Sonication）使樣品介質(zhì)內(nèi)各點(diǎn)受到的作用一致，使整個樣品萃取更均勻。中藥材中的藥效物質(zhì)在超聲波場作用下不但作為介質(zhì)質(zhì)點(diǎn)獲得自身的巨大加速度和動能，而且通過“空化效應(yīng)”獲得強(qiáng)大的外力沖擊，所以能高效率并充分分離出來。3湖州師范學(xué)院學(xué)

62、士學(xué)位論文1.3.3 超聲波提取的優(yōu)點(diǎn)適用于中藥材有效成份的萃取，是中藥制藥徹底改變傳統(tǒng)的水煮醇沉萃取方法的新方法、新工藝。與水煮、醇沉工藝相比，超聲波萃取具有如下突出優(yōu)點(diǎn)： 提取效率高：超聲波獨(dú)具的物理特性能促使植物細(xì)胞組織破壁或變形，使中藥有效成分提取更充分，提取率比傳統(tǒng)工藝顯著提高達(dá)50 500%； 提取時間短：超聲波強(qiáng)化中藥提取通常在24 40分鐘即可獲得最佳提取率，提取時間較傳統(tǒng)方法大大縮短2/3以上， 藥材原材料處理量大； 提取溫度低22：超聲提取中藥材的最佳溫度在40 60，對遇熱不穩(wěn)定、易水解或氧化的藥材中有效成分具有保護(hù)作用； 常壓提取，安全性好，操作簡單易行，維護(hù)保養(yǎng)方便；

63、 適應(yīng)性廣：超聲提取中藥材不受成分極性、分子量大小的限制，適用于絕大多數(shù)種類中藥材和各類成分的提?。?超聲波萃取對溶劑和目標(biāo)萃取物的性質(zhì)（如極性）關(guān)系不大。因此，可供選擇的萃取溶劑種類多、目標(biāo)萃取物范圍廣泛； 減少能耗。由于超聲萃取無需加熱或加熱溫度低，萃取時間短，因此大大降低能耗； 提取藥液雜質(zhì)少，有效成分易于分離、純化； 提取工藝運(yùn)行成本低，綜合經(jīng)濟(jì)效益顯著； 操作簡單易行，設(shè)備維護(hù)、保養(yǎng)方便。1.4 野菊花總黃酮提取方法研究概況目前提取總黃酮的方法有：熱水提取法、有機(jī)溶劑提取法、堿液提取法、微波輔助提取法、超聲波輔助提取法、大孔樹脂吸附法等21。1.4.1 熱水提取法由于該方法成本低廉，

64、目前，國內(nèi)廠家對野菊花總黃酮的提取多采用沸水提取法，其提取條件因素已各有不同22。1.4.2 有機(jī)溶劑提取法黃酮苷、黃酮苷元均易溶于甲醇、乙醇等有機(jī)溶劑，根據(jù)這一原理進(jìn)行有機(jī)溶劑提取法。1.4.3 堿液提取法黃酮類化合物因分子中多有酚羥基而呈酸性，故可溶于堿性水溶液。此法就是根據(jù)這一原理對野菊花黃酮類化合物進(jìn)行提取的。1.4.4 微波輔助提取法微波是一種超高速電磁波，具有很強(qiáng)的穿透作用，使植物細(xì)胞中的水分或有機(jī)溶劑迅速升溫升壓，細(xì)胞壁穿孔，使成分從細(xì)胞中溶出，而且微波電磁場使分子運(yùn)動短時間內(nèi)加劇，從而縮短了提取時間，提高了提取率。所以微波提取法與常規(guī)方法相比具有高效性和強(qiáng)選擇性，操作簡便，產(chǎn)率

