高級(jí)動(dòng)物生物化學(xué)蛋白質(zhì)的分離純化講課講稿

1、高級(jí)動(dòng)物生物化學(xué)蛋白質(zhì)的分離純化三、分離純化的一般程序三、分離純化的一般程序 蛋白質(zhì)分子的分離純化一般可分為以下幾個(gè)階段：蛋白質(zhì)分子的分離純化一般可分為以下幾個(gè)階段： 材料的選擇和預(yù)處理材料的選擇和預(yù)處理 破碎細(xì)胞及提?。ㄓ袝r(shí)還需要進(jìn)行細(xì)胞器的分破碎細(xì)胞及提取（有時(shí)還需要進(jìn)行細(xì)胞器的分離）離） 分離純化：包括粗分級(jí)分離和細(xì)分級(jí)分離分離純化：包括粗分級(jí)分離和細(xì)分級(jí)分離 其中前兩個(gè)階段為分離純化的前處理。其中前兩個(gè)階段為分離純化的前處理。第二節(jié)第二節(jié) 蛋白質(zhì)分離純化的前處理蛋白質(zhì)分離純化的前處理一、材料的選擇與預(yù)處理一、材料的選擇與預(yù)處理n選擇材料主要根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康亩?。工業(yè)生產(chǎn)上注意選選擇材料主要

2、根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康亩?。工業(yè)生產(chǎn)上注意選擇含量高、來(lái)源豐富、易獲得、制備工藝簡(jiǎn)單、成本擇含量高、來(lái)源豐富、易獲得、制備工藝簡(jiǎn)單、成本低的動(dòng)植物組織或微生物做原料?？蒲羞x材則無(wú)需考低的動(dòng)植物組織或微生物做原料?？蒲羞x材則無(wú)需考慮上述問題，只要能達(dá)到實(shí)驗(yàn)?zāi)康募纯伞]上述問題，只要能達(dá)到實(shí)驗(yàn)?zāi)康募纯?。n實(shí)驗(yàn)材料選定后，常常需要進(jìn)行預(yù)處理，如動(dòng)物材料實(shí)驗(yàn)材料選定后，常常需要進(jìn)行預(yù)處理，如動(dòng)物材料需要除去一些與實(shí)驗(yàn)無(wú)關(guān)的結(jié)締組織、脂肪組織；植需要除去一些與實(shí)驗(yàn)無(wú)關(guān)的結(jié)締組織、脂肪組織；植物種子需要除殼；微生物需要將菌體與發(fā)酵液分開。物種子需要除殼；微生物需要將菌體與發(fā)酵液分開。另外，必須盡可能保持材料的新鮮，

3、盡快加工處理。另外，必須盡可能保持材料的新鮮，盡快加工處理。若不立即進(jìn)行實(shí)驗(yàn)或加工，應(yīng)冷凍保存。若不立即進(jìn)行實(shí)驗(yàn)或加工，應(yīng)冷凍保存。二、細(xì)胞的破碎二、細(xì)胞的破碎n分離提取某一生物大分子，首先要求生物大分分離提取某一生物大分子，首先要求生物大分子從原來(lái)的組織或細(xì)胞中以溶解的狀態(tài)釋放出子從原來(lái)的組織或細(xì)胞中以溶解的狀態(tài)釋放出來(lái)，并保持原來(lái)的天然狀態(tài)，不丟生物活性。來(lái)，并保持原來(lái)的天然狀態(tài)，不丟生物活性。因此應(yīng)選擇適當(dāng)?shù)姆椒▽⒔M織和細(xì)胞破碎。但因此應(yīng)選擇適當(dāng)?shù)姆椒▽⒔M織和細(xì)胞破碎。但若材料是體液（如血）或生物體分泌到體外的若材料是體液（如血）或生物體分泌到體外的分泌物，則不必進(jìn)行組織細(xì)胞的破碎。分泌

4、物，則不必進(jìn)行組織細(xì)胞的破碎。n組織細(xì)胞的破碎方法很多，不同的實(shí)驗(yàn)規(guī)模，組織細(xì)胞的破碎方法很多，不同的實(shí)驗(yàn)規(guī)模，不同的實(shí)驗(yàn)材料和實(shí)驗(yàn)要求，使用的破碎方法不同的實(shí)驗(yàn)材料和實(shí)驗(yàn)要求，使用的破碎方法和條件也不同和條件也不同。v一般動(dòng)物組織和細(xì)胞可用電動(dòng)搗碎機(jī)或勻漿器破碎一般動(dòng)物組織和細(xì)胞可用電動(dòng)搗碎機(jī)或勻漿器破碎或用超聲波處理破碎?；蛴贸暡ㄌ幚砥扑?。v植物組織和細(xì)胞由于具有纖維素、半纖維素和果膠植物組織和細(xì)胞由于具有纖維素、半纖維素和果膠等物質(zhì)組成的細(xì)胞壁，一般常用與石英砂和適當(dāng)?shù)牡任镔|(zhì)組成的細(xì)胞壁，一般常用與石英砂和適當(dāng)?shù)奶崛∫阂黄鹧心サ姆椒ㄆ扑榛蛴美w維素酶處理也能提取液一起研磨的方法破碎或用纖

