交大生化筆記

1、第十二章 DNA 的復(fù)制、修復(fù)與重組 DNA 技術(shù)DNA是儲(chǔ)存遺傳信息的物質(zhì)，親代的遺傳信息如何真實(shí)地傳給子代，這個(gè)問(wèn)題的實(shí)質(zhì)就是DNA分子如何復(fù)制(replication)成完全相同的兩個(gè)拷貝，即DNA的合成，可見通過(guò)復(fù)制，遺傳信息得以在傳代中保留。DNA分子中的遺傳信息又如何表達(dá)呢？現(xiàn)知基因表達(dá)的第一步是通過(guò)轉(zhuǎn)錄(transcription)，即DNA的堿基按互補(bǔ)配對(duì)(G-C, A-T，A-U)的原則轉(zhuǎn)變?yōu)?RNA分子上相應(yīng)的堿基序列，接著 RNA通過(guò)翻譯(translation )，以三個(gè)堿基的序列作為一個(gè)氨基酸的遺 傳密碼， 從而決定蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)。 不同基因編碼不同結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)，

2、表現(xiàn)出不同的功能， 因而體現(xiàn)出多種多樣的生命現(xiàn)象。遺傳信息從DNA經(jīng)RNA流向蛋白質(zhì)的過(guò)程，是Crick于1958年提出的,稱為分子生物學(xué)的中心法則 (central dogma)( 圖 12-1) 。 1970 年 Temin 提出“逆 向轉(zhuǎn)錄” (reverse transcription) 擴(kuò)充了中心法則的范圍?；蚧駾NA是遺傳信息的攜帶者，在細(xì)胞分裂過(guò)程中，親代細(xì)胞所含的遺傳信息，完整 地傳遞到兩個(gè)子代細(xì)胞。這個(gè)過(guò)程的實(shí)質(zhì)問(wèn)題是DNA分子如何復(fù)制成完全相同的兩個(gè)拷貝，有許多酶和蛋白質(zhì)參與復(fù)制過(guò)程，通過(guò)正確和完整的復(fù)制，親代DNA的遺傳信息真實(shí)地傳給子代,這是遺傳信息一代一代傳遞下去的

3、分子基礎(chǔ),這也是本章的重點(diǎn)內(nèi)容。但生物體內(nèi)外 環(huán)境存在著使 DNA分子損傷的因素，因此機(jī)體還必須有一套DNA修復(fù)的機(jī)制。最后還將介紹一些有關(guān)重組DNA技術(shù)的概念和方法。第一節(jié) DNA 復(fù)制的幾個(gè)基本原則一、半保留復(fù)制Watson 和 Crick 于 1953 年提出的 DNA 雙螺旋模型,堿基互補(bǔ)配對(duì)的原則,為 DNA 分 子的復(fù)制提供了理論基礎(chǔ),即親代的 DNA 雙鏈,每股鏈都可以作為模板,按堿基互補(bǔ)配對(duì) 原則指導(dǎo) DNA 新鏈的合成, 這樣合成的兩個(gè)子代 DNA 分子,堿基序列與親代分子完全一樣。 但一條鏈?zhǔn)莵?lái)自親代的 DNA 鏈, 另一條鏈?zhǔn)切潞铣傻逆? 此即為半保留復(fù)制1514(sem

4、iconservative replication) 。用 15N 標(biāo)記親代的 DNA 鏈,而用 14N 標(biāo)記新合成的 DNA 鏈的 實(shí)驗(yàn)，證實(shí)子代的 DNA分子，一股鏈含15N，另一股含14N。、半不連續(xù)復(fù)制DNA雙螺旋的兩股鏈?zhǔn)欠聪蚱叫?(antiparallel)的，新合成的兩股子鏈，一股的方向?yàn)?' t3',另一股為3 't 5'。那么體內(nèi)是否存在兩種 DNA聚合酶？一種催化核苷酸以 5'宀3' 方向聚合，另一種以3 ' t 5 '方向聚合。但從現(xiàn)知所有的 DNA聚合酶都只能催化 5't 3' 方向合成。這

5、個(gè)問(wèn)題直到1968年岡崎(Okazaki)發(fā)現(xiàn)大腸桿菌 DNA復(fù) 制過(guò)程中出現(xiàn)一些含1000 2000 個(gè)核苷酸的片段，一旦合成終止，這些片段即連成一條長(zhǎng)鏈。這種小片段被稱為 岡崎片段(Okazaki fragment)。因此，復(fù)制時(shí)親代 DNA分子中那股3 t 5'方向的母鏈作為 模板，指導(dǎo)新鏈以5' t 3'方向連續(xù)合成，此鏈稱為前導(dǎo)鏈(1eading strand)。在前導(dǎo)鏈延長(zhǎng)1000 2000 個(gè)核苷酸后， 另一母鏈也作為模板指導(dǎo)新鏈也是沿 5 t3 合成 1 000 2 000 個(gè) 核苷酸的小片段，這就是岡崎片段。隨著鏈的延長(zhǎng)，可以有許多個(gè)岡崎片段，這條稱

6、為隨從鏈(1agging strand)?？梢?，隨從鏈為不連續(xù)復(fù)制，所以DNA為半不連續(xù)復(fù)制(semi-discontinuous replication) ，如圖 12-2 所示。復(fù)制后，這些岡崎片段由 DNA 連接酶的作 用而連接成完整的新鏈。三、 RNA 引物目前所發(fā)現(xiàn)的 DNA 聚合酶都需要一個(gè)具 3 -OH 的引物，才能將合成原料 dNTP 一個(gè)一 個(gè)接上去。因?yàn)镈NA聚合酶不能催化兩個(gè)游離的dNTP在DNA模板上進(jìn)行聚合，如圖12-3所示。實(shí)驗(yàn)又發(fā)現(xiàn)抑制 RNA 聚合酶的藥物如利福霉素 (rifampicin) 能抑制 DNA 的復(fù)制。再者 在體外DNA復(fù)制實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)岡崎片段的5&

7、#39;端都有一小段412個(gè)核苷酸的RNA引物(RNAprimer)。現(xiàn)知RNA聚合酶合成新鏈時(shí)不需要引物，能直接催化游離NTP聚合?？梢?RNA引物為DNA聚合酶提供聚合新核苷酸所需的3 ' -OH oRNA引物最后被DNA聚合酶I除去，留下的空隙也由該酶補(bǔ)滿，缺口再由 DNA 連接酶封口。在 DNA 的復(fù)制需要 RNA 引物呢，除了 DNA 聚合酶不能催化兩個(gè)游離 dNTP 的聚合， 而 RNA 引物酶卻具有此能力外， 這種作用尚可盡量減少 DNA 復(fù)制起始處的突變。 因?yàn)橛坞x 核苷酸起始處的聚合最容易出現(xiàn)差錯(cuò)，若用 RNA 引物，即使出現(xiàn)差錯(cuò)，由于最后將被 DNA 聚合酶I切除，