65、高，副產(chǎn)物少，產(chǎn)物易于純化等26-28。此法已廣泛應(yīng)用于多種天然產(chǎn)物的提取，但對野菊花中黃酮類化合物微波提取工藝鮮見報道。1.4.5 超聲波輔助提取法近年來，超聲技術(shù)應(yīng)用于提取植物中的生物堿、苷類、生物活性物質(zhì)、動物組織漿的毒質(zhì)等研究已有報道，表明其具有能耗低、效率高、不破壞有效成分的特點(diǎn)。很多研究表明，利用超聲波產(chǎn)生的強(qiáng)烈振動、高的加速度、強(qiáng)烈的空化效應(yīng)、攪拌作用等，可加速植物材料中的有效成分進(jìn)入溶4湖州師范學(xué)院學(xué)士學(xué)位論文劑。從而增加有效成分的提取率，縮短提取時間，并且還可避免高溫對提取成分的影響。但超聲技術(shù)應(yīng)用于提取野菊花中黃酮類物質(zhì)的研究報道較為少見。 1.4.6 大孔樹脂吸附法29,

66、30該方法是將菊花提取液經(jīng)樹脂上柱、洗脫、收安 洗脫液、濃縮、干燥，獲得純化的菊花總黃酮。該方法以乙醇為溶劑，既價廉又無毒。用該方法純化菊花提取物，其總黃酮轉(zhuǎn)移率可達(dá)95%以上，純化物總黃酮含量可達(dá)65%以上，且重現(xiàn)性好，樹脂可重復(fù)使用。2 材料與方法2.1 實(shí)驗(yàn)材料 2.1.1 試劑與儀器 試劑所需試劑如下表2-1所列：表2-1 所需的試劑菊花 乙醇 亞硝酸鈉 硝酸鋁 氫氧化鈉 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品 蒸餾水95% 分析純 分析純 分析純浙江安徽安特生物化學(xué)有限公司上海振欣試劑廠 上海振欣試劑廠 杭州蕭山化學(xué)試劑廠 中國藥品生物制品檢定所實(shí)驗(yàn)室制備 儀器所需的儀器如小標(biāo)2-2所列：表2-2 所需的儀器儀

67、器名稱及型號 WK-200B高速藥物粉碎機(jī)FA1104型電子天平UV-1800PC型紫外可見分光光度計智能恒溫電熱套 KQ-100B型超聲波清洗器 RE-52A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 循環(huán)水式多用真空泵 各種玻璃儀器生產(chǎn)公司青州市精誠機(jī)械有限公司 上海良平儀器有限公司 上海美譜達(dá)儀器有限公司 鄭州長城科工貿(mào)易有限公司 昆山市超聲儀器有限公司 上海亞榮生化儀器廠 昆山市超聲儀器有限公司 寧波市化學(xué)有限公司2.2 實(shí)驗(yàn)方法的確定2.2.1 對照品及對比實(shí)驗(yàn)溶液的制備 對照品溶液配制由于蘆丁和黃酮類化合物均是以2-苯基色原酮為母核的結(jié)構(gòu)，具有相同的吸光度測試性質(zhì)，均于510 nm處有最大吸收峰，所以采用蘆丁為對

68、照品測定野菊花中總黃酮的含量。精確稱取經(jīng)120干燥至恒重的蘆丁對照品25mg，置50mL容量瓶中，加乙醇適量，使充分溶5湖州師范學(xué)院學(xué)士學(xué)位論文解，放冷，用乙醇稀釋至刻度，搖勻。精密量取20mL，置50mL容量瓶中，用水稀釋至刻度。搖勻，所得溶液每lmL含蘆丁對照品0.2mg。 對比實(shí)驗(yàn)溶液的配制 野菊花預(yù)處理取適量野菊花60干燥5h，取出粉碎成細(xì)粉。放入干燥瓶中備用。 加熱回流提取法溶液的配制準(zhǔn)確稱取1.000g菊花粉末于100 mL燒杯中，加入40乙醇30mL，浸泡24h，50加熱回流1h，減壓抽濾，棄濾渣，濾液加40%的乙醇定容于100 mL容量瓶中，精密量取5mL，置25mL容量瓶中，

