血紅蛋白與相關(guān)遺傳病_檢測(cè)實(shí)驗(yàn)

1、血紅蛋白與相關(guān)遺傳病1血紅蛋白電泳紅細(xì)胞滲透脆性實(shí)驗(yàn)珠蛋白基因檢測(cè)HbA23.5%溶血%60%地中海貧血23實(shí)驗(yàn)原理實(shí)驗(yàn)結(jié)果實(shí)驗(yàn)內(nèi)容 根據(jù)不同的血紅蛋白帶有不同的電荷，等電點(diǎn)不同，在一定的pH緩沖液中，緩沖液的pH大于Hb的等電點(diǎn)時(shí)其帶負(fù)電荷，電泳時(shí)在電場(chǎng)中向陽(yáng)極泳動(dòng)，反之，Hb帶正電荷向陰極泳動(dòng)。經(jīng)一定電壓和時(shí)間的電泳，不同的血紅蛋白所帶電荷不同、相對(duì)分子質(zhì)量不同，其泳動(dòng)方向和速度不同，可分離出各自的區(qū)帶，同時(shí)對(duì)電泳出的各區(qū)帶進(jìn)行電泳掃描，可進(jìn)行各種血紅蛋白的定量分析。 血紅蛋白電泳4實(shí)驗(yàn)原理實(shí)驗(yàn)結(jié)果實(shí)驗(yàn)內(nèi)容 血紅蛋白電泳 電泳的介質(zhì)：醋酸纖維薄膜 緩沖液：TEB（pH8.6）材料：pH 8

2、.6 TEB緩沖液適合于檢出HbA、HbA2、HbS、HbC，但HbF不易與HbA分開，HbH與HbBarts不能分開和顯示，應(yīng)再選擇其他緩沖液進(jìn)行電泳分離。 無“拖尾”現(xiàn)象分離速度快靈敏度高5實(shí)驗(yàn)原理實(shí)驗(yàn)結(jié)果實(shí)驗(yàn)內(nèi)容 血紅蛋白電泳準(zhǔn)備點(diǎn)樣洗脫定量6實(shí)驗(yàn)原理實(shí)驗(yàn)結(jié)果實(shí)驗(yàn)內(nèi)容 血紅蛋白電泳A：4；A2：65HbA2含量=A2A2+A2100%* *臨床意義：臨床意義： HbA2參考值：2.0%-3.5% HbA2增多，見于珠蛋白合成障礙性貧血，為雜合子的重要實(shí)驗(yàn)室診斷指標(biāo)。HbE病時(shí)也在HbA2區(qū)帶位置處增加，但含量很大（在10%以上）。HbA2輕度增加亦可見于肝病、腫瘤和某些血液病。=3.0%

3、7實(shí)驗(yàn)原理實(shí)驗(yàn)結(jié)果實(shí)驗(yàn)內(nèi)容 紅細(xì)胞滲透脆性實(shí)驗(yàn)正常紅細(xì)胞懸浮于等滲的血漿中，若將其置于高滲溶液中，紅細(xì)胞會(huì)因失水而皺縮；反之，將其置于低滲溶液中，則水進(jìn)入紅細(xì)胞，使紅細(xì)胞膨脹。如環(huán)境滲透壓繼續(xù)下降，紅細(xì)胞會(huì)因繼續(xù)膨脹而破裂，釋放血紅蛋白，稱為溶血。紅細(xì)胞膜對(duì)低滲溶液具有一定的抵抗力，這一特征稱為紅細(xì)胞滲透脆性。紅細(xì)胞膜對(duì)低滲溶液的抵抗力越大，紅細(xì)胞在低滲溶液中越不容易發(fā)生溶血，即紅細(xì)胞滲透脆性越小。將血液滴入不同的低滲溶液中，可檢查紅細(xì)胞膜對(duì)于低滲溶液抵抗力的大小。開始出現(xiàn)溶血現(xiàn)象的低滲溶液濃度，為該血液紅細(xì)胞的最小抵抗力；開始出現(xiàn)完全溶血時(shí)的低滲溶液濃度，則為該血液紅細(xì)胞的最大抵抗力。8實(shí)驗(yàn)