8、便可提高DNA復(fù)制的真實(shí)性。四、復(fù)制的真實(shí)性DNA 復(fù)制的DNA 復(fù)制過(guò)程是非常復(fù)雜的，需要許多酶類和蛋白質(zhì)因子參加。這既保證 速度，又保證產(chǎn)物的高度真實(shí)性。 這也保證了自然界種族延續(xù)中生物遺傳特性的相對(duì)穩(wěn)定性。第二節(jié) 參與 DNA 復(fù)制的一些酶類和蛋白質(zhì)一、大腸桿菌的 DNA 聚合酶DNA 聚合酶（ DNA polymerase ）的作用是將脫氧核苷酸連接成DNA ，所用底物必須是四種脫氧核苷三磷酸 （dNTP ） ，Mg 2+存在和一個(gè) DNA 模板，按模板的序列將配對(duì)的脫氧核 苷酸逐個(gè)接上去， 并且需要一個(gè)具有 3' -0H的RNA弓|物或DNA的3 ' -0H端。使3&

9、#39; -OH 與合成上去的dNTP分子a -磷酸連接成3' , 5'磷酸二酯鍵，合成方向?yàn)?'宀3'，如圖12-4。從大腸桿菌純化得到 3種DNA聚合酶（I,n,川）。（一）DNA聚合酶I1955年Kornberg發(fā)現(xiàn)了 DNA聚合酶I （簡(jiǎn)稱為pol I ），故也稱為 Kornberg酶，并因此 而獲得諾貝爾獎(jiǎng)金。DNA聚合酶I是一條分子質(zhì)量為103X103 Da的多肽鏈。具有多種催化功能。若用蛋白酶輕度水解可得一個(gè)分子質(zhì)量68X103 Da的大片段和一個(gè)分子質(zhì)量為36X103Da 的小片段，常將大片段稱為 Klenow 片段，此片段具有兩種催化活性，一為

10、上述的聚合功 能，另一為3'宀5'外切酶的活性，從 3'端水解DNA產(chǎn)生3'單核苷酸，如圖12-5所示。這種3'宀5'外切酶活性對(duì)保證 DNA復(fù)制的真實(shí)性具有重要的意義。DNA聚合酶在接上新的核苷酸前，它能對(duì)3'末端的堿基進(jìn)行識(shí)別。若為配錯(cuò)的堿基，即通過(guò)3't 5'外切酶活性把配錯(cuò)的堿基切除，再使正確的堿基聚合上去，保證DNA 復(fù)制的高度真實(shí)性，這種功能也稱校讀功能（proof reading）。小片段則具53'外切酶的活性，它能從5'宀3'方向一個(gè)挨一個(gè)切除，產(chǎn)物為5'單核苷酸，或跨過(guò)若干

11、個(gè)核苷酸再進(jìn)行酶解，從5 '末端釋放一寡核苷酸?？沙槠? '端的RNA引物和在DNA損傷修復(fù)中起重要的作用?？梢?，DNA聚合酶I為一條多肽鏈上具有三種酶的活性，也是一種多功能酶（圖12-7）。但DNA聚合酶I并不是大腸桿菌DNA復(fù)制中主要的DNA合成酶，它的主要作用，是切除RNA 弓物、填補(bǔ)空缺和 DNA 損傷的修復(fù)。DNA聚合酶I為一條多肽鏈上具有三種酶的活性，是一種多功能酶（圖12-7）。鑒于Klenow片段兼具聚合及3'5'外切活性，能非常準(zhǔn)確按模板堿基序列合成DNA ,3 / 19所以此片段是分子生物學(xué)常用的工具酶。(二)DNA聚合酶n由一條多肽

12、鏈構(gòu)成。此酶除具有聚合酶的活性外，還具有3't 5'外切酶活性。它在生物體內(nèi)的確切作用不詳，可能也是在 DNA 損傷修復(fù)中起作用。(三)DNA聚合酶川此酶是一個(gè)多聚酶，由10種不同亞基組成的(圖12-8)，稱為DNA聚合酶川全酶(DNApolymerase川holoenzyme)。它具有三個(gè)特點(diǎn)：是一種非常高的續(xù)進(jìn)性(processivity)酶。所謂續(xù)進(jìn)性即在 DNA聚合酶與模板分離下來(lái)之前加入的核苷酸平均數(shù)。續(xù)進(jìn)性仝500 000。而DNA聚合酶I僅合成3200個(gè)核苷酸即自模板上釋放。 DNA聚合酶川催化活性比 DNA 聚合酶I高很多倍，每秒可催化1 000個(gè)核苷酸的聚合，

13、 而DNA聚合酶I每秒僅催化 1620個(gè)核苷酸聚合。DNA聚合酶川不但催化活性大、合成速度快，而且由于具有3'宀5'外切酶活性，產(chǎn)物真實(shí)性高。所以，大腸桿菌DNA聚合酶川是DNA復(fù)制必需的酶。DNA聚合酶川聚合和校正功能分別存在于a和&亞基。3DNA聚合酶川全酶分子質(zhì)量約 900X10 Da,全酶成不對(duì)稱的二聚體， 圍繞著DNA雙螺 旋，每個(gè)單體都具有催化活性，一個(gè)作用于前導(dǎo)鏈，另一個(gè)作用于隨從鏈，使DNA 兩股鏈在同一位置同一時(shí)間進(jìn)行合成。二、真核細(xì)胞的 DNA 聚合酶真核細(xì)胞的 DNA聚合酶有5種，即DNA聚合酶a、B、丫、3和&。DNA聚合酶a 負(fù)責(zé)隨從鏈

14、的合成，DNA聚合酶3和增殖細(xì)胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen , PCNA) 負(fù)責(zé)前導(dǎo)鏈的合成。 PCNA 是作為 DNA 聚合酶 3 活性所需的一種輔助蛋白， 有與 E.coli DNA 聚合酶川的B亞基類似的結(jié)構(gòu)和功能，形成環(huán)狀的夾鉗，大大地增強(qiáng)DNA聚合酶3的續(xù)進(jìn)性。DNA聚合酶丫負(fù)責(zé)線粒體 DNA(mitochondria DNA, mt DNA) 的復(fù)制，DNA聚合酶B和 & 的功能為 DNA 的修復(fù)。三、解旋、解鏈酶類復(fù)制時(shí) DNA 雙螺旋要解開，才能在原來(lái)的母鏈上合成新鏈。復(fù)制在不斷延伸，螺旋要 不斷解開。若每秒鐘復(fù)制 1

15、000個(gè)堿基對(duì)，則要解旋 100次。這樣必然在復(fù)制前方產(chǎn)生很大 的張力，使 DNA 纏結(jié)，這要靠 DNA 拓?fù)洚悩?gòu)酶等來(lái)解決。(一) DNA 解鏈酶DNA 復(fù)制時(shí)，復(fù)制開始部位的 DNA 雙螺旋必須解開成單鏈，模板鏈上的堿基才能以堿 基配對(duì)原則，指導(dǎo)新鏈的合成。解開 DNA 雙螺旋的酶有多種，稱為 DNA 解鏈酶 (DNA helicase),該酶具有 ATP酶的活性，在 ATP的存在下，該酶能解開 DNA雙鏈，每解開1對(duì) 堿基消耗 2 個(gè) ATP。(二 ) 單鏈 DNA 結(jié)合蛋白單鏈 DNA 結(jié) 合蛋白(single strand binding protein , SSB)或螺旋去穩(wěn)定蛋白