69、加水稀釋至刻度，搖勻，作為待測液。 超聲波提取法溶液的配制準(zhǔn)確稱取1.000g菊花粉末于100 mL燒杯中，加入40%乙醇30mL，浸泡24h，在超聲波溫度為50的條件下，提取1h，減壓抽濾，棄濾渣，濾液加40%的乙醇定容于100 mL容量瓶中，精密量取5mL，置25mL容量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，作為待測液。2.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作精密量取蘆丁對照品溶液3.0 mL、4.0 mL、5.0 mL、6.0 mL、7.0 mL，分別置于25 mL容量瓶中，加5亞硝酸鈉溶液1.0 mL，搖勻，放置6 min，加10硝酸鋁溶液1.0 mL，搖勻，放置6 min，加氫氧化鈉試液10.0 mL，再加

70、水至刻度，搖勻，放置15 min，以相應(yīng)的試劑溶液為空白，于UV-1800PC型紫外可見分光光度計上進(jìn)行全波長掃描，得最大吸收波長 max = 510 nm ，按分光光度法，在510 nm處測定吸光度。應(yīng)用最小二乘法將蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液濃度與吸光度值做一元線性回歸分析，由Microsoft Excel獲得回歸曲線。結(jié)果見圖1。圖2-1 蘆丁吸光度與濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線以對照品溶液濃度C和吸光度A進(jìn)行線性回歸，得回歸方程A = 0.0127C+0.0098，其中R2 = 0.9996，可知線性關(guān)系良好。線性范圍為8.46567.384 g / ml。2.2.3 供試液含量的測定6湖州師范學(xué)院學(xué)士學(xué)位論文精密吸取

71、各供試品液2mL于25mL容量瓶中，按照標(biāo)準(zhǔn)曲線方法進(jìn)行操作，顯色，在510nm波長處測定吸光度A，由標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計算樣品中總黃酮的含量。2.2.4 對比實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析經(jīng)測量及計算分別得加熱回流提取法、超聲波提取法吸光度值及總黃酮含量。相關(guān)數(shù)據(jù)如下表2-3所示：表2-3 乙醇、超聲波提取法實(shí)驗(yàn)結(jié)果 加熱回流提取法超聲波提取法 0.230 Abs 0.259Abs 0.22 0.25 10.84 12.50根據(jù)表2-1所示，經(jīng)比較，可知超聲波提取法總黃酮提取率大于加熱回流提取法。為取得最佳收率，故本實(shí)驗(yàn)采取超聲波提取法進(jìn)行野菊花總黃酮提取。2.3 實(shí)驗(yàn)方法與評價指標(biāo)2.3.1 實(shí)驗(yàn)具體操作方法采用

72、乙醇為提取溶劑，先進(jìn)行單因素試驗(yàn)，得出乙醇體積分?jǐn)?shù)、乙醇體積、超聲時間等因素在不同水平上的總黃酮的出膏率以及含量，在此基礎(chǔ)上，各選出3個水平用L 9（3 4）正交表進(jìn)行正交試驗(yàn)，進(jìn)行優(yōu)化組合找出最優(yōu)化工藝參數(shù)條件。具體操作如下：準(zhǔn)確稱取5.000g菊花粉末于100 mL燒杯中，加入一定體積分?jǐn)?shù)以及一定量的乙醇溶液，浸泡24h，在超聲波溫度為50的條件下，提取一定時間，減壓抽濾。棄濾渣，濾液減壓蒸餾得浸膏液至恒重，干燥浸膏液，得浸膏。浸膏加一定體積分?jǐn)?shù)的乙醇溶解，用一定體積分?jǐn)?shù)的乙醇定容于100 mL容量瓶中，搖勻。精密量取5mL，置25mL容量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，作為待測液。2.3.2

