人重組粒細(xì)胞集落刺激因子突變體的構(gòu)建、表達(dá)和其體內(nèi)外生物學(xué)活性研究

1、    人重組粒細(xì)胞集落刺激因子突變體的構(gòu)建、 表達(dá)和其體內(nèi)外生物學(xué)活性研究        【 摘要 】目的為提高人重組粒細(xì)胞集落刺激因子(human recombinant granulocyte colony-stimulating factor, rhG-CSF)的穩(wěn)定性和活性，對(duì)rhG-CSF進(jìn)行改造和體內(nèi)、外活性研究。 方法利用定向點(diǎn)突變技術(shù)，將人重組粒細(xì)胞集落刺激因子第17位游離的半胱氨酸編碼序列突變?yōu)楸彼嵝蛄?，DNA序列分析證明后，在大腸桿菌中表達(dá)突

2、變蛋白。利用G-CSF依賴(lài)細(xì)胞株NFS-60，對(duì)在不同溫度及在人血漿中保存的G-CSF蛋白(G-CSF-Ala17)和野生型的G-CSF進(jìn)行活性測(cè)定。腹腔注射后小鼠外周血白細(xì)胞計(jì)數(shù)檢測(cè)其體內(nèi)生物學(xué)活性。 結(jié)果DNA序列分析表明17位半胱氨酸突變?yōu)楸彼?，并在大腸桿菌中表達(dá)成功G-CSF-Ala17。純化的突變蛋白對(duì)NFS-60細(xì)胞具有刺激活性；與野生型G-CSF相比，在各種溫度儲(chǔ)存的突變蛋白保留更高的活性，與人血漿孵育50小時(shí)后突變蛋白仍保持活性；小鼠一次性體內(nèi)注射突變蛋白后外周血白細(xì)胞數(shù)明顯高于野生型G-CSF。 結(jié)論G-CSF突變體(G-CSF-Ala17)較野生型的G-CSF具有更高的體

3、外穩(wěn)定性和體內(nèi)造血刺激活性?！?主題詞 】定點(diǎn)突變?nèi)酥亟M粒細(xì)胞集落刺激因子Studies on a mutant human granulocyte colony-stimulating factor and its bioactivity both in vitro and in vivoLI Fang, MO Xiaoning, ZHANG Yingmei, et al. Laboratory of Medical Immunology, Beijing Medical University, Beijing 100083【 Abstract 】ObjectiveTo reconstruc

4、t rhG-CSF for improvement of its stability and bioactivity. MethodsBy using the technique of site-specific mutagenesis with a synthetic oligonucleotide primer, we replaced the codon for cysteine-17 of human G-CSF with alanine, confirmed by DNA sequencing and expressed the mutant protein (G-CSF-Ala-1

5、7) in Escherichia coli. The biological activity of the furified protein was determined with colorimetric microassay using G-CSF-dependent NFS-60 cells under different temperatures and in human plasma at 37. After intraperitoneal administration of the G-CSF-Ala-17 or wild G-CSF, the peripheral leukoc

6、ytes in normal mice were determined. ResultsThe mutant G-CSF was successfully constructed and expressed in E. coli. Purified G-CSF-Ala-17 protein had stimulating activity similar to the wild type of G-CSF as assayed by G-CSF-dependent NSF-60 cells. However, the stability of the G-CSF-Ala-17 was supe

7、rior than that of G-CSF at different temperatures, and retained full biological activity after 50 hours culture in human plasma, as control. The G-CSF-Ala-17 has a higher stimulatory activity to the granulocytes than that G-CSF after intraperitoneal administration into normal mice. ConclusionsG-CSF-

8、Ala-17 has an advantage over wild type of rhG-CSF in storage stability and hemotopoietic activity in vivo.【 Subject words 】Site-directedMutagenesisMutant G-CSFStability人G-CSF是調(diào)節(jié)中性粒細(xì)胞增殖和分化的重要細(xì)胞因子1，其 cDNA已成功克隆，并在大腸桿菌等工程細(xì)胞中獲得表達(dá)2，3。人重組G-CSF的臨床研究證明，它能顯著提高人粒細(xì)胞的數(shù)量，尤其是在各種原因引起白細(xì)胞下降的病人4，并且作用迅速，副作用小。但G-CSF也存在體