16、(helix destabilizing protein HDP) ，能與已被解鏈酶解開的單鏈 DNA 結(jié)合，以維持模板處于單鏈狀 態(tài)，又可保護(hù)其不被核酸酶水解。單鏈 DNA 結(jié)合 SSB 后既可避免重新形成雙鏈的傾向，又 可避免自身發(fā)夾螺旋的形成，還能使前端雙螺旋的穩(wěn)定性降低，易被解開。當(dāng)DNA 聚合酶在模板上前進(jìn)，逐個(gè)接上脫氧核苷酸時(shí)， SSB 即不斷脫離，又不斷與新解開的鏈結(jié)合。(三) DNA 拓?fù)洚悩?gòu)酶 拓?fù)湟辉~是指物體作彈性移位而又保持物體不變的性質(zhì)。 DNA 拓?fù)洚悩?gòu)酶 (topoiso- merase)有兩類：其中拓?fù)洚悩?gòu)酶I,曾有過(guò)多種其他名稱如轉(zhuǎn)軸酶、解纏酶等。它能切斷 DN

17、A 雙鏈中的一股，使 DNA 解鏈旋轉(zhuǎn)時(shí)不致纏結(jié)，解除張力后又把切口封閉。拓?fù)洚悩?gòu)酶 H,又稱旋轉(zhuǎn)酶(gyrase),暫時(shí)切斷 DNA雙鏈，使另一 DNA雙鏈經(jīng)過(guò)此切口，隨后又再封 閉切口。四、引發(fā)體弓I發(fā)體(primosome)是由多種蛋白質(zhì)及酶組成，是DNA復(fù)制開始所必需的。引發(fā)體中的某些蛋白質(zhì)如 DnaA 能結(jié)合至 DNA 復(fù)制起始部位, DnaB 具有解鏈酶的作用, DnaC 輔助 DnaB 結(jié)合到復(fù)制起始點(diǎn)，使起始部位的雙鏈解開。而引發(fā)體中的引物酶(primase)在已解開起始部位的 DNA 單鏈按堿基互補(bǔ)配對(duì)催化 NTP 聚合,合成一小片段的 RNA ,作為 DNA 合成的引 物，

18、即沿此引物 RNA的3' -OH進(jìn)行延伸。五、 DNA 連接酶DNA連接酶(DNA 1igase)催化兩段DNA鏈之間磷酸二酯鍵的形成。要求DNA鏈3'端有游離的 0H，而5'端帶有磷酸根，連接過(guò)程需要ATP供能,如圖12-9。DNA 連接酶不能連接兩分子單鏈的 DNA ，只能作用雙鏈 DNA 分子中一股鏈上的缺口，或雙鏈 DNA 分子雙股的缺口。 如 DNA 經(jīng)限制性內(nèi)切核酸酶切割后， 兩個(gè)片段的粘性末端相配，DNA連接酶能使之連接。即使是兩段平齊DNA , DNA連接酶也能使之連接。在DNA復(fù)制過(guò)程中，當(dāng)RNA引物清除后，靠DNA聚合酶I填補(bǔ)空缺，岡崎片段之間的缺口

19、靠 DNA 連接酶作用而連成完整的一條新鏈。 DNA 連接酶在 DNA 損傷修復(fù)中亦起重要作用，并且是 一種重要的工具酶。第三節(jié) DNA 復(fù)制過(guò)程一、復(fù)制的起始大腸桿菌復(fù)制時(shí)有特定的起始部位稱為oriC，長(zhǎng)度為245bp。有3個(gè)串連排列的核苷酸序列，每個(gè)由 13 個(gè)核苷酸組成。其序列基本相同為 GATCTNTTNTTTT ，而且 GATC 在 oriC 部位出現(xiàn) 11 次， oriC 還有 4 個(gè) DnaA 結(jié)合位點(diǎn)，是 4 個(gè) 9bp 序列的反向重復(fù)，這些序列都 是高度保守的(圖 12-10。)DnaA先結(jié)合至復(fù)制起始點(diǎn)，然后發(fā)動(dòng)了復(fù)雜的變化。DnaB和DnaC亦參加進(jìn)去，從而使雙鏈解開，

20、DNA 結(jié)合蛋白便與單鏈 DNA 結(jié)合。接著引物酶按堿基配對(duì)原則合成一小段的 RNA引物，此引物的3' -OH可供DNA聚合酶川將第一個(gè) dNTP加到3' -0H上而形成3 5'磷酸二酯鍵。復(fù)制是從oriC開始，同時(shí)向兩個(gè)方向進(jìn)行的，稱為雙向復(fù)制(bi-directionalreplication) 。復(fù)制開始后由于 DNA 雙鏈解開，在兩股單鏈上進(jìn)行復(fù)制。在電子顯微鏡下觀察DNA復(fù)制前進(jìn)部位伸展成叉狀，稱為復(fù)制叉 (replication fork) ，如圖 12-12。二、復(fù)制的延長(zhǎng)在DNA聚合酶川的作用下，新合成的DNA鏈不斷延長(zhǎng)。大腸桿菌的岡崎片段長(zhǎng)度為1000

21、2 000個(gè)核苷酸，即前導(dǎo)鏈合成 1 0002 000 個(gè)核苷酸后，隨從鏈便開始合成。在延長(zhǎng)過(guò) 程中，由于拓?fù)洚悩?gòu)酶的作用，避免了在復(fù)制叉前方的 DNA 打結(jié)。三、復(fù)制的終止在DNA延長(zhǎng)階段結(jié)束后，原核生物的 RNA引物被DNA聚合酶I切除。留下的空隙， 由DNA聚合酶I進(jìn)行補(bǔ)滿，即從另一岡崎片段的 3' -OH按5'宀3'根據(jù)堿基配對(duì)原則， 將一個(gè)個(gè)的 dNTP 補(bǔ)上去。最后的缺口再由 DNA 連接酶將相鄰的兩個(gè)核苷酸借磷酸二酯鍵 連起來(lái)，即成完整的一條新鏈， DNA 的復(fù)制即告完成，如圖 12-15。6 / 19四、真核生物端粒 DNA 的復(fù)制真核生物線性染色體的兩