5、維素酶處理也能達(dá)到目的。達(dá)到目的。v細(xì)菌細(xì)胞的破碎比較困難，因?yàn)檎麄€(gè)細(xì)菌細(xì)胞壁的細(xì)菌細(xì)胞的破碎比較困難，因?yàn)檎麄€(gè)細(xì)菌細(xì)胞壁的骨架實(shí)際上是一借共價(jià)鍵連接而成的肽聚糖囊狀大骨架實(shí)際上是一借共價(jià)鍵連接而成的肽聚糖囊狀大分子，非常堅(jiān)韌。破碎的方法常有超聲波震蕩、與分子，非常堅(jiān)韌。破碎的方法常有超聲波震蕩、與石英砂研磨、高壓擠壓或溶菌酶處理（以分解肽聚石英砂研磨、高壓擠壓或溶菌酶處理（以分解肽聚糖）。糖）。三、細(xì)胞器的分離三、細(xì)胞器的分離n細(xì)胞器包括細(xì)胞核、線粒體、核糖體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，植物細(xì)胞器包括細(xì)胞核、線粒體、核糖體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，植物細(xì)胞還有葉綠體。細(xì)胞還有葉綠體。n如果要分離制備分布在這些細(xì)胞器中的生物大

6、分子，如果要分離制備分布在這些細(xì)胞器中的生物大分子，為了防止其他細(xì)胞組分中的物質(zhì)對(duì)制備物的干擾或污為了防止其他細(xì)胞組分中的物質(zhì)對(duì)制備物的干擾或污染，還需先將細(xì)胞器分離出來(lái)，然后在某一細(xì)胞器中染，還需先將細(xì)胞器分離出來(lái)，然后在某一細(xì)胞器中分離某一物質(zhì)。分離某一物質(zhì)。n細(xì)胞器的分離一般采用細(xì)胞器的分離一般采用差速離心法差速離心法，即將破碎后的細(xì)，即將破碎后的細(xì)胞在適當(dāng)?shù)慕橘|(zhì)中進(jìn)行離心，常用的介質(zhì)有蔗糖、甘胞在適當(dāng)?shù)慕橘|(zhì)中進(jìn)行離心，常用的介質(zhì)有蔗糖、甘露醇、檸檬酸、聚乙二醇等。各種細(xì)胞組分按質(zhì)量大露醇、檸檬酸、聚乙二醇等。各種細(xì)胞組分按質(zhì)量大小的不同，經(jīng)過不同速度的離心后，沉降于離心管的小的不同，經(jīng)

7、過不同速度的離心后，沉降于離心管的不同部位，經(jīng)多次分步離心后，即可獲得所需組分。不同部位，經(jīng)多次分步離心后，即可獲得所需組分。四、提取四、提取n組織細(xì)胞破碎過程中，大量的胞內(nèi)酶及細(xì)組織細(xì)胞破碎過程中，大量的胞內(nèi)酶及細(xì)胞內(nèi)含物被釋放出來(lái)，必須立即將其置于胞內(nèi)含物被釋放出來(lái)，必須立即將其置于一定條件下和溶劑中，讓制備物充分溶解，一定條件下和溶劑中，讓制備物充分溶解，并盡可能保持原來(lái)的天然狀態(tài)，避免因長(zhǎng)并盡可能保持原來(lái)的天然狀態(tài)，避免因長(zhǎng)久放置造成制備物的分解破壞，這就是久放置造成制備物的分解破壞，這就是提提取取。1 1、蛋白質(zhì)的提取、蛋白質(zhì)的提取n大多數(shù)蛋白質(zhì)均能溶于水、稀鹽、稀堿或稀酸大多數(shù)蛋白

8、質(zhì)均能溶于水、稀鹽、稀堿或稀酸溶液中，故蛋白質(zhì)的提取一般以水溶液提取為溶液中，故蛋白質(zhì)的提取一般以水溶液提取為主。通常采用類似生理?xiàng)l件下的緩沖液，如主。通常采用類似生理?xiàng)l件下的緩沖液，如20-50m mol/L20-50m mol/L的磷酸鹽緩沖液（的磷酸鹽緩沖液（pH7.0-7.5pH7.0-7.5）或或0.1mol/L Tris-HCl0.1mol/L Tris-HCl（pH7.5-8.0pH7.5-8.0）緩沖液作）緩沖液作提取液。提取液。n對(duì)于一些和脂質(zhì)結(jié)合比較牢固或分子中非極性對(duì)于一些和脂質(zhì)結(jié)合比較牢固或分子中非極性較多的蛋白質(zhì)，不溶于水、稀鹽、稀堿、稀酸，較多的蛋白質(zhì)，不溶于水、稀

9、鹽、稀堿、稀酸，常在提取液中加入適量的有機(jī)溶劑，如乙醇、常在提取液中加入適量的有機(jī)溶劑，如乙醇、丙酮、異丙醇、正丁醇等。丙酮、異丙醇、正丁醇等。第三節(jié)第三節(jié) 分離純化分離純化n從細(xì)胞中提取得到的蛋白質(zhì)往往是不純的，從細(xì)胞中提取得到的蛋白質(zhì)往往是不純的，含有大量雜質(zhì)，必須進(jìn)一步分離純化，這含有大量雜質(zhì)，必須進(jìn)一步分離純化，這一階段可分為一階段可分為粗分級(jí)分離和細(xì)分級(jí)分離粗分級(jí)分離和細(xì)分級(jí)分離兩兩步進(jìn)行。步進(jìn)行。一、蛋白質(zhì)的分離純化一、蛋白質(zhì)的分離純化n蛋白質(zhì)分離純化的方法很多，主要是根據(jù)蛋白分子之間特蛋白質(zhì)分離純化的方法很多，主要是根據(jù)蛋白分子之間特異性的差異，如分子大小，溶解度，電荷等建立起來(lái)