9、內(nèi)半衰期短和體外貯藏穩(wěn)定性較差的缺點(diǎn)，影響了它的廣泛應(yīng)用。許多研究表明，細(xì)胞因子不穩(wěn)定因素可能與其結(jié)構(gòu)相關(guān)。人G-CSF 在17位有一個(gè)游離的半胱氨酸和兩個(gè)二硫鍵(Cys36-Cys42和Cys64-Cys74)5。已知白細(xì)胞介素-26，T4溶菌酶7和干擾素8都有一個(gè)游離的半胱氨酸，易形成分子間的二硫鍵，產(chǎn)生無(wú)活性的寡聚體。用蘇氨酸或丙氨酸取代T4溶菌酶上游離的Cys54，新產(chǎn)生的突變蛋白對(duì)不可逆的熱滅活具有明顯增加的穩(wěn)定性，而用絲氨酸或丙氨酸取代IL-2 Cys125產(chǎn)生的突變克隆具有較高的穩(wěn)定性。我們利用新的技術(shù)路線進(jìn)行了人重組G-CSF-Ala17的構(gòu)建和表達(dá)，以對(duì)G-CSF-Ala17

10、進(jìn)行更深入的研究。首先發(fā)現(xiàn)，G-CSF-Ala17較野生型G-CSF除具有更高的穩(wěn)定性外，還具有更高的體內(nèi)生物學(xué)活性。 材料與方法1.質(zhì)粒、菌株、細(xì)胞及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：表達(dá)載體質(zhì)粒pKpL-3a為本室構(gòu)建10 ，含有啟動(dòng)子和SD序列；pALTER-1 突變載體和pEGM-3 測(cè)序載體購(gòu)于Promega 公司。大腸桿菌pop2136由Raiband博士惠贈(zèng)，含有編碼溫度敏感的阻遏蛋白的CI857基因，30抑制pL啟動(dòng)子表達(dá)外源基因，42誘導(dǎo)阻遏蛋白失活，啟動(dòng)pL下游的外源基因表達(dá)。NFS-60 白血病細(xì)胞株，為G-CSF依賴(lài)株，由中國(guó)藥品生物制品檢定所丁錫申教授惠贈(zèng)。 BALB/c小鼠，由北京醫(yī)科大學(xué)

11、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物部提供。2.DNA重組技術(shù):質(zhì)粒提取、酶切、回收、連接、轉(zhuǎn)化、鑒定、PCR擴(kuò)增等參考文獻(xiàn)10操作。3.合成寡核苷酸:設(shè)計(jì)合成26個(gè)核苷酸的突變引物：5-TTC CTG CTG AAG GCC TTA GAG CAA GT-3，上述引物與人G-CSF cDNA負(fù)鏈的第3762個(gè)核苷酸互補(bǔ)，將其中第13，14個(gè)堿基由TG變?yōu)镚C，相應(yīng)的三連碼所編碼的氨基酸由半胱氨酸變?yōu)楸彼?，同時(shí)產(chǎn)生一個(gè)Stu位點(diǎn)AGGCCT，這一新的酶切位點(diǎn)可用于篩選突變克隆。4.DNA序列分析:利用Pharmacia公司的ALF自動(dòng)測(cè)序儀，按照說(shuō)明書(shū)測(cè)序。5.G-CSF基因的定點(diǎn)突變: rhG-CSF表達(dá)載體pKpL

12、-G-CSF含有完整的G-CSF cDNA，用Sal、Hind消化，產(chǎn)生的Sal-Hind小片段連接到用相同酶消化的突變載體 pALTER-1,構(gòu)建成pALTER-G-CSF質(zhì)粒，按Promega公司說(shuō)明書(shū)用合成的突變寡核苷酸進(jìn)行定點(diǎn)突變，經(jīng)DNA測(cè)序確認(rèn)后將突變的G-CSF基因片段插入pKpL-3a表達(dá)載體，命名為pKpL-G-CSF-Ala-17。6.突變G-CSF基因表達(dá)及蛋白的純化:按照本室方法進(jìn)行G-CSF-Ala-17在大腸桿菌pop2136中的熱誘導(dǎo)表達(dá)，經(jīng)變性復(fù)性，離子交換柱層析純化后，利用SDS -PAGE和FPLC分析純度。7.生物學(xué)活性測(cè)定: 選用G-CSF依賴(lài)細(xì)胞株NF