22、個(gè)末端稱為端粒（telomere）。按上述DNA復(fù)制機(jī)制新合成子鏈5'端的那段RNA引物被切除后，必留下一個(gè)空缺，假如每次細(xì)胞分裂或DNA復(fù)制都是如此，端粒將會(huì)不斷縮短，最終導(dǎo)致關(guān)鍵基因的喪失及種系滅絕的危險(xiǎn)，但事實(shí)并非如此。那 么真核生物一定存在著某種阻止端粒縮短的機(jī)制。（一 ） 端粒 DNA 的結(jié)構(gòu)和端粒酶對(duì)端粒 DNA 序列的分析，發(fā)現(xiàn)端粒 DNA 的 3'端是由數(shù)百個(gè)串聯(lián)重復(fù) GT 豐富的短的 寡核苷酸序列，如四膜蟲的重復(fù)序列為-GGGGTT-，人為-AGGGTT-。端粒DNA序列雖不含功能基因，但對(duì)維持染色體的穩(wěn)定性起著重要作用。如果端粒喪失，染色體之間可能出現(xiàn)端 -

23、端融合、降解、重排乃至染色體丟失等變化，最后細(xì)胞衰亡。近年來(lái)，發(fā)現(xiàn)了一種能防止端粒縮短的酶，稱為端粒酶（telomerase）,該酶由蛋白質(zhì)和 RNA 兩部分組成，其中 RNA 作為合成端粒 DNA 的模板，端粒酶是目前所知唯一攜帶 RNA 模板 的逆轉(zhuǎn)錄酶,具有種屬特異性,例如四膜蟲的端粒酶,其 RNA 部分含 159 個(gè)核苷酸,其中 有一段序列為 5' -CAACCCCAA-3 '可作為合成端粒 DNA3 '端 GT 豐富序列 -GGGGTT- 模 板。人端粒酶的 RNA 含 450 個(gè)堿基,其中 -CUAACCCUAAC- 為合成 -AGGGTT- 的模板。這 樣

24、可防止細(xì)胞分裂時(shí) DNA 復(fù)制端粒的縮短。端粒、端粒酶和細(xì)胞的衰老有密切關(guān)系。有人將端粒稱為分子鐘或有絲分裂鐘。但是惡 性腫瘤細(xì)胞當(dāng)端?？s短到某種程度,端粒酶活性又重新出現(xiàn),對(duì)端粒進(jìn)行補(bǔ)償,使之永不衰 亡,形成惡性增殖。（二）端粒酶的作用機(jī)制第四節(jié) DNA 的損傷與修復(fù)DNA 是儲(chǔ)存遺傳信息的物質(zhì)。 從生物遺傳角度來(lái)講, 要求在復(fù)制過(guò)程中保持遺傳密碼的 穩(wěn)定性, 物種才能得以延續(xù)。 哺乳動(dòng)物單倍體細(xì)胞的基因組由2.9X109 bp DNA 組成。 動(dòng)物一生中, 從受精卵細(xì)胞到個(gè)體死亡, 這些遺傳密碼要經(jīng)過(guò)千萬(wàn)次的復(fù)制。 在物種進(jìn)化的長(zhǎng)河中, DNA 復(fù)制的次數(shù)更是難以計(jì)數(shù),而且生物體內(nèi)外環(huán)境都

25、存在著使DNA 損傷（ DNA damage）的因素?？梢?除 DNA 復(fù)制的高度真實(shí)性外,還要求某種修復(fù) DNA 損傷的機(jī)制。每一遺傳 信息都以不同拷貝儲(chǔ)存在 DNA 兩條互補(bǔ)鏈上。因此,若一條鏈有損傷,可被修復(fù)酶切除,并以未損傷的信息重新合成與原來(lái)相同的序列，這就是 DNA 修復(fù)( DNA repair )的基礎(chǔ)。 但是在漫長(zhǎng)的進(jìn)化過(guò)程中， DNA 的序列還是會(huì)發(fā)生改變 , 通過(guò)復(fù)制傳遞給子代成為永久 的，這種 DNA 的核苷酸序列永久的改變稱為突變 (mutation) 。若發(fā)生的突變有利于生物的生 存則保留下來(lái)，這就是進(jìn)化；若不適應(yīng)于自然選擇(nature selection) 則被淘

26、汰，因此生物的進(jìn)化可以看成是一種主動(dòng)的基因改變過(guò)程，這是物種多樣性的原動(dòng)力。所以，生物的變異是絕 對(duì)的，修復(fù)是相對(duì)的。一、造成 DNA 損傷的因素造成 DNA 損傷的因素有生物體內(nèi)自發(fā)的、亦有外界物理和化學(xué)等因素。(一 ) 自發(fā)的因素由于 DNA 分子受到周圍環(huán)境溶劑分子的隨機(jī)熱碰撞 (thermal collision) ，腺嘌呤或鳥嘌呤與脫氧核糖間的N-糖苷鍵可以斷裂，使A或G脫落。人體細(xì)胞中DNA每天每個(gè)細(xì)胞要脫落5 000 個(gè)嘌呤堿，每天每個(gè)細(xì)胞也有 100 個(gè)胞嘧啶自發(fā)脫氨而成尿嘧啶。(二 ) 物理因素1紫外線損傷由于嘌呤環(huán)與嘧啶環(huán)都含有共軛雙鍵，能吸收紫外線而引起損傷。嘧啶堿引起的

27、損傷比嘌呤堿大10倍。損傷是由于嘧啶二聚體的產(chǎn)生，即2 個(gè)相鄰嘧啶堿的 C5和C6共價(jià)交聯(lián)，如圖12-18所示。2 電離輻射損傷如X射線和丫射線，可以是輻射能量直接對(duì)DNA的影響，或DNA周圍的溶劑分子吸收了輻射能，再對(duì) DNA 產(chǎn)生損傷作用。如堿基的破壞、單鏈的斷裂、雙 鏈的斷裂、分子間的交聯(lián)、堿基脫落或核糖的破壞等。(三 ) 化學(xué)因素二、DNA 損傷的類型根據(jù) DNA 分子的改變，可把突變分為下面幾種主要類型。(一)點(diǎn)突變點(diǎn)突變(point mutation)是DNA 分子上一個(gè)堿基的變異，可分為：轉(zhuǎn)換(transition)同型堿基，如一種嘌呤代替另一種嘌呤或一種嘧啶代替另一嘧啶。顛換(

28、transversation)異型堿基，即嘌呤變嘧啶，或嘧啶變嘌呤。點(diǎn)突變可根據(jù)發(fā)生在DNA 分子的部位，如發(fā)生在啟動(dòng)子或剪接信號(hào)部位可以影響整個(gè)基因的功能；若發(fā)生在編碼序列，有的可以改變蛋白質(zhì)的功能如引起鐮狀紅細(xì)胞貧血；有的則為中性變化，即編碼氨基酸雖變化，但功能不受影響；有的甚 至是靜止突變，堿基雖變但編碼氨基酸種類不變。(二 ) 缺 失缺失 (deletion) 是一個(gè)堿基或一段核苷酸鏈乃至整個(gè)基因，從 DNA 大分子上丟失。如有 些地中海貧血、生長(zhǎng)激素基因缺失，再如上述Lesch- Nyhan 綜合征是 HGPRT 基因缺失。(三) 插入插入 (insertion) 是一個(gè)原來(lái)沒有的堿