10、的。異性的差異，如分子大小，溶解度，電荷等建立起來(lái)的。 性質(zhì)性質(zhì) 方法方法v分子大小分子大小 透析、超濾、密度梯度離心、凝膠過濾透析、超濾、密度梯度離心、凝膠過濾v 溶解度溶解度 等電點(diǎn)沉淀、鹽析、有機(jī)溶劑沉淀等電點(diǎn)沉淀、鹽析、有機(jī)溶劑沉淀v電荷電荷 電泳、離子交換層析電泳、離子交換層析v吸附性質(zhì)吸附性質(zhì) 吸附層析（羥基磷灰石層析、疏水作用層析）吸附層析（羥基磷灰石層析、疏水作用層析）v對(duì)配體分子對(duì)配體分子 親和層析親和層析 的生物親和力的生物親和力 主要是利用鹽析法、等電點(diǎn)沉淀、有機(jī)溶主要是利用鹽析法、等電點(diǎn)沉淀、有機(jī)溶劑沉淀等方法，使目的蛋白與其它較大量劑沉淀等方法，使目的蛋白與其它較大量

11、的雜蛋白分開，這些方法的特點(diǎn)是簡(jiǎn)便、的雜蛋白分開，這些方法的特點(diǎn)是簡(jiǎn)便、處理量大、既能除去大量雜質(zhì)，又能濃縮處理量大、既能除去大量雜質(zhì)，又能濃縮蛋白質(zhì)，但分辨率低。蛋白質(zhì)，但分辨率低。1 1、粗分級(jí)分離、粗分級(jí)分離（1 1）鹽析）鹽析l 向蛋白質(zhì)溶液中加入大量的中性鹽向蛋白質(zhì)溶液中加入大量的中性鹽 （NHNH4 4) )2 2SOSO4 4，NaNa2 2SOSO4 4 ，使蛋白質(zhì)脫去水化層而聚集沉淀，這種現(xiàn)象稱為鹽析。使蛋白質(zhì)脫去水化層而聚集沉淀，這種現(xiàn)象稱為鹽析。l 鹽析作用是由于當(dāng)鹽濃度較高時(shí)，鹽離子與水分子作用，鹽析作用是由于當(dāng)鹽濃度較高時(shí)，鹽離子與水分子作用，使水的活度降低，原來(lái)溶液

12、中大部分的自由水轉(zhuǎn)變?yōu)辂}離使水的活度降低，原來(lái)溶液中大部分的自由水轉(zhuǎn)變?yōu)辂}離子的水化水，從而降低蛋白質(zhì)極性基團(tuán)與水分子之間的作子的水化水，從而降低蛋白質(zhì)極性基團(tuán)與水分子之間的作用，破壞蛋白質(zhì)分子表面的水化層，使蛋白聚集沉淀。同用，破壞蛋白質(zhì)分子表面的水化層，使蛋白聚集沉淀。同時(shí)鹽離子可以中和蛋白質(zhì)的表面電荷，也促進(jìn)蛋白的沉淀時(shí)鹽離子可以中和蛋白質(zhì)的表面電荷，也促進(jìn)蛋白的沉淀。l 不同的蛋白質(zhì)分子，由于其分子表面的極不同的蛋白質(zhì)分子，由于其分子表面的極性基團(tuán)的種類、數(shù)目以及排布的不同，其水性基團(tuán)的種類、數(shù)目以及排布的不同，其水化層厚度不同，故鹽析所需要的鹽濃度也不化層厚度不同，故鹽析所需要的鹽濃

13、度也不一樣，因此調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的中鹽濃度，可以使一樣，因此調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的中鹽濃度，可以使不同的蛋白質(zhì)分別沉淀。如：不同的蛋白質(zhì)分別沉淀。如：血清血清球蛋白球蛋白清蛋白清蛋白( (NHNH4 4) )2 2SOSO4 450%50%飽和度飽和度100%100%飽和飽和析出析出析出析出分段鹽析分段鹽析（2 2）等電點(diǎn)沉淀）等電點(diǎn)沉淀n蛋白質(zhì)是兩性電解質(zhì)，其溶解度與其凈電荷數(shù)蛋白質(zhì)是兩性電解質(zhì)，其溶解度與其凈電荷數(shù)量有關(guān)，隨溶液量有關(guān)，隨溶液pHpH變化而變化。在溶液變化而變化。在溶液pHpH值等值等于蛋白質(zhì)等電點(diǎn)時(shí)，蛋白質(zhì)的溶解度最小。于蛋白質(zhì)等電點(diǎn)時(shí)，蛋白質(zhì)的溶解度最小。n不同的蛋白質(zhì)有不同的等電點(diǎn)，

14、因此通過調(diào)節(jié)不同的蛋白質(zhì)有不同的等電點(diǎn)，因此通過調(diào)節(jié)溶液溶液pHpH到目的蛋白的等電點(diǎn)，可使之沉淀而與到目的蛋白的等電點(diǎn)，可使之沉淀而與其它蛋白質(zhì)分開，從而除去大量雜蛋白。其它蛋白質(zhì)分開，從而除去大量雜蛋白。（3 3）有機(jī)溶劑法）有機(jī)溶劑法n與水互溶的極性有機(jī)溶劑如甲醇、乙醇、丙酮與水互溶的極性有機(jī)溶劑如甲醇、乙醇、丙酮等能使蛋白質(zhì)在水中的溶解度顯著降低。等能使蛋白質(zhì)在水中的溶解度顯著降低。n有機(jī)溶劑引起蛋白質(zhì)變性的原因有兩個(gè)：有機(jī)溶劑引起蛋白質(zhì)變性的原因有兩個(gè)：v降低水的降低水的介電常數(shù)介電常數(shù)，使蛋白質(zhì)分子表面可解離，使蛋白質(zhì)分子表面可解離基團(tuán)的離子化程度減弱，水化程度降低，促進(jìn)基團(tuán)的離子