73、 實(shí)驗(yàn)評價指標(biāo) 出膏率出膏率的計算公式為：出膏率 = 干膏重 / 藥材量 （2-1） 總黃酮提取率總黃酮含量計算公式：由標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計算樣品中總黃酮的含量?？傸S酮提取率計算公式：總黃酮提取率 = 總黃酮重 / 藥材量 （2-2）本實(shí)驗(yàn)中測定出膏率、總黃酮含量以及總黃酮提取率的方法分別是： 出膏率測定：用FA1104型電子天平準(zhǔn)確稱量經(jīng)干燥至恒重的浸膏，通過公式（2-1）進(jìn)行計算，得出膏率。 總黃酮含量測定：浸膏加一定體積分?jǐn)?shù)的乙醇溶解，用一定體積分?jǐn)?shù)的乙醇定容于100 mL容量瓶中，搖勻。精密量取5mL，置25mL容量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，作為待測液。按照標(biāo)準(zhǔn)曲線方法進(jìn)行操作測定黃酮含量

74、，得總黃酮含量。 總黃酮提取率：由公式（2-2）計算得總黃酮提取率3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論3.1 提取中主要影響因素的確定用水浸提提取物雜質(zhì)多，后處理比較麻煩。甲醇、丙酮等作為提取劑，雖然效果不錯，但二者7湖州師范學(xué)院學(xué)士學(xué)位論文有毒。乙醇浸提的選擇性好，滲透性強(qiáng)，出膏率較高。本試驗(yàn)選擇一定體積分?jǐn)?shù)的乙醇溶液作為提取劑。為了提高有效成分的浸出。同時克服加熱提取時產(chǎn)生水解產(chǎn)物的缺點(diǎn)，本試驗(yàn)利用超聲波輔助提取。3.1.1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對總黃酮含量的影響準(zhǔn)確稱取5.000g菊花粉5份，分別加入100mL30 、45 、60 、75、90的乙醇溶液。浸泡24h，在超聲波溫度為50的條件下，提取時間為40mi

75、n，減壓抽濾。棄濾渣，濾液減壓蒸餾得浸膏液，干燥浸膏液，得浸膏，稱量，計算出膏率。得出膏率與乙醇體積分?jǐn)?shù)的關(guān)系（圖3-1）。浸膏加一定體積分?jǐn)?shù)的乙醇溶解，用一定體積分?jǐn)?shù)的乙醇定容于100 mL容量瓶中，搖勻。精密量取5mL，置25mL容量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，作為待測液。測其吸光度A值，得待測液總黃酮含量與乙醇體積分?jǐn)?shù)的關(guān)系（圖3-1）。乙醇體積分?jǐn)?shù)對總黃酮含量的影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表3-1所示。表3-1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對總黃酮含量的影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果記錄（%） 3045 60 75 90（g） 1.3938 1.6285 1.8972 1.7194 1.0203（%） 27.88 32.57 37.

76、94 34.39 20.410.309 0.403 0.515 0.480 0.148 （mg/ml） 0.2945 0.3870 0.4972 0.4628 0.1360（%） 2.95 3.87 4.97 4.631.36圖3-1 乙醇體積分?jǐn)?shù)與出膏率、總黃酮提取率關(guān)系從圖2-2可以看出，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加。出膏率、總黃酮提取率均增加，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)達(dá)到60左右時，黃酮類化合物溶解度最大，出膏率、總黃酮提取率均最高；乙醇濃度再增加，黃酮類化合物溶解度降低。這是由于存在一些醇溶性的雜質(zhì)，葉綠素的溶出量增加，這些成分與黃酮類化合物競爭同乙醇水分子的結(jié)合，從而導(dǎo)致黃酮類化合物的減少。 3.1

77、.2 乙醇體積對總黃酮含量的影響準(zhǔn)確稱取5.000g菊花粗粉5份。分別加入70的乙醇溶液50mL、100mL、150mL、200mL、250mL，浸泡24h，在超聲波溫度為50 的條件下。提取時間為40min，減壓抽濾。棄濾渣，濾液8湖州師范學(xué)院學(xué)士學(xué)位論文減壓蒸餾得浸膏液，干燥浸膏液，得浸膏，稱量，計算出膏率。得出膏率與乙醇體積的關(guān)系（圖3-2）。浸膏加70的乙醇溶解，用70的乙醇定容于100 mL容量瓶中，搖勻。精密量取5mL，置25mL容量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，作為待測液。測其吸光度A值，得待測液總黃酮含量與乙醇體積的關(guān)系（圖3-2）。乙醇體積對總黃酮含量的影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表3-2所