29、基或一段原來(lái)沒有的核苷酸序列插入到 DNA 大分子 中去，或有些芳香族分子如吖啶(acridine) 嵌入 DNA 雙螺旋堿基對(duì)中，可以引起移碼突變(frame-shift-mutation) ，影響三聯(lián)體密碼的閱讀方式。(四) 倒位DNA 鏈內(nèi)部重組，使其一段方向顛倒。三、修復(fù)機(jī)制(一 ) 光修復(fù)機(jī)制這種機(jī)制主要存在于低等生物。1. 不需要光復(fù)活酶光復(fù)活酶 (photoreactivating enzyme) 也稱為 DNA 光修復(fù)酶 (photolyase) 。當(dāng) 280nm 紫外線 照射 DNA 產(chǎn)生的嘧啶二聚體，在短波 239nm 照射下，二聚體即分解成單體。2. 需要光復(fù)活酶 紫外線

30、照射使光復(fù)活酶激活，能解聚嘧啶二聚體。(二 ) 切除修復(fù)因不需要光照射，故也稱暗修復(fù)。DNA引起大的損傷，包括UV引起的嘧啶二聚體、嘧啶/ 環(huán)丁烷二聚體、幾個(gè)其它類型的堿基加合物、通過(guò)曝露于香煙的煙塵在DNA 中形成的苯并芘尿嘧啶。一般由切除修復(fù)(excision repair)系統(tǒng)修復(fù)。該修復(fù)途徑對(duì)所有生物的生存是關(guān)鍵的。在大腸桿菌 E.coli 中，有一種 UV 特異的切割酶 (excinuclease 或 UVrABC enzyme) ， 能識(shí)別UV照過(guò)產(chǎn)生的二聚體部位。并在遠(yuǎn)離損傷部位5'端8個(gè)核苷酸處及3 '端4個(gè)核苷酸處各作一切口。像外科手術(shù)“擴(kuò)創(chuàng)”一樣，將含損傷的

31、一段DNA切掉。DNA聚合酶I進(jìn)入此縫隙， 從 3' -OH 開始，按堿基配對(duì)原則以另一條完好鏈為模板進(jìn)行修復(fù)。 最后由 DNA 連接酶將新合成的 DNA 片段與原來(lái) DNA 鏈連接而封口 (圖 12-19) 。真核細(xì)胞的切割核酸酶的作用和機(jī)制，是與細(xì)菌的酶完全類似的方式對(duì)嘧啶二聚體切割。切除修復(fù)是人體細(xì)胞的重要修復(fù)形式，有些遺傳性疾病如著色性干皮病(xeroderma pigmentosum) ，是常染色體隱性遺傳性疾病。純合子患者的皮膚對(duì)陽(yáng)光或紫外線極度敏感，皮膚變干、真皮萎縮、角化、 眼瞼結(jié)疤、角膜潰瘍，易患皮膚癌。此病是由于缺乏 UV 特異內(nèi)切核酸酶造成的。(三 ) 堿基切除修

32、復(fù)每個(gè)細(xì)胞都有一類 DNA 糖苷酶 (DNA glycosylase) ，每一種酶能識(shí)別一種 DNA 分子中改 變的堿基，能水解該改變的堿基與脫氧核糖間的糖苷鍵，使改變的堿基脫落，在 DNA 上產(chǎn) 生一個(gè)缺嘌呤或缺嘧啶的位( apurinic-or apyrimidinic-site ， AP site) ,再藉切除修復(fù)機(jī)制進(jìn)行 修復(fù)。現(xiàn)知至少有 20 種不同的 DNA 糖苷酶，各具特異性。 如識(shí)別胞嘧啶脫氨生成的尿嘧啶， 腺嘌呤脫氨基產(chǎn)物，開環(huán)的堿基，不同烷基化類型的堿基等。如胞嘧啶脫氨后即成尿嘧啶， 若不糾正，可引起類型轉(zhuǎn)換，即G-C t A-T。堿基切除修復(fù)( base-excision

33、 repair )步驟如下：1) DNA 糖苷酶識(shí)別損傷的堿基 , 在堿基和脫氧核糖之間切割。2) AP 核酸內(nèi)切酶切 AP 位置附近的磷酸二酯鍵。3) DNA聚合酶I用它的53 '外切酶活性除去損傷鏈，從缺口的3' - OH起始 修復(fù)合成 , 用新合成的 DNA 替代。4) 最后缺口由 DNA 連接酶封口 (圖 12-20)。尿嘧啶DNA糖苷酶修復(fù)的發(fā)現(xiàn)，解答了一個(gè)長(zhǎng)年以來(lái)的疑題，即組成 RNA是U，而組 成DNA卻是甲基化為T,即從UMPtdTMP，要消耗能量。但 U和T都與A互補(bǔ)配對(duì)，所 編的密碼是相同的。生物體為什么花如此代價(jià) ? 現(xiàn)在問(wèn)題清楚了，尿嘧啶 -DNA 糖苷

34、酶只能 切除DNA鏈上的尿嘧啶，而不能切除 DNA鏈上的胸腺嘧啶，因?yàn)楹笳?C5有一甲基，好像 是給尿嘧啶加上一個(gè)標(biāo)簽。胞嘧啶脫氨基后形成的尿嘧啶即無(wú)此標(biāo)簽，即被該糖苷酶識(shí)別為 改變了的堿基。若 DNA 與 RNA 一樣也用尿嘧啶， 那么胞嘧啶脫氨形成尿嘧啶， 與正常部位 的尿嘧啶便無(wú)法區(qū)別， 不能糾正，造成子代DNA的突變即GCt AT。可見DNA由T代替U , 能增加遺傳信息的穩(wěn)定性。相反， RNA 不需修復(fù)，拷貝數(shù)很多，半衰期短，即使有個(gè)拷貝的 胞嘧啶脫氨基轉(zhuǎn)變?yōu)?U，影響也不大，合成出來(lái)的絕大多數(shù)蛋白質(zhì)還是具有正常生理功能，而且 U 作為合成原料經(jīng)濟(jì)得多。第五節(jié) 重組 DNA 技術(shù)DN

35、A 重組 (recombination of DNA) 是自然界常見現(xiàn)象，指的是在兩個(gè) DNA 分子之間，或 一個(gè) DNA 分子的兩個(gè)不同部位之間通過(guò)鏈斷裂和片段的交換重接， 改變了基因的組合序列。 這種交換可發(fā)生于同一細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞間，甚至不同物種的 DNA 。 DNA 重組現(xiàn)象廣泛存在于 真核細(xì)胞、原核細(xì)胞乃至病毒和質(zhì)粒。本節(jié)所要介紹的重組 DNA 技術(shù)或基因工程 (genetic engineering) ，是 70 年代由 Stanford 大學(xué) Boyer 、Cohen 和 Berg 等科學(xué)家建立的一種革命性的技術(shù)方法，它是在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)用人工 方法將不同來(lái)源， 包括不同種屬生物的 DNA

