第15章 核酸的研究方法

1、第十五章 核酸的研究方法第一節(jié) 核酸的分離、提純和定量測定一、DNA 的分離用1mol/L 的NaCl 制備組織勻漿，離心除去組織殘渣，多次用苯酚處理使蛋白質(zhì)變性，每次處理后離心取上層水相，最后加2 倍體積的乙醇沉淀出DNA。二、RNA 的分離由于RNA 酶存在廣泛，且十分穩(wěn)定，破碎細(xì)胞時要加入胍鹽破壞RNA 酶，試劑要用0.1%的DEPC（焦碳酸二乙酯）配制，器皿要高壓滅菌或用0.1%的DEPC 處理，多次用苯酚或氯仿處理使蛋白質(zhì)變性，每次處理后離心取上層水相，mRNA 可用寡聚dT-纖維素親和層析從總RNA 中分離。三、核酸含量的測定法常用的方法是測定260nm 的消光度，用公式計算核酸的

2、含量。核酸的含量也可以用定磷法測定。DNA 的含量可以用二苯胺顯色法測定。RNA 的含量可以用地衣酚顯色法測定。第二節(jié) 核酸的超速離心及核酸的凝膠電泳一、核酸的超速離心超速離心可以分離超螺旋DNA（密度大），線性DNA（密度小）和閉環(huán)DNA（密度居中）。也可以分離RNA。二、核酸的凝膠電泳從細(xì)菌抽提得到的質(zhì)粒DNA 樣品中不含線狀DNA第三節(jié) 核酸的核苷酸序列測定一、DNA 的酶法（末端終止法）測序二、DNA 的化學(xué)法測序DNA 酶法測序自動化：使用4 種熒光素標(biāo)記的雙脫氧核苷酸，毛細(xì)管電泳和激光掃描技術(shù)使測序自動化，一個泳道一次可測大約1000 個核苷酸，測序已成為可以快速完成的常規(guī)技術(shù)。人

3、類基因組測序已經(jīng)完成，多態(tài)性的研究和功能基因組學(xué)已經(jīng)成為研究的熱點。限制性酶切位點分析是繪制物理圖的常用方法。由于測序儀在一個泳道只能準(zhǔn)確測出幾百個核苷酸，對于長DNA，只能將其切成小段再測序，為了組裝，需要確定足夠多的標(biāo)記位點。常用遺傳圖、轉(zhuǎn)錄圖、物理圖、序列標(biāo)簽位點(STS)、表達(dá)序列標(biāo)簽(EST)等方法確定標(biāo)記位點。三、RNA 的測序RNA 的測序可以用4 種特異性的酶切割（從胰臟提取的RNase A 水解嘧啶核苷酸的磷酸二酯鍵，米曲霉中提取的RNase T1 水解鳥苷酸的磷酸二酯鍵，黑粉曲霉中提取的RNase U2 水解腺苷酸的磷酸二酯鍵，多頭黏菌中提取的RNase Phy I 水解A

4、、U、G 三種核苷酸的磷酸二酯鍵），凝膠電泳分離，用類似蛋白質(zhì)序列分析的方法推斷核苷酸序列。也可以用化學(xué)試劑斷裂RNA 鏈，用類似DNA 化學(xué)測序的方法推斷核苷酸序列。最常用的方法是逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，用DNA 測序的方法推斷核苷酸序列。第四節(jié) 聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）一、PCR 的定義PCR(polymerase chain reaction)是應(yīng)用最廣的分子生物學(xué)技術(shù)之一，模板DNA 的含量以指數(shù)方式增加，可用來快速在體外擴(kuò)增DNA，PCR 技術(shù)在臨床檢驗和分子生物學(xué)中的應(yīng)用十分廣泛。耐熱DNA 聚合酶的發(fā)現(xiàn)推動了這一技術(shù)的廣泛應(yīng)用。（二）復(fù)合PCR(multiplex PCR)⬳

5、24;在同一反應(yīng)中用多組引物同時擴(kuò)增幾種基因片段的方法稱復(fù)合PCR。復(fù)合PCR 主要用于同一病原體分型及同時檢測多種病原體。此外也常用于多點突變性分子病的診斷。􎀄（三）不對稱PCR(asymmetric PCR)􎀄兩種引物比例相差較大的PCR 稱不對稱PCR。不對稱PCR 可制備用于核酸序列分析的單鏈DNA 片段或核酸雜交的探針等。（四）反轉(zhuǎn)錄PCR(reverse transcription PCR)􎀄由于Taq 酶只能以DNA 為模板，當(dāng)待擴(kuò)增模板為RNA 時，需先將其反轉(zhuǎn)錄為cDNA 才能進(jìn)行PCR擴(kuò)增，這種PCR 技術(shù)稱為反轉(zhuǎn)錄PC

6、R，在分子生物學(xué)和臨床檢驗等領(lǐng)域均有廣泛應(yīng)用。􎀄（五）涂片PCR(slide-PCR)􎀄直接對載玻片上細(xì)胞涂片或組織切片進(jìn)行PCR 擴(kuò)增的方法稱涂片PCR。涂片PCR 結(jié)合原位雜交技術(shù)特別適用于病理切片中含量較少的靶序列的PCR 檢測。（六）反向PCR(inverse PCR)􎀄擴(kuò)增引物相反方向DNA 序列的PCR 技術(shù)稱反向PCR。在反向PCR 中，要先將含有一段已知序列的感興趣的未知DNA 片段進(jìn)行酶切和環(huán)化，然后直接進(jìn)行PCR，也可將已知序列酶切后再進(jìn)行PCR。反向PCR 主要用于已知序列兩翼未知DNA 序列的擴(kuò)增。（七）錨定PCR(

7、anchored PCR)􎀄用酶法在一通用引物反轉(zhuǎn)錄的cDNA 3端加上一段已知序列，然后以此序列為引物結(jié)合位點對該cDNA 進(jìn)行PCR 擴(kuò)增稱為錨定PCR，可用于未知cDNA 的制備及低豐度cDNA 文庫的構(gòu)建。（八）修飾引物PCR 􎀄為達(dá)到某些特殊應(yīng)用目的如定向克隆、定點突變、體外轉(zhuǎn)錄及序列分析等，可在引物的5-末端加上酶切位點、突變序列、轉(zhuǎn)錄啟動子及序列分析物結(jié)合位點等，這種PCR 技術(shù)稱為修飾引物PCR。此外，還可將一些信號分子如熒光素、生物素等連接于引物的5末端，當(dāng)PCR 完成后可對產(chǎn)物直接進(jìn)行檢測。􎀄 PCR 在生命科學(xué)中的應(yīng)用非常廣泛，已有不少專著可供讀者參考。第五節(jié) DNA 的化學(xué)合成固相磷酰亞胺法合成時，末端核苷酸的3-OH 與固相載體成共價鍵，5-OH 被4，4-二甲氧基三苯甲基(DMTr)保護(hù)，下一個核苷酸的5-OH 亦被DMTr 保護(hù)，3-OH 上的磷酸基上有-N(C3H7)2 和-OCH3兩個基團(tuán)，3-OH 因此被活化。每延伸一個核苷酸需四步化學(xué)反應(yīng)：脫三苯甲基：末端核苷酸的DMTr 用三氯乙酸/二氯甲烷溶液脫去，游離出5-OH。縮合：新生成的5-OH 在四唑催化下與下一個核苷3-磷酰亞胺單體