15、化程度減弱，水化程度降低，促進(jìn)了蛋白質(zhì)分子的聚集沉淀。了蛋白質(zhì)分子的聚集沉淀。v是極性有機(jī)溶劑與蛋白質(zhì)爭(zhēng)奪水化水，而使蛋是極性有機(jī)溶劑與蛋白質(zhì)爭(zhēng)奪水化水，而使蛋白質(zhì)分子沉淀。白質(zhì)分子沉淀。n室溫下，這些有機(jī)溶劑不僅能使蛋白質(zhì)沉淀，室溫下，這些有機(jī)溶劑不僅能使蛋白質(zhì)沉淀，而且伴隨著變性。若預(yù)先將有機(jī)溶劑冷卻，然而且伴隨著變性。若預(yù)先將有機(jī)溶劑冷卻，然后在不斷攪拌下將其逐漸加入蛋白質(zhì)溶液中，后在不斷攪拌下將其逐漸加入蛋白質(zhì)溶液中，防止有機(jī)溶劑局部濃度過高，則在很大程度上防止有機(jī)溶劑局部濃度過高，則在很大程度上解決變性問題。解決變性問題。 不同的蛋白質(zhì)由于水化層厚度不同，發(fā)生沉淀不同的蛋白質(zhì)由于水化

16、層厚度不同，發(fā)生沉淀需要的有機(jī)溶劑濃度不同，因此可利用不同濃需要的有機(jī)溶劑濃度不同，因此可利用不同濃度的有機(jī)溶劑分離不同的蛋白質(zhì)。度的有機(jī)溶劑分離不同的蛋白質(zhì)。2 2、細(xì)分級(jí)分離、細(xì)分級(jí)分離n一般蛋白質(zhì)樣品經(jīng)粗制分級(jí)后，體積較小，雜一般蛋白質(zhì)樣品經(jīng)粗制分級(jí)后，體積較小，雜質(zhì)大部分被除去。進(jìn)一步提純，通常使用高分質(zhì)大部分被除去。進(jìn)一步提純，通常使用高分辨率的辨率的柱層析及電泳柱層析及電泳方法。方法。n常用的柱層析方法有分子篩層析、離子交換層常用的柱層析方法有分子篩層析、離子交換層析、疏水吸附層析、親和層析。析、疏水吸附層析、親和層析。n常用的電泳方法有聚丙烯酰胺凝膠電泳、等電常用的電泳方法有聚丙

17、烯酰胺凝膠電泳、等電聚焦電泳。聚焦電泳。n另外，結(jié)晶也是蛋白質(zhì)分離純化的方法之一，另外，結(jié)晶也是蛋白質(zhì)分離純化的方法之一，制備的結(jié)晶物常常作為蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析之用。制備的結(jié)晶物常常作為蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析之用。 酶的活力測(cè)定酶的活力測(cè)定n在酶的制備過程中，每一步驟都應(yīng)測(cè)定留用以及在酶的制備過程中，每一步驟都應(yīng)測(cè)定留用以及準(zhǔn)備棄去部分中所含酶的總活力和比活力，以了準(zhǔn)備棄去部分中所含酶的總活力和比活力，以了解經(jīng)過某一步驟后酶的回收率、純化倍數(shù)，從而解經(jīng)過某一步驟后酶的回收率、純化倍數(shù)，從而決定這一步的取舍。決定這一步的取舍。n總活力總活力= =活力單位活力單位/ml/ml酶液酶液總體積（總體積（mlml）

18、n比活力比活力= =總活力單位數(shù)總活力單位數(shù)/ /總蛋白（氮）總蛋白（氮）mgmgn純化倍數(shù)純化倍數(shù)= =每次比活力每次比活力/ /第一次比活力第一次比活力n回收率（產(chǎn)率）回收率（產(chǎn)率）= =（每次總活力（每次總活力/ /第一次總活力）第一次總活力）100%100%第三節(jié)第三節(jié) 純度鑒定純度鑒定n生物大分子經(jīng)過分離提純，最后還要鑒定制品的純度。生物大分子經(jīng)過分離提純，最后還要鑒定制品的純度。n蛋白質(zhì)和酶制品純度鑒定通常采用的方法有：蛋白質(zhì)和酶制品純度鑒定通常采用的方法有：SDS-SDS-聚聚丙烯酰胺凝膠電泳法、等電聚焦電泳法、超速離心沉丙烯酰胺凝膠電泳法、等電聚焦電泳法、超速離心沉降分析法、免

19、疫化學(xué)法、降分析法、免疫化學(xué)法、N-N-末端氨基酸分析法等。末端氨基酸分析法等。v純的蛋白質(zhì)在一定條件下進(jìn)行電泳，將以單一的速度純的蛋白質(zhì)在一定條件下進(jìn)行電泳，將以單一的速度移動(dòng)，它的電泳圖譜只出現(xiàn)一條帶。同樣純的蛋白質(zhì)移動(dòng)，它的電泳圖譜只出現(xiàn)一條帶。同樣純的蛋白質(zhì)在離心場(chǎng)中，應(yīng)以單一的沉降速度移動(dòng)。在離心場(chǎng)中，應(yīng)以單一的沉降速度移動(dòng)。v選用任何單獨(dú)一種鑒定方法都不能最后確定蛋白質(zhì)的選用任何單獨(dú)一種鑒定方法都不能最后確定蛋白質(zhì)的純度，必須同時(shí)采用純度，必須同時(shí)采用2-32-3種不同的方法才能確定。種不同的方法才能確定。第四節(jié)第四節(jié) 蛋白質(zhì)的層析分離蛋白質(zhì)的層析分離n應(yīng)用廣泛。特征：有一個(gè)固定相