78、示。表3-2 乙醇體積對總黃酮含量的影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果記錄（ml） 5075 100 125 150（g） 1.2059 1.4491 1.7903 1.8274 1.7835（%） 24.12 28.98 35.81 36.55 35.670.225 0.356 0.512 0.509 0.486 （mg/ml） 0.2118 0.3407 0.4942 0.4913 0.4687（%） 2.12 3.41 4.94 4.914.69圖3-2 乙醇體積與出膏率、總黃酮提取率關(guān)系由圖3-2可知，隨著料液比的增加，溶質(zhì)與溶劑間的濃度差不斷增大，溶劑中能夠溶解的溶質(zhì)也不斷增大，野菊花總黃酮提取率隨之增大

79、。但當(dāng)乙醇體積到100ml后，再增大溶劑的用量，總黃酮得率增加不明顯，且料液比過大會給后續(xù)的濃縮工作帶來很大壓力。從節(jié)能和提高工作效率角度考慮，溶劑用量不宜過大，故溶劑用量選擇100ml較為合適。 3.1.3 超聲波提取時間對總黃酮含量的影響準(zhǔn)確稱取5.000g菊花粗粉5份，分別加入70的乙醇溶液100mL。浸泡24h，在超聲波溫度為50 的條件下，分別提取30min、50min、70min、90min、110min，減壓抽濾。棄濾渣，濾液減壓蒸餾得浸膏液，干燥浸膏液，得浸膏，稱量，計算出膏率。得出膏率與提取時間的關(guān)系（圖3-3）。浸膏加70的乙醇溶解，用70的乙醇定容于100 mL容量瓶中，

80、搖勻。精密量取5mL，置25mL容量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，作為待測液。測其吸光度A值，得待測液總黃酮含量與提取時間的關(guān)系（圖3-3）。超聲時間對總黃酮含量的影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表3-3所示。表3-3 超聲時間對總黃酮含量的影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果記錄9湖州師范學(xué)院學(xué)士學(xué)位論文超聲時間（min） 30 50 70 90 110浸膏質(zhì)量 （g） 1.1049 1.3725 1.7823 1.8520 1.8301出膏率 （%） 22.10 27.45 35.65 37.04 36.600.157 0.318 0.461 0.513 0.492 吸光度值待測液總黃酮含量（mg/ml） 0.1449 0.3033

81、 0.4441 0.4953 0.4746總黃酮提取率（%） 1.45 3.03 4.44 4.954.75圖3-3 超聲時間與出膏率、總黃酮提取率關(guān)系由圖3可知，提取時間為30min 70min范圍時，總黃酮的提取率隨時間延長逐漸升高，但在70min以后升高不明顯，曲線趨于平穩(wěn)，即提取率增加不明顯?？赡苁且?yàn)樗S酮類物質(zhì)已基本溶出，所以增加提取時間不能使提取率升高。另外考慮到經(jīng)濟(jì)情況，故選擇適宜的提取時間為70min。 3.2 正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計 3.2.1 考察因素及水平選擇乙醇體積分?jǐn)?shù)（A）、液料比（B）、提取時間（C）等3個因素，每個因素選擇3個水平，編制因素水平表（表3-4）。表3-4

82、因素水平表水平 1 23A乙醇體積分?jǐn)?shù)（%）50 60 70B液料比（mL：g）15 20 25C超聲時間（min）40 60 803.2.2 試驗(yàn)與結(jié)果準(zhǔn)確稱取野菊花5.000g，按L9（34）正交表沒計方案進(jìn)行試驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)所得結(jié)果如下表3-5所示。表3-5 正交實(shí)驗(yàn)測得結(jié)果試驗(yàn)號 1 2 3A 1 1 1B 1 2 3C 1 2 3D 1 2 3浸膏質(zhì)量（g）1.6323 1.8095 1.9708吸光度值 0.468 0.462 0.54410湖州師范學(xué)院學(xué)士學(xué)位論文4 5 6 7 8 92 2 2 3 3 31 2 3 1 2 32 3 1 3 1 23 1 2 2 3 11.4308