36、 片段， 拼接成一個(gè)重組 DNA(recombinant DNA) 分子，將其引入活細(xì)胞內(nèi)，使其大量復(fù)制或表達(dá)。這種技術(shù)方法稱為重組 DNA 技術(shù)。由于 它可以把一個(gè)生物體中攜帶的某一特定的遺傳信息(基因 )，通過(guò)一定的方法轉(zhuǎn)移到另一生物體中，使之獲得前者的遺傳特征，創(chuàng)造新的遺傳組合，所以又稱為基因工程，若從遺傳角度 來(lái)考慮也可稱為遺傳工程。 重組 DNA 技術(shù)中所含有的目的 DNA 分子或基因需進(jìn)行無(wú)性繁殖、 擴(kuò)增成為一個(gè)克隆 (clone) ，因此基因工程在不同的場(chǎng)合又可有不同的名稱，如分子克隆 (molecular cloning) 、 DNA 克隆、基因克隆等。一、基因工程的基本步驟

37、基因工程可分為三個(gè)過(guò)程。(一 ) 重組 DNA 分子的構(gòu)建即將一目的 DNA 序列或基因共價(jià)連接于一個(gè) DNA 載體上構(gòu)成一個(gè)重組 DNA 分子。(二 ) 引入宿主細(xì)胞用轉(zhuǎn)化、感染或轉(zhuǎn)染等方法使重組 DNA 分子進(jìn)入宿主細(xì)胞，如細(xì)菌、酵母、動(dòng)物細(xì)胞。(三 ) 篩選挑選含有重組 DNA 分子的細(xì)胞，使之克隆化并加以鑒定，可大量擴(kuò)增或表達(dá)。二、重組 DNA 分子的構(gòu)建重組 DNA 分子的構(gòu)建需要下面幾個(gè)方面的條件與方法。(一 ) 目的基因或 DNA 片段所要研究的某一基因或某段 DNA 序列有下列來(lái)源：1基因組 DNA(genomic DNA)2cDNA 可以是先分離某一特殊 mRNA ，這些 m

38、RNA 在逆轉(zhuǎn)錄酶催化下合成單股互 補(bǔ) DNA(complementary DNA ， cDNA) ，再由 DNA 聚合酶合成雙股 cDNA ，供構(gòu)建用。 若將某種細(xì)胞中所有 mRNA 都抽提出來(lái)， 并制備成各自相應(yīng)的 cDNA 。此包含某特定細(xì) 胞的全部cDNA克隆即為cDNA文庫(kù)(cDNA library),由此建立的文庫(kù)，包括了這種細(xì)胞所有 表達(dá)的基因的序列。與基因組文庫(kù)不同點(diǎn)為 cDNA 不含內(nèi)含子成分，也不含不轉(zhuǎn)錄的序列。 cDNA 文庫(kù)中所含 cDNA 的情況也因不同組織細(xì)胞和不同發(fā)育階段及不同生理狀態(tài)而不同。3人工合成的 DNA 片段4聚合酶鏈反應(yīng) (PCR) 擴(kuò)增 DNA 片段

39、或 cDNA以已有 DNA 為模板，通過(guò) PCR 擴(kuò)增出所需片段。另可以 mRNA 為模板，采用逆轉(zhuǎn)錄 酶 PCR 進(jìn)行擴(kuò)增，得到所需要的cDNA 。 (詳見下節(jié) )。(二 ) 載體欲將外源基因或 DNA 片段導(dǎo)入宿主細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增或表達(dá)，需要通過(guò)一個(gè)能在宿主細(xì)胞中進(jìn)行自我復(fù)制并表達(dá)目的基因的載體(vector)的介導(dǎo)，目的 DNA與載體在體外構(gòu)成重組DNA 分子， 然后導(dǎo)入宿主細(xì)胞， 進(jìn)行擴(kuò)增及表達(dá)。 以大腸桿菌作為宿主細(xì)胞的載體有： 質(zhì)粒、 入噬菌體、粘粒和 M13噬菌體等。這些載體分為克隆用和表達(dá)用不同種類，有些還含有在真 核細(xì)胞中生活及基因表達(dá)必須的成分，供不同實(shí)驗(yàn)?zāi)康倪x用，多數(shù)已作為商

40、品供應(yīng)。1. 克隆載體 (vector of clone)(1)質(zhì)粒質(zhì)粒(plasmid)是細(xì)菌染色體外小的雙鏈閉環(huán)的DNA分子，能自主復(fù)制，并含有抗藥性基因。較理想的質(zhì)粒應(yīng)符合下列條件：1) 要有多個(gè)單切口的限制性內(nèi)切酶的位點(diǎn)，而且外源 DNA 片段插入后，不影響質(zhì)粒的 復(fù)制。2) 含有抗藥性或其他可供篩選的標(biāo)志，外源 DNA 插入后，抗藥性消失，或其他酶活性 喪失。3) 含有高效的自主復(fù)制序列， 這樣在宿主細(xì)胞中質(zhì)粒復(fù)制的拷貝數(shù)多。 若含有能在真核細(xì)胞生活的序列，這種載體則能在真核細(xì)胞中生活及表達(dá)。pBR322 是一種最常用、最基礎(chǔ)的質(zhì)粒。通過(guò)人工構(gòu)建而成，其結(jié)構(gòu)如圖 12-22 所示。大

41、小： 4363bp 抗藥性基因：有兩個(gè)。氨芐青霉素抗性(ampicillin resista nee ,ampR )基因編碼3 -內(nèi)酰胺酶(B -lactamase),能切開氨芐青霉素的內(nèi)酰胺環(huán)，從而使之失效。若在此基因中插入外源 DNA 片段，即破壞該酶的結(jié)構(gòu)。 另一四環(huán)素抗性(tetracycline resistanceamp基因，編碼一種蛋白質(zhì)，能改變細(xì)菌膜的狀態(tài)， 阻止四環(huán)素進(jìn)入細(xì)胞而賦予宿主抗四環(huán)素的能力。若該基因被外源DNA 插入即失活。自主復(fù)制(ori)成分(序列),使pBR322在大腸桿菌內(nèi)能高效進(jìn)行復(fù)制，產(chǎn)生多拷貝。另一些質(zhì)粒如 pUC 系統(tǒng),除含 ampr 基因外,還含大

42、腸桿菌的 lacZ 基因也常被用作為選 擇的標(biāo)記。此基因編碼 3 半乳糖苷酶。 LacZ 位于多位點(diǎn)接頭 (polylinker) 上。有的還含有高效 的啟動(dòng)子。(2) 入噬菌體 入噬菌體(bacteriophage入)為線狀雙鏈 DNA病毒(約50kb)，感染大腸桿菌。經(jīng)改造的噬菌體有一、二個(gè)EcoR I切點(diǎn)，并含有 LacZ基因作為篩選的標(biāo)志。當(dāng)中的1/3序列不是病毒生活所必需，可以去除，而由外源DNA片段(525kb)替代。如圖12-23所示。3 -半乳糖苷酶能分解一種化學(xué)品稱為5-溴-4-氯-3 吲哚 -半乳糖苷 (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-galactos