4、原理實(shí)驗(yàn)結(jié)果實(shí)驗(yàn)內(nèi)容 紅細(xì)胞滲透脆性實(shí)驗(yàn)抗凝全血37反應(yīng)地貧A液上清液測(cè)得H1混勻地貧C液測(cè)得H2離心地貧B液地貧A液：低滲NaCl地貧B液：終止反應(yīng)地貧C液：破壞所有RBC9實(shí)驗(yàn)原理實(shí)驗(yàn)結(jié)果實(shí)驗(yàn)內(nèi)容 紅細(xì)胞滲透脆性實(shí)驗(yàn)H1：270；H2：280溶血%=H1H21.25=77.1%* *臨床意義臨床意義：正常值：溶血%60%脆性增加：試驗(yàn)結(jié)果與正常對(duì)照比較，提高0.04%者即有意義， 見于遺傳性球形紅細(xì)胞增多癥，自身免疫性溶血性貧血伴球形紅細(xì)胞增多癥，也可見于遺傳性橢圓形紅細(xì)胞增多癥和部分遺傳性口形紅細(xì)胞增多癥患者。脆性減低：見于缺鐵性貧血，地中海性貧血，鏈狀細(xì)胞貧血，靶形紅細(xì)胞增多癥，血紅蛋

5、白增多癥，脾切除術(shù)后，肝臟疾病，阻塞性黃疸等。 10實(shí)驗(yàn)原理實(shí)驗(yàn)結(jié)果實(shí)驗(yàn)內(nèi)容 珠蛋白基因檢測(cè)提取DNA擴(kuò)增珠蛋白基因（PCR）PCR產(chǎn)物電泳DNA測(cè)序11實(shí)驗(yàn)原理實(shí)驗(yàn)結(jié)果實(shí)驗(yàn)內(nèi)容 珠蛋白基因檢測(cè)提取提取DNADNA：白細(xì)胞中加雙蒸水，裂解細(xì)胞；加SDS，破壞細(xì)胞膜；加蛋白酶K，消化蛋白質(zhì)；加酚/氯仿/異戊醇，抽提DNA，去除蛋白質(zhì)和脂質(zhì)；加無水乙醇，析出DNA。PCRPCR：利用DNA在體外攝氏95高溫時(shí)變性會(huì)變成單鏈，低溫（經(jīng)常是60C左右）時(shí)引物與單鏈按堿基互補(bǔ)配對(duì)的原則結(jié)合，再調(diào)溫度至DNA聚合酶最適反應(yīng)溫度（72C左右），DNA聚合酶沿著磷酸到五碳糖(5-3)的方向合成互補(bǔ)鏈，達(dá)到在體

6、外擴(kuò)增特定基因的目的。PCRPCR產(chǎn)物電泳產(chǎn)物電泳：在pH高于其pI時(shí)，DNA分子帶負(fù)電荷，在直流電場(chǎng)中通過凝膠介質(zhì)向正極泳動(dòng)。不同的DNA分子因電荷數(shù)、構(gòu)象和分子量大小的不同，在同一電泳系統(tǒng)中的泳動(dòng)速度有差異，達(dá)到分離的目的。12實(shí)驗(yàn)原理實(shí)驗(yàn)結(jié)果實(shí)驗(yàn)內(nèi)容 珠蛋白基因檢測(cè)白細(xì)胞中加雙蒸水，裂解細(xì)胞；加SDS，破壞細(xì)胞膜；加蛋白酶K，消化蛋白質(zhì)；加酚/氯仿/異戊醇，抽提DNA，去除蛋白質(zhì)和脂質(zhì)；加無水乙醇，析出DNA。提取DNAPCR反應(yīng)體系：DNA，dNTP，引物，Taq酶，Mg2+，緩沖液，雙蒸水。變性（94）退火（63）延伸（74）DNA電泳均勻混合DNA與溴酚藍(lán)（電泳指示劑），小心加入制備好的瓊脂糖凝膠的樣品槽內(nèi)，跑電泳，紫外下觀察。13實(shí)驗(yàn)原理實(shí)驗(yàn)結(jié)果實(shí)驗(yàn)內(nèi)容 珠蛋白基因檢測(cè)電泳結(jié)果珠蛋白基因測(cè)序14實(shí)驗(yàn)原理實(shí)驗(yàn)結(jié)果實(shí)驗(yàn)內(nèi)容 珠蛋白基因檢測(cè)15實(shí)驗(yàn)原理實(shí)驗(yàn)結(jié)果實(shí)驗(yàn)內(nèi)容 珠蛋白基因檢測(cè)珠蛋白基因外顯子區(qū)域無突變16實(shí)驗(yàn)原理實(shí)驗(yàn)結(jié)果實(shí)驗(yàn)內(nèi)容 珠蛋白基因檢測(cè)Slide by slide alignment不配對(duì)處較多，經(jīng)驗(yàn)證均處于測(cè)序不穩(wěn)定區(qū)域。17實(shí)驗(yàn)原理實(shí)驗(yàn)結(jié)果實(shí)驗(yàn)內(nèi)容 珠蛋白基因檢測(cè)基因多態(tài)性檢測(cè)第一段外顯子第3位堿基：T第二段內(nèi)含子第16位