20、和一個(gè)流動(dòng)相。應(yīng)用廣泛。特征：有一個(gè)固定相和一個(gè)流動(dòng)相。由于待分離的各種物質(zhì)在這兩個(gè)相分配系數(shù)不由于待分離的各種物質(zhì)在這兩個(gè)相分配系數(shù)不同，當(dāng)兩個(gè)相作相對(duì)運(yùn)動(dòng)時(shí)，這些物質(zhì)在兩相同，當(dāng)兩個(gè)相作相對(duì)運(yùn)動(dòng)時(shí)，這些物質(zhì)在兩相間反復(fù)多次分配，結(jié)果使其相互分開。間反復(fù)多次分配，結(jié)果使其相互分開。n根據(jù)兩相的狀態(tài)，層析法可分為：氣相層析和根據(jù)兩相的狀態(tài)，層析法可分為：氣相層析和液相層析；按層析原理可分為：吸附層析、分液相層析；按層析原理可分為：吸附層析、分配層析、離子交換層析、凝膠過濾層析和親和配層析、離子交換層析、凝膠過濾層析和親和層析等。按操作形式分為：柱層析、薄層層析、層析等。按操作形式分為：柱層析、

21、薄層層析、紙層析等。紙層析等。n 分配系數(shù)分配系數(shù): k=C: k=Cs s/C/Cm m , ,物質(zhì)在固定相與流動(dòng)相濃度之物質(zhì)在固定相與流動(dòng)相濃度之比。質(zhì)量分配系數(shù)：比。質(zhì)量分配系數(shù)：D=kD=kVs / Vm , Vs , Vm 為固定為固定相和流動(dòng)相的體積。相和流動(dòng)相的體積。一、層析的一般原理一、層析的一般原理 3216168816812412412228 如果柱頂加入如果柱頂加入32mg32mg樣品，樣樣品，樣品的質(zhì)量分配系數(shù)品的質(zhì)量分配系數(shù)D D為為1 1，即樣品，即樣品在兩相中是等量分配。經(jīng)過在兩相中是等量分配。經(jīng)過5 5層的層的平衡分配后，樣品在柱的分配情平衡分配后，樣品在柱的分

22、配情況見圖。樣品集中在中間。如果況見圖。樣品集中在中間。如果D1D1D1，樣品集中在中間偏下。，樣品集中在中間偏下。 離子交換層析離子交換層析(IEX)(IEX)是根據(jù)電荷來(lái)分離分子的。是根據(jù)電荷來(lái)分離分子的。 離子交換劑是通過化學(xué)反應(yīng)將解離基團(tuán)引入到惰性支持物離子交換劑是通過化學(xué)反應(yīng)將解離基團(tuán)引入到惰性支持物上形成的。分為：上形成的。分為： 陽(yáng)離子交換劑陽(yáng)離子交換劑: 解離基團(tuán)帶負(fù)電解離基團(tuán)帶負(fù)電, 結(jié)合陽(yáng)離子結(jié)合陽(yáng)離子; 陰離子交換劑陰離子交換劑: 解離基團(tuán)帶正電解離基團(tuán)帶正電, 結(jié)合陰離。結(jié)合陰離。 蛋白質(zhì)分子是兩性物質(zhì)。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)分子是兩性物質(zhì)。當(dāng)pHpHpIpI，分子帶負(fù)電，可結(jié)合，分

23、子帶負(fù)電，可結(jié)合陰離子交換劑；當(dāng)陰離子交換劑；當(dāng)pHpIpHpI，分子帶正電，可結(jié)合陽(yáng)離子交換劑。，分子帶正電，可結(jié)合陽(yáng)離子交換劑。如陽(yáng)離子交換劑與帶正電蛋白質(zhì)分子之間有如下平衡：如陽(yáng)離子交換劑與帶正電蛋白質(zhì)分子之間有如下平衡： 二、離子交換層析二、離子交換層析（一）基本原理（一）基本原理 帶電蛋白質(zhì)分子與交換劑的結(jié)合是可逆的。帶電蛋白質(zhì)分子與交換劑的結(jié)合是可逆的。 由于由于pHpH可改變蛋白質(zhì)的帶電性質(zhì)和帶電量，鹽離子會(huì)影響可改變蛋白質(zhì)的帶電性質(zhì)和帶電量，鹽離子會(huì)影響蛋白質(zhì)在交換劑上吸附。所以用蛋白質(zhì)在交換劑上吸附。所以用一定濃度的鹽溶液或一一定濃度的鹽溶液或一定定pH 的緩沖液的緩沖液就可