43、ide , X-gal) , X 即為 5-bromo-4-chloro-3-indolyl ,是一發(fā)色 (藍(lán)色 )基團(tuán),當(dāng) 它與半乳糖以糖苷鍵結(jié)合時(shí)即為無(wú)色。 但是 X-gal 經(jīng)3 -半乳糖苷酶作用后即將X 基團(tuán)釋放出來(lái)而成藍(lán)色。 若 LacZ 被插入的 DNA 片段破壞, 則不能產(chǎn)生 3 -半乳糖苷酶, 因此在含有 X-gal 的培養(yǎng)基中成為無(wú)色的斑點(diǎn)。若 LacZ 完整, X-gal 被3 -半乳糖苷酶分解而成為藍(lán)色的斑點(diǎn), 故可作為篩選的標(biāo)志。(3) 其他2. 表達(dá)載體( expression vector) 表達(dá)載體是帶有調(diào)控克隆基因表達(dá)必需的轉(zhuǎn)錄和翻譯信號(hào)的克隆載體?？寺』蛟诩?xì)

44、菌和其它細(xì)胞中的過(guò)量表達(dá),能夠產(chǎn)生大量的特異蛋白質(zhì)。(1)大腸桿菌表達(dá)載體大腸桿菌表達(dá)載體(E.coli expression vector)除具有克隆載體所具備的性質(zhì)以外,還帶有控制在大腸桿菌中表達(dá)元件即轉(zhuǎn)錄和翻譯所必需的DNA 序列 : 啟動(dòng)子、操縱基因、編碼阻遏物的基因、核糖體結(jié)合位點(diǎn)、轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)。( 2)真核表達(dá)載體 真核表達(dá)載體( eukaryotic expression vector )含有必不可少的原核序 列,如在大腸桿菌中能夠作用的復(fù)制子,便于挑選帶重組質(zhì)粒細(xì)菌的抗生素抗性基因。但在質(zhì)粒中還包括在真核細(xì)胞中生活和表達(dá)元件：?jiǎn)?dòng)子 / 增強(qiáng)子、克隆位點(diǎn)、終止信號(hào)和加 poly

45、(A) 信號(hào)、剪接供體和受體、復(fù)制起始點(diǎn)和選擇標(biāo)記基因。(三 ) 工具酶限制性內(nèi)切酶 (restriction enzyme 或 restriction endonuclease)， DNA 連接酶、末端脫氧核 苷酸轉(zhuǎn)移酶 (terminal deoxynucleotidyl transferase， TdT) 、逆轉(zhuǎn)錄酶、 S1 核酸酶 (切單鏈 DNA 或 RNA) 、堿性磷酸酶等均屬工具酶。 限制性內(nèi)切酶是重組 DNA 技術(shù)中最關(guān)鍵的工具酶， 現(xiàn) 著重加以介紹。限制性內(nèi)切酶是微生物的一種自我保護(hù)的酶，它能識(shí)別雙鏈 DNA 分子中特異堿基序列 并切開。 所以當(dāng)外源 DNA 侵入細(xì)菌體時(shí)，

46、細(xì)菌體為保護(hù)自身 DNA 的完整性， 通過(guò)其所含的 特有的限制性內(nèi)切酶對(duì)外源 DNA 進(jìn)行酶解， 而自身的 DNA 分子中所含該限制性內(nèi)切酶的識(shí) 別堿基序列則被另一種酶進(jìn)行甲基化而保護(hù)起來(lái)，故不被自己的限制性內(nèi)切酶所切斷。 限制性內(nèi)切酶識(shí)別的 DNA 序列多數(shù)為 46 個(gè)堿基，新近發(fā)現(xiàn)一些能識(shí)別 8 個(gè)堿基的。識(shí)別 堿基數(shù)少的酶對(duì) DNA 切的機(jī)率多，堿基數(shù)大則少。所以識(shí)別 8 個(gè)堿基序列的酶，可用于分 析大片段 DNA ，可切成上百乃至上千 kb 的片段。限制性內(nèi)切酶的識(shí)別序列都具有回文或雙 重對(duì)稱結(jié)構(gòu)的特點(diǎn)。切口：有兩種切口。一種切開后，即成黏性末端 (cohesive ends 或 st

47、icky ends) ，因?yàn)閮蓚€(gè) 末端的堿基互補(bǔ)配對(duì)，易通過(guò)氫鍵相連。有些限制性內(nèi)切酶的切口，成為平頭末端 (blunt ends)不同的 DNA 分子上若有某一種限制性內(nèi)切酶的位點(diǎn)，均能被該酶切斷，并產(chǎn)生相同的 切口，這對(duì)重組 DNA 分子很有利。拼接方法：1. 黏性末端2均聚體尾部 (homopolymeric tailing)3化學(xué)合成的接頭 (chemical synthetic linker)三、重組 DNA 分子引入宿主細(xì)胞(一 ) 原核細(xì)胞最常用的是大腸桿菌，要選擇合適的菌株(stra in)。宿主細(xì)胞先經(jīng)氯化鈣處理，以改變細(xì)胞膜的通透性， 使重組 DNA 分子容易進(jìn)入。 這種將

48、重組質(zhì)粒 DNA 分子引入細(xì)菌， 使其在細(xì) 菌體內(nèi)擴(kuò)增及表達(dá)的過(guò)程稱為轉(zhuǎn)化 (transformation) 。(二 ) 動(dòng)物細(xì)胞宿主細(xì)胞主動(dòng)攝取或被動(dòng)引入外源 DNA 片段或重組 DNA 分子的過(guò)程稱為轉(zhuǎn)染 (transfection) 。進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的 DNA 可以被整合至宿主的基因組中， 也可以在染色體外生活表達(dá)， 這就需要采用含有能在真核細(xì)胞生活的結(jié)構(gòu)成分的載體?？捎昧姿徕}介導(dǎo) (calcium-phosphate mediated)使外源DNA形成沉淀顆粒，顆粒若沉著在動(dòng)物細(xì)胞的表面，以利細(xì)胞將這些顆粒攝 入。近年用脂質(zhì)體 (1iposome) 介導(dǎo)外源 DNA 的轉(zhuǎn)移，可提高轉(zhuǎn)染效率

49、。 用電穿孔 (electroporation) 方法，將外源 DNA 與宿主細(xì)胞放入特別的裝置內(nèi)，在高壓電脈沖作用下，細(xì)胞外的DNA 分子會(huì)在細(xì)胞膜上穿孔而入，并最終進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)，整合至宿主基因組中。用基因槍(顆粒轟擊 particle bombardment)方法是將外源 DNA包裹了化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定的金或鎢微粒以后，在電子發(fā) 射裝置或高壓氣流的驅(qū)動(dòng)下， 以極高速度打入受體細(xì)胞， 組織和器官中， 以進(jìn)行基因轉(zhuǎn)移技術(shù)。用逆轉(zhuǎn)錄病毒(retrovirus)作為載體可以成功地感染動(dòng)物細(xì)胞。另外可用微注射 (microinjection) 的方法，將外源 DNA 分子直接注射入細(xì)胞內(nèi)或核內(nèi)。近年發(fā)展一