83、1.8029 1.0107 1.4989 1.5341 1.96830.418 0.576 0.533 0.481 0.361 0.512對上表數(shù)據(jù)進(jìn)行含量計算，以測得野菊花總黃酮出膏率，總黃酮提取率為指標(biāo)進(jìn)行分析。結(jié)果見表3-5。表3-5 L9（34）試驗(yàn)方案及結(jié)果試驗(yàn)號 1 2 3 4 5 6 7 8 9 K1 K2 K3 k1 k2 k3 R（出膏率） 優(yōu)水平 K1 K2 K3 k1 k2 k3R（總黃酮提取率）優(yōu)水平A 11 1 2 2 2 3 3 3 108.26 85.45 100.03 36.09 28.48 33.34 7.61 A1 14.22 14.74 13.04 4.7

84、4 4.91 4.35 0.56 A2B 1 2 3 1 2 3 1 2 3 91.25 102.93 99 30.42 34.31 33 3.89 B2 13.17 13.48 15.35 4.39 4.49 5.12 0.73 B3C 1 2 3 2 3 1 3 1 2 83.54 104.18 105.46 27.85 34.73 35.15 7.3 C3 13.12 13.41 15.47 4.37 4.47 5.16 0.79 C3D 1 2 3 3 1 2 2 3 1 108.08 86.38 98.72 36.03 28.79 32.91 7.24 15.02 14.24 12.

85、74 5.01 4.75 4.25 0.76因素主次 C-B-A出膏率（%）32.65 36.19 39.42 28.62 36.06 20.21 29.98 30.62 39.37因素主次 A-C-B總黃酮提取率（%）4.51 4.45 5.26 4.02 5.57 5.15 4.64 3.46 4.94最優(yōu)方案 A1B2C3最優(yōu)方案 A2B3C33.2.3 小結(jié)由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，影響野菊花總黃酮出膏率的因素順序?yàn)橐掖俭w積分?jǐn)?shù)超聲時間液料比，最佳方案為A1B2C3 ；影響野菊花總黃酮提取率的因素順序?yàn)槌晻r間液料比乙醇體積分?jǐn)?shù)，最佳方案為A2B3C3 。雖然兩種指標(biāo)下的最佳方案不完全一致，

86、但是由于對于本實(shí)驗(yàn)而言，總黃酮提取率較出膏率更為重要。因此，確定最佳方案為A2B3C3 ，即乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%，液料比為25:1，超聲時間為80min。 3.3 穩(wěn)定性考察（驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)）為了考察上述優(yōu)選工藝條件的穩(wěn)定性，按野菊花的最佳提取工藝條件A2B3C3重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次，以野菊花總黃酮提取率為指標(biāo)，結(jié)果見表3-6。3次實(shí)驗(yàn)結(jié)果均優(yōu)于正交實(shí)驗(yàn)表中任何一組，而且各組的提取率都比較接近，與正交實(shí)驗(yàn)中11湖州師范學(xué)院學(xué)士學(xué)位論文的提取率也相吻合，平均提取率為5.62。所以認(rèn)為上述正交實(shí)驗(yàn)得出的最優(yōu)水平是可靠的，該工藝穩(wěn)定可行。表3-6 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)次數(shù)1 2 3A / % 60 60 60B / ml/g25 25 25C / min 80 80 80吸光度值A(chǔ) 0.582 0.576 0.585提取率（%）5.63 5.57 5.66平均值（%）5.624 總結(jié)與展望4.1 總結(jié)通過大量的實(shí)驗(yàn)，結(jié)合理論分析，得出以下結(jié)論： 4.1.1 溶劑的選擇用水浸提提取物雜質(zhì)多，后處理比較麻煩。甲醇、丙酮等作為提取劑，雖然效果不錯，但二者有毒。乙醇浸提的選擇性好，滲透性強(qiáng)，出膏率較高。因此本試驗(yàn)選擇一定體積分?jǐn)?shù)的乙醇溶