24、把蛋白質(zhì)就可把蛋白質(zhì)從離子交換劑上從離子交換劑上洗脫下來(lái)。洗脫下來(lái)。對(duì)多組分混合物，每種分子所帶的電荷不同，因此，可對(duì)多組分混合物，每種分子所帶的電荷不同，因此，可用不同的離子強(qiáng)度用不同的離子強(qiáng)度 或不同的或不同的pHpH溶液將蛋白質(zhì)從交換劑溶液將蛋白質(zhì)從交換劑上一一上一一洗脫下來(lái)。洗脫下來(lái)。 （二）離子交換劑的基本類型（二）離子交換劑的基本類型 根據(jù)可供交換的離子的性質(zhì)，離子交換劑可被分為根據(jù)可供交換的離子的性質(zhì)，離子交換劑可被分為陽(yáng)離子交換劑和陰離子交換劑。若按酸堿性的強(qiáng)弱，又陽(yáng)離子交換劑和陰離子交換劑。若按酸堿性的強(qiáng)弱，又可分為強(qiáng)酸、強(qiáng)堿、弱酸、弱堿幾種類型的離子交換劑。可分為強(qiáng)酸、強(qiáng)堿

25、、弱酸、弱堿幾種類型的離子交換劑。 強(qiáng)酸和強(qiáng)堿型交換劑能在較廣泛的強(qiáng)酸和強(qiáng)堿型交換劑能在較廣泛的 pH范 圍 內(nèi)范 圍 內(nèi)（pH212）完全解離。弱酸型交換劑在低于完全解離。弱酸型交換劑在低于pH4、弱堿型交換劑在高于弱堿型交換劑在高于pH9就難于解離，因而失去交換就難于解離，因而失去交換能力。因?yàn)橐话愕鞍踪|(zhì)在能力。因?yàn)橐话愕鞍踪|(zhì)在pH68之間穩(wěn)定，所以常用之間穩(wěn)定，所以常用弱酸或弱堿型交換劑。弱酸或弱堿型交換劑。離子交換基團(tuán)的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)離子交換基團(tuán)的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)類型類型名稱名稱結(jié)構(gòu)式結(jié)構(gòu)式性質(zhì)性質(zhì)DEAE二乙基氨基乙基二乙基氨基乙基(diethylaminoethyl)-O-CH2-CH2-N

26、+-(C2H5)2弱堿性弱堿性QAE季胺乙基季胺乙基(quaternary aminoethyl)-O-CH2-CH2-N+-(C2H5)3強(qiáng)堿性強(qiáng)堿性Q季胺季胺(quaternary amine)-CH2-N+-(CH3)3 強(qiáng)堿性強(qiáng)堿性CM羧甲基羧甲基(carboxymehyl)-O-CH2-COO -弱酸性弱酸性SE磺乙基磺乙基(sulfoethyl)-O-CH2CH2-SO3-強(qiáng)酸性強(qiáng)酸性SP磺丙基磺丙基(sulfopropyl)-O-CH2-CH2-CH2-SO3-強(qiáng)酸性強(qiáng)酸性P磷酸基磷酸基(phosphate)-O-PO3-中酸性中酸性S磺酸基磺酸基(sulfonate)-CH2-

27、SO3-強(qiáng)酸性強(qiáng)酸性 可用來(lái)作為交換劑支持物的物質(zhì)種類較多。早期用于分離可用來(lái)作為交換劑支持物的物質(zhì)種類較多。早期用于分離氨基酸、小肽和其它小分子物質(zhì)的離子交換樹脂的支持物是氨基酸、小肽和其它小分子物質(zhì)的離子交換樹脂的支持物是聚苯聚苯乙烯類乙烯類。 分離蛋白質(zhì)的常用的親水性支持物。有三大類：纖維素、分離蛋白質(zhì)的常用的親水性支持物。有三大類：纖維素、葡聚糖凝膠葡聚糖凝膠(sephadex)、瓊脂糖凝膠瓊脂糖凝膠(sepharose)和合成凝膠和合成凝膠(Trisacryl和和Fractogel)。1、離子交換纖維素、離子交換纖維素 離子交換纖維素是以纖維素做支持介質(zhì)的。具有松散的親離子交換纖維素

28、是以纖維素做支持介質(zhì)的。具有松散的親水性網(wǎng)絡(luò)，較大的表面積，吸附容量大，通透性好。根據(jù)離子水性網(wǎng)絡(luò)，較大的表面積，吸附容量大，通透性好。根據(jù)離子交換纖維素所含離子交換基團(tuán)的性質(zhì)可分為強(qiáng)酸、強(qiáng)堿型和弱交換纖維素所含離子交換基團(tuán)的性質(zhì)可分為強(qiáng)酸、強(qiáng)堿型和弱酸、弱堿型?，F(xiàn)將常用的離子交換纖維素列于下表中。酸、弱堿型?，F(xiàn)將常用的離子交換纖維素列于下表中。常用的離子交換纖維素常用的離子交換纖維素離子類型 解 離 基 團(tuán)特 點(diǎn)DEAE-OCH2CH2N+(C2H5) 在 pH8.6 應(yīng)用 陰離子陰離子解離基團(tuán)解離基團(tuán)交換交換摩爾摩爾(m mol/g) 特點(diǎn)特點(diǎn)DEAEOCH2CH2N(C2H5)0.11.