50、種轉(zhuǎn)基因 (transgenic)小鼠方法，即將重組DNA分子注射于單細(xì)胞受精卵的原核內(nèi)，然后再將其植入一假妊娠母鼠的子宮內(nèi)。生下的小鼠在全身各組織細(xì)胞的基因組DNA 中都含有這種外源DNA ，可以研究在整體條件下外源 DNA 的功能。四、篩選(一 ) 根據(jù)選擇標(biāo)志含有重組質(zhì)粒 DNA 菌落的選擇，主要可借用抗藥性標(biāo)記來(lái)篩選。例如，某一外源DNA片段，插在pBR322的Pst I位點(diǎn)，根據(jù)轉(zhuǎn)化的情況，可以篩選被重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的菌落。沒有轉(zhuǎn) 化的細(xì)菌在含有氨芐青霉素或四環(huán)素的培養(yǎng)基中都不能生長(zhǎng)；被重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的細(xì)菌，在含 有四環(huán)素的培養(yǎng)基中能生長(zhǎng)，而在含有氨芐青霉素的培養(yǎng)基中則不能生長(zhǎng)。未被重組的

51、 pBR322 質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的細(xì)菌則在這兩種培養(yǎng)基中均能生長(zhǎng)。因此，根據(jù)菌落的不同抗藥性可以 篩選出含有重組質(zhì)粒的菌落。同理可以篩選出插入在四環(huán)素抗藥性基因的質(zhì)粒。常根據(jù)噬菌體所含的 LacZ 基因是否被插入片段破壞來(lái)篩選。 無(wú)色的噬菌斑表示 LacZ 被 破壞， 即這種噬菌體含有外源 DNA 。藍(lán)色的噬菌斑， 表示 LacZ 不被破壞， 即不含插入片段。(二 ) 菌落或噬菌斑原位斑點(diǎn)雜交用標(biāo)記的已知 DNA 或 RNA 作為探針，來(lái)篩選所要的克隆 (詳見下述 )。(三 ) 蛋白質(zhì)表達(dá)產(chǎn)物的測(cè)定 可以用放射免疫方法來(lái)篩選，即先制備所要研究的蛋白質(zhì)的抗體，再用放射性核素標(biāo)記 該抗體。若某一菌落或噬菌

52、斑表達(dá)該種蛋白質(zhì)，如原位雜交方法一樣，先將其轉(zhuǎn)移至膜上， 再與放射性核素標(biāo)記的抗體雜交。產(chǎn)生該蛋白質(zhì)的菌落或噬菌斑，因抗體抗原的特異結(jié)合反 應(yīng)，又因抗體帶上核素，所以經(jīng)放射自顯影術(shù)后會(huì)出現(xiàn)黑斑點(diǎn)。五、一些常用的分子生物學(xué)技術(shù)( ) 核酸分子雜交核酸分子雜交 ( molecular hybridization of nucleic acid )指序列互補(bǔ)單鏈的 RNA 與 DNA 、 DNA 與 DNA 或 RNA 與 RNA ，根據(jù)堿基配對(duì)原則以氫鍵相連而形成雜交分子的過(guò)程。需要 有一合適的探針(probe), 一般指一段己知序列的DNA或RNA或化學(xué)合成的寡核苷酸。標(biāo)記的探針與待測(cè)樣品的 D

53、NA 或 RNA 雜交，從而判斷二者的同源性。 若用標(biāo)記的探針，在組織 或細(xì)胞水平與細(xì)胞內(nèi)的 RNA 或 DNA 進(jìn)行雜交， 則稱為組織或細(xì)胞原位雜交。 在染色體水平 進(jìn)行原位雜交則可測(cè)定某基因在染色體的定位。1. DNA 印跡DNA印跡(Southern blot)是由英國(guó)科學(xué)家 E, Southern于1975年提出的一種檢測(cè)基因組 DNA 中特異序列的方法， 故以作者的姓氏命名， 此方法廣泛地應(yīng)用于分子生物學(xué)的研究， 可 以分析基因的結(jié)構(gòu)、同源性和基因的拷貝數(shù)等。本方法基本步驟：將高分子量 DNA 用合適的限制性內(nèi)切酶酶解成一定的片段,進(jìn)行瓊 脂糖凝膠電泳分離；電泳后用堿處理,使凝膠中的

54、 DNA 變性成單股 DNA ,轉(zhuǎn)移至硝酸纖維 濾膜或尼龍膜上,并固定之；選擇一合適的探針,用放射性核素或非核素標(biāo)記方法,如生物 素、地高辛 (digoxigenin) 等標(biāo)記之,進(jìn)行分子雜交；濾膜經(jīng)放射自顯影 (autoradiography) 處理 后,即可得雜交 DNA 條帶的放射自顯影圖,如圖 12-26 所示。若用其他非核素標(biāo)記的探針, 可用相關(guān)方法使之產(chǎn)生色帶或發(fā)光帶。2 RNA 印跡RNA印跡(Northern blot)方法主要是用來(lái)檢測(cè)特異mRNA的表達(dá)情況及 mRNA分子的大小，特別是用于研究細(xì)胞生長(zhǎng)、分化、發(fā)育過(guò)程中有關(guān)基因的表達(dá)或組織細(xì)胞在病理?xiàng)l件下(如惡性腫瘤)某些基

55、因的表達(dá)異常。由于DNA印跡方法以作者 Southern(南)命名，故此方法則便稱為 Northern ( 北) blot?；静襟E是：先提取完整 RNA ；再進(jìn)行 RNA 變性瓊脂糖凝膠電泳，變性條件下可破壞RNA 的局部雙螺旋，使其成線狀單鏈，有利于雜交及分子大小的判斷；其它步驟的原理與Southern 印跡相似。3斑點(diǎn)雜交( dot hybridization )(1) DNA 和 RNA 斑點(diǎn)雜交直接將變性 DNA 或 RNA 點(diǎn)樣于硝酸纖維薄膜上，晾干后與放射性核素標(biāo)記的探針 進(jìn)行雜交及放射自顯影， 以觀察所要研究的基因或 mRNA 是否存在， 并可以比較相對(duì)量的高 低。(2) 菌落和噬菌斑原位斑點(diǎn)雜交 上述構(gòu)建基因組克隆文庫(kù)和 cDNA 克隆文庫(kù)，若要從文庫(kù)中篩選出某特異克隆，常用菌 落或噬菌體斑原位斑點(diǎn)雜交( in situ dot hybridization )將一大小相當(dāng)?shù)南跛崂w維濾膜放置于 生長(zhǎng)眾多的細(xì)菌集落或噬菌體斑的主平板上(master plate),使每一集落的細(xì)菌或噬菌體斑轉(zhuǎn)移至濾膜的相應(yīng)位置，然后使細(xì)菌裂解，釋放出的 DNA 固定于濾膜，則可與放射性核素標(biāo) 記的探針雜交及放射自顯影,根據(jù)雜交斑點(diǎn)的