13、S-60，以MTT染料摻入法測(cè)定G-CSF-Ala-17的生物學(xué)活性9。8.G-CSF-Ala-17在正常人血漿中的穩(wěn)定性測(cè)定: pH7.4的PBS稀釋為20g/ml的G-CSF-Ala-17，再用新鮮健康人血漿稀釋為1g/ml，置37水浴孵育48小時(shí)，在0，12，24，36，48小時(shí)取樣，分別測(cè)定其活性，同時(shí)用G-CSF對(duì)照。9.G-CSF-Ala-17在不同溫度下的儲(chǔ)藏穩(wěn)定性檢測(cè): 將G-CSF-Ala-17或G-CSF蛋白分裝后分別置-20、4、37放置，經(jīng)一定時(shí)間取樣，測(cè)定其活性。10.G-CSF-Ala-17的小鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn):取每組10只小鼠，一次腹腔注射2g G-CSF-Ala-17

14、蛋白或G-CSF，分別在0，2，4，8，12，16，24，30小時(shí)采血檢測(cè)外周血中白細(xì)胞數(shù)量。結(jié)果1.G-CSF-Ala-17表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建和鑒定：G-CSF-Ala-17表達(dá)載體pKpL-G-CSF-Ala-17經(jīng)限制性?xún)?nèi)切酶Hind、Stu、Bgl、Sty、Sal消化，瓊脂糖電泳顯示出與理論計(jì)算大小相符的酶切片段（略）。2.G-CSF-Ala-17表達(dá)質(zhì)粒的DNA序列分析:DNA測(cè)序結(jié)果顯示第49，50個(gè)核苷酸處出現(xiàn)突變序列，與原設(shè)計(jì)的結(jié)果一致，除此之外，全序列與公布的G-CSF序列相一致（略）。3.G-CSF-Ala-17蛋白的表達(dá)與純化:SDS-PAGE結(jié)果表明，pKpL-G-CSF-

15、Ala-17質(zhì)粒在工程菌pop2136中可表達(dá)相對(duì)分子質(zhì)量約18×103的蛋白，此蛋白以包涵體的形式存在，經(jīng)變性、復(fù)性、離子交換柱層析后，可得到純化的G-CSF-Ala-17蛋白（1），純度經(jīng)FPLC分析，可達(dá)98.2%, SDS-PAGE Imager Marster 薄層掃描純度為98.9%。1G-CSF-Ala-17的SDS-PAGE結(jié)果Fig 1. G-CSF-Ala-17 SDS-PAGE1.Purified G-CSF-Ala-17; 2.G-CSF-Ala-17 inclusive body;3.Lysate supernatant; 4.Pre-induced exp

16、ression strain4.G-CSF-Ala-17對(duì)NFS-60細(xì)胞的體外刺激作用：純化的G-CSF-Ala-17蛋白對(duì)NFS-60細(xì)胞體外活性測(cè)定表明，其活性為107108U/mg，與野生型G-CSF(107108U/mg)活性相比，活性無(wú)差異（略）。5.G-CSF-Ala-17在不同溫度下儲(chǔ)藏穩(wěn)定性的測(cè)定結(jié)果:2顯示G-CSF-Ala-17儲(chǔ)藏50，70，120，150，210，260天測(cè)定結(jié)果。2 G-CSF-Ala-17體外穩(wěn)定性測(cè)定Fig 2. The stability of G-CSF-Ala-17 in vitro6. G-CSF-Ala-17在正常人血漿中穩(wěn)定性的體外實(shí)