29、1 在在pH4應(yīng)用應(yīng)用POPO3H20.77.4酸性較強(qiáng)酸性較強(qiáng)SEOCH2CH2SO3H0.20.3強(qiáng)酸性強(qiáng)酸性 在在Sephadex上接上某種離子交換基團(tuán)。這上接上某種離子交換基團(tuán)。這種凝膠既有離子交換劑的性質(zhì)，又有分子篩效種凝膠既有離子交換劑的性質(zhì)，又有分子篩效應(yīng)。因此，其分離能力比單純的層析凝膠或離應(yīng)。因此，其分離能力比單純的層析凝膠或離子交換劑好。葡聚糖凝膠離子交換劑的交換量子交換劑好。葡聚糖凝膠離子交換劑的交換量比相應(yīng)的纖維素離子交換劑大，如比相應(yīng)的纖維素離子交換劑大，如DEAESephadex的交換量大約是的交換量大約是DEAE纖維素的纖維素的3.55.0倍。倍。2、離子交換葡聚

30、糖凝膠（、離子交換葡聚糖凝膠（Sephadex）葡聚糖凝膠離子交換劑的性質(zhì)葡聚糖凝膠離子交換劑的性質(zhì) 類別類別離子交換基團(tuán)離子交換基團(tuán)床體床體積積ml/g分離范圍分離范圍(Mr)交換量交換量總交換容量總交換容量(m mol/g) 強(qiáng)陽(yáng)離子交強(qiáng)陽(yáng)離子交換劑換劑SESephadex C25 C50-CH2CH2SO3H5932383104- 21053104-21052.02-52.02-5 SPSephadex C25 C50-CH2CH2CH2SO3H 2.30.3 弱陽(yáng)離子交弱陽(yáng)離子交換劑換劑CMSephadex C25 C50-O-CH2COOH61032403104-21053104-2

31、105 4.50.5 強(qiáng)陰離子交換劑強(qiáng)陰離子交換劑QAESephadex A25 A505830403104-21053104-2105 3.04.0 弱陰離子交換劑弱陰離子交換劑DEAESephadex A25 A50-C2H4N+(C2H5)2H592583 3104-21053104-21053.54.5 類別類別離子交換基團(tuán)離子交換基團(tuán)床體積床體積ml/g分離范圍分離范圍(Mr)交換量交換量總交換容量總交換容量(m mol/g) -O-C2H4N+(C2H5)2 將各種離子基團(tuán)引入到交聯(lián)瓊脂糖將各種離子基團(tuán)引入到交聯(lián)瓊脂糖(Speharose CL)和大孔合成凝膠和大孔合成凝膠(Tri

32、sacryl或或Fractogel)上，上，則形成一系列離子交換劑。這類交換劑即堅(jiān)硬、吸則形成一系列離子交換劑。這類交換劑即堅(jiān)硬、吸附容量大，形狀球形，能維持較好的流速及分辨率。附容量大，形狀球形，能維持較好的流速及分辨率。3、交聯(lián)凝膠離子交換劑、交聯(lián)凝膠離子交換劑（三）層析條件的選擇（三）層析條件的選擇1、離子交換劑的選擇、離子交換劑的選擇 選擇離子交換劑之前要了解樣品的性質(zhì)：熱穩(wěn)選擇離子交換劑之前要了解樣品的性質(zhì)：熱穩(wěn)定性、帶電情況、定性、帶電情況、pH和鹽濃度對(duì)其活性和溶解度的和鹽濃度對(duì)其活性和溶解度的影響。一般情況下，帶負(fù)電的物質(zhì)用陰離子交換劑，影響。一般情況下，帶負(fù)電的物質(zhì)用陰離子交

33、換劑，反之，則用陽(yáng)離子交換劑。實(shí)驗(yàn)室中最廣泛使用的反之，則用陽(yáng)離子交換劑。實(shí)驗(yàn)室中最廣泛使用的是是DEAE和和CM 交換劑。交換劑。 2、交換顆粒大小的選擇、交換顆粒大小的選擇 粒子大小主要影響分辨率和流速。粗粒子大小主要影響分辨率和流速。粗粒子：交換容量小、間隙大、分辨率底、流速粒子：交換容量小、間隙大、分辨率底、流速較快。細(xì)粒子：分辨力高、交換容量大但是較快。細(xì)粒子：分辨力高、交換容量大但是流速慢。流速慢。3、層析緩沖液的選擇、層析緩沖液的選擇 選擇正確的緩沖液可獲得較好的層析效果。因?yàn)檫x擇正確的緩沖液可獲得較好的層析效果。因?yàn)殡x子相互作用取決于離子相互作用取決于pH，而維持介質(zhì)的，而維持

34、介質(zhì)的pH，通常是由，通常是由緩沖液來(lái)實(shí)現(xiàn)的。所用緩沖液的種類、緩沖液來(lái)實(shí)現(xiàn)的。所用緩沖液的種類、pH大小，決定大小，決定 待分離組分的穩(wěn)定性和溶解度。待分離組分的穩(wěn)定性和溶解度。 為避免緩沖液的離子參與離子交換過程，采用緩沖為避免緩沖液的離子參與離子交換過程，采用緩沖液所帶的電荷應(yīng)與離子交換劑所帶電荷相同。使用陽(yáng)液所帶的電荷應(yīng)與離子交換劑所帶電荷相同。使用陽(yáng)離子交換劑時(shí)，要用陰離子型緩沖液（磷酸、醋酸離子交換劑時(shí)，要用陰離子型緩沖液（磷酸、醋酸等）；使用陰離子交換劑時(shí)要用陽(yáng)離子型緩沖液（等）；使用陰離子交換劑時(shí)要用陽(yáng)離子型緩沖液（Tris、胺鹽、吡啶等）。胺鹽、吡啶等）。 要得到好的分離效果

35、，層析時(shí)要注意層析柱的高度和要得到好的分離效果，層析時(shí)要注意層析柱的高度和體積；上樣量的大??；洗脫液體積；洗脫速度；分級(jí)體積；上樣量的大小；洗脫液體積；洗脫速度；分級(jí)物的收集量。物的收集量。1、柱床體積：至少要比結(jié)合所有樣品所需要的要大、柱床體積：至少要比結(jié)合所有樣品所需要的要大25倍。離子交換層析所用的柱不用太長(zhǎng)，以便縮短操作倍。離子交換層析所用的柱不用太長(zhǎng)，以便縮短操作時(shí)間。時(shí)間。2、樣品、樣品pH 和離子強(qiáng)度：與起始緩沖液具有相同的和離子強(qiáng)度：與起始緩沖液具有相同的pH和和離子強(qiáng)度。離子強(qiáng)度。3、洗脫液體積和洗脫梯度的形狀：對(duì)柱的分辨率影響很、洗脫液體積和洗脫梯度的形狀：對(duì)柱的分辨率影響

36、很大。洗脫可用恒定組成的緩沖液來(lái)完成（簡(jiǎn)單洗脫）大。洗脫可用恒定組成的緩沖液來(lái)完成（簡(jiǎn)單洗脫）也可用改變也可用改變pH或鹽濃度，或二者均改變的洗脫液來(lái)完或鹽濃度，或二者均改變的洗脫液來(lái)完成。成。pH和鹽濃度的改變又分為連續(xù)改變（梯度洗脫）和鹽濃度的改變又分為連續(xù)改變（梯度洗脫）和不連續(xù)改變（階段洗脫）和不連續(xù)改變（階段洗脫）。（四）柱層析技術(shù)（四）柱層析技術(shù) 交換劑的處理就是將交換劑轉(zhuǎn)變?yōu)檫m合分離目的的離交換劑的處理就是將交換劑轉(zhuǎn)變?yōu)檫m合分離目的的離子類型。一般包括除雜質(zhì)、溶脹，除細(xì)粒和改型。改型就子類型。一般包括除雜質(zhì)、溶脹，除細(xì)粒和改型。改型就是用適當(dāng)?shù)碾x子平衡，使交換劑帶上希望的離子。陽(yáng)

37、離子是用適當(dāng)?shù)碾x子平衡，使交換劑帶上希望的離子。陽(yáng)離子和陰離子交換劑最后分別為和陰離子交換劑最后分別為Na和和Cl型是最穩(wěn)定形式。型是最穩(wěn)定形式。4、洗脫速度：太快或太慢都會(huì)降低柱的分辨率。、洗脫速度：太快或太慢都會(huì)降低柱的分辨率。5、分級(jí)物收集量：關(guān)系到能否充分代表層析柱的分辨、分級(jí)物收集量：關(guān)系到能否充分代表層析柱的分辨率。一般總洗脫體積在率。一般總洗脫體積在5002000ml時(shí)，每管收集時(shí)，每管收集510ml（五）離子交換劑的處理和再生（五）離子交換劑的處理和再生 離子交換劑價(jià)格較貴，用后再經(jīng)過再生處理，可反離子交換劑價(jià)格較貴，用后再經(jīng)過再生處理，可反復(fù)多次使用。處理時(shí)避免用強(qiáng)酸或強(qiáng)堿長(zhǎng)

38、時(shí)間浸泡，復(fù)多次使用。處理時(shí)避免用強(qiáng)酸或強(qiáng)堿長(zhǎng)時(shí)間浸泡，以防載體的糖鏈結(jié)構(gòu)遭水解破壞。以防載體的糖鏈結(jié)構(gòu)遭水解破壞。 劑型劑型處理用的酸或堿濃度處理用的酸或堿濃度浸泡時(shí)間浸泡時(shí)間纖維素纖維素 SephadexSepharose合成凝膠合成凝膠0.5M HCl或或NaOH(含含0.5M NaCl)0.1M HCl或或NaOH(含含1M NaCl)1M NaAc (pH3.0)或或0.1M NaOH(含含1M NaCl)0.51.0M HCl或或NaOH(含含1M NaCl)34h0.5h可在柱中再生可在柱中再生長(zhǎng)時(shí)間浸泡無(wú)影響長(zhǎng)時(shí)間浸泡無(wú)影響各類離子交換劑的再生條件各類離子交換劑的再生條件 血清

39、蛋白常用離子交換層析分離。血清蛋白常用離子交換層析分離。IgG可用可用QAESephadex A50或或DEAESephadex A50分離?，F(xiàn)在臨床上有重要用途的許多血清蛋白，分離。現(xiàn)在臨床上有重要用途的許多血清蛋白，如白蛋白，如白蛋白，factor IX復(fù)合物和專一性免疫球蛋白已復(fù)合物和專一性免疫球蛋白已用離子交換層析大規(guī)模生產(chǎn)。用離子交換層析大規(guī)模生產(chǎn)。（六）離子交換層系的應(yīng)用實(shí)例（六）離子交換層系的應(yīng)用實(shí)例 凝膠層析又稱凝膠滲透層析、排阻層析，分子篩凝膠層析又稱凝膠滲透層析、排阻層析，分子篩層析等。它主要用于分離分子大小不同的生物大分子層析等。它主要用于分離分子大小不同的生物大分子及測(cè)定其分子量。凝膠層析設(shè)備簡(jiǎn)單，操作簡(jiǎn)便，每及測(cè)定其分子量。凝膠層析設(shè)備簡(jiǎn)單，操作簡(jiǎn)便，每次層析后無(wú)需再生處理，因此，在生化研究中應(yīng)用及次層析后無(wú)需再生處理，因此，在生化研究中應(yīng)用及其廣泛。其廣泛。三、凝膠過濾層析三、凝