17、驗(yàn): 將G-CSF-Ala-17蛋白或G-CSF蛋白在正常人血漿中37 共同孵育48小時(shí)，分別在12，24，36，48小時(shí)取樣，結(jié)果發(fā)現(xiàn)G-CSF-Ala-17的活性基本無(wú)變化，而G-CSF活性則顯著下降（3）。3突變G-CSF 在正常人血漿中穩(wěn)定性的體外實(shí)驗(yàn)Fig 3. The stability of G-CSF-Ala-17 in plasma in vitro7. 對(duì)小鼠白細(xì)胞增殖的體內(nèi)實(shí)驗(yàn):小鼠一次性注射G-CSF-Ala-17或G-CSF蛋白2g后, 不同時(shí)間檢測(cè)外周血白細(xì)胞數(shù)（略），發(fā)現(xiàn)G-CSF-Ala-17在注射后8小時(shí)達(dá)最高值，可提高至270%，維持24小時(shí)，然后逐漸下降。

18、與G-CSF提高180%相比，G-CSF-Ala-17具有更高的體內(nèi)刺激活性。討論人G-CSF含有5個(gè)半胱氨酸，其中4個(gè)半胱氨酸可形成2個(gè)分子間的二硫鍵，另有第17位半胱氨酸處于游離狀態(tài)，易于氧化形成無(wú)活性的二聚體或寡聚體，影響G-CSF的活性和穩(wěn)定性。為研究去除G-CSF的游離半胱氨酸后能夠在多大程度上改善其生物學(xué)活性，我們利用定點(diǎn)突變技術(shù)用丙氨酸取代17位半胱氨酸，獲得了G-CSF-Ala17突變體蛋白，并對(duì)其進(jìn)行了系統(tǒng)性的活性分析。結(jié)果顯示，在正常條件下，G-CSF-Ala17的體外比活性與野生型G-CSF相比，雖然活性相同，但前者的體外穩(wěn)定性明顯改善，并且體內(nèi)生物學(xué)活性明顯增加。說(shuō)明G

19、-CSF-Ala17在減少游離半胱氨酸后，不僅提高了結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，而且具備了較強(qiáng)的抵抗外界影響的能力，特別是在血漿中的抗降解能力，提示其在體內(nèi)可能有延長(zhǎng)半衰期的作用。雖然結(jié)果顯示在小鼠體內(nèi)活性沒(méi)有明顯延長(zhǎng)，這可能與人鼠的種屬差異和體內(nèi)外實(shí)際條件相差懸殊有關(guān)，例如體內(nèi)對(duì)蛋白的清除作用強(qiáng)于體外，但本文結(jié)果確實(shí)證明G-CSF-Ala17體內(nèi)活性有明顯增高。這可能與其穩(wěn)定性提高是相關(guān)的。上述結(jié)果提示，G-CSF-Ala17有可能作為新一代的基因工程藥物，更利于生產(chǎn)、貯藏和運(yùn)輸，并且由于其體內(nèi)半衰期的延長(zhǎng)，可減少使用劑量和延長(zhǎng)用藥間隔，并降低副作用，因而可能具有良好的開(kāi)發(fā)應(yīng)用前景。本課題為國(guó)家863計(jì)劃

20、生物技術(shù)領(lǐng)域基金資助作者單位：100083北京醫(yī)科大學(xué)衛(wèi)生部醫(yī)學(xué)免疫學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室參考文獻(xiàn)1Clark SC, Kamen R. The human hematopioetic colony-stimulating factors. Science, 1987,2361229-1237.2Nagata S,Tsuchiya M,Asana S,et al. Molecular cloning and expression of cDNA for human granulocyte colony-stimulating. Nature, 1986,319415-418.3Souza LM，Boon

21、e TC,Gabrilove J,et al. Recombinant human granulocyte colony-stimulating factor:effects on normal and leukemic myeloid cells. Science ,1986,23261-64.4Paolo A，Donna P,Richard C,et al. Biologic and clinical effects of granulocyte colony-stimulating factor in normal individuals. Blood,1996,882819-2825.5Lu H，Boone TC,Souza LM,et al. Disulfide and secondary structures of recombinant human granulocyte colony-st