病原菌分離培養(yǎng)總結(jié)

1、病原菌的分離培養(yǎng)方法一、 基本原理植物病原菌的分離培養(yǎng)，是植物病理實(shí)驗(yàn)室工作中的基本技能。為了獲得某微生物的純培養(yǎng)，一般是根據(jù)該微生物對(duì)營(yíng)養(yǎng)、酸堿度、氧氣等條件要求不同，而供給它們適宜的生活條件，即讓病原菌生活在適宜的培養(yǎng)基上，或加入某種抑制劑造成只利于此菌生長(zhǎng)，而抑制其他菌生長(zhǎng)的環(huán)境，從而得到純菌株。植物病原真菌的分離方法主要有組織分離法和稀釋分離法兩種。最常用的方法是組織分離法，而稀釋分離法主要用于病組織上產(chǎn)生大量孢子的病原真菌的分離。為了獲得分離菌的純培養(yǎng)，必須要進(jìn)行分離菌的純化，純化的方法類似于分離工作中采用的稀釋分離法或劃線分離法。二 病原真菌的分離培養(yǎng)（花生褐斑病為例）1. 分離的

2、準(zhǔn)備工作（1）分離材料準(zhǔn)備：花生褐斑病葉片：病斑圓形或近圓形暗褐色、黑褐色，淡黃色暈圈。背面有許多黑色小點(diǎn)，呈同心輪紋狀排列。（2）培養(yǎng)基的準(zhǔn)備: PDA培養(yǎng)基,加熱熔化，紫外滅菌后倒板； Ø（3）分離工作儀器與用品：超鏡工作臺(tái)、培養(yǎng)箱、無(wú)菌培養(yǎng)皿、剪刀、解剖刀、鑷子、接種鏟(針)、70酒精、01升汞、酒精燈、火機(jī)、記號(hào)筆、橡皮筋套、可調(diào)式電爐等。（升汞是劇毒藥物，在操作時(shí)應(yīng)特別小心）。2. 組織分離法 （1） 工作前用肥皂洗手，無(wú)菌操作前還要用70酒精擦拭雙手；在使用無(wú)菌操作間時(shí)，呼吸要輕，不要說(shuō)話。（2） 酒精燈放入中間合適位置，點(diǎn)燃后不要在移動(dòng)，保證火焰周圍

3、無(wú)菌環(huán)境；（3） 取花生褐斑病的癥狀典型病葉(或其他分離材料)，選擇典型的單個(gè)病斑，用剪刀或解剖刀從病斑邊緣(病健交界處)切取小塊病組織數(shù)塊。（選擇新患病的組織作為分離的材料，可以減少腐生菌混入的機(jī)會(huì)。腐生菌一般在發(fā)病很久而已經(jīng)枯死或腐敗的部分滋生，因此，一般斑點(diǎn)病害應(yīng)在臨近健全組織的部分分離。）（4） 表面消毒：用菌培養(yǎng)皿一次準(zhǔn)備流程（75%酒精0.1%升汞無(wú)菌水無(wú)菌水無(wú)菌水），將病組織放人70酒精中浸35s后，按無(wú)菌操作法將病組織移人01升汞液中分別表面消毒1 min左右（如植物組織柔嫩，則表面消毒時(shí)間宜短；反之則可長(zhǎng)些），然后放入滅菌水中連續(xù)漂洗三次，除去殘留的消毒劑。（5） 用無(wú)菌操作

4、法將病組織移至平板培養(yǎng)基上，每皿內(nèi)放3-5塊。（在將病組織小塊移放到平板表面之前，應(yīng)將其在無(wú)菌吸水紙上吸去多余的水，以大大減少病組織附近出現(xiàn)細(xì)菌污染）。（6） 將培養(yǎng)皿倒置放人25 左右恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)。一般34d后觀察待分離菌生長(zhǎng)結(jié)果；若病組織小塊上均長(zhǎng)出較為一致的菌落，則多半為要分離的病原菌。（7） 除根據(jù)菌落的一致性初步確定長(zhǎng)出的菌落是否目標(biāo)菌外，還要在顯微鏡下檢查，并且根據(jù)保濕培養(yǎng)的結(jié)果進(jìn)一步確定；（8） 在無(wú)菌條件下，用打孔菌落邊緣挑取小塊移入培養(yǎng)基上，在25左右恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)，數(shù)日后，觀察菌落生長(zhǎng)情況，如無(wú)雜菌生長(zhǎng)，即得該分離病菌純菌種，便可保存。三 病原細(xì)菌的分離培養(yǎng)（蘿卜黑腐病為例）

5、1.分離的準(zhǔn)備工作（1）分離材料準(zhǔn)備：蘿卜黑腐病俗稱黑心、爛心，該病是由細(xì)菌引起的病害。主要危害葉和根。幼苗期發(fā)病子葉呈水浸狀，根髓變黑腐爛。葉片發(fā)病，葉緣多處產(chǎn)生黃色斑，后變"V"字形向內(nèi)發(fā)展，葉脈變黑呈網(wǎng)紋狀，逐漸整葉變黃干枯。病菌沿葉脈和維管束向短縮莖和根部發(fā)展，最后使全株葉片變黃枯死。蘿卜肉質(zhì)根受浸染后，透過(guò)日光可看到暗灰色病變；橫切蘿卜可看到維管束呈放射線狀、黑褐色；重者呈干縮空洞，維管束溢出菌膿，這一點(diǎn)與缺硼引起的生理性變黑不同。（2）培養(yǎng)基的準(zhǔn)備:PDA，后劃線純化NB；（3）分離工作儀器與用品：超鏡工作臺(tái)、培養(yǎng)箱、無(wú)菌培養(yǎng)皿、剪刀、解剖刀、鑷子、70酒精、酒

6、精燈、火機(jī)、記號(hào)筆、橡皮筋套、可調(diào)式電爐等。2.黑腐病菌分離（1）工作前用肥皂洗手，無(wú)菌操作前還要用70酒精擦拭雙手；在使用無(wú)菌操作間時(shí)，呼吸要輕，不要說(shuō)話。（2）酒精燈放入中間合適位置，點(diǎn)燃后不要在移動(dòng)，保證火焰周圍無(wú)菌環(huán)境；（3）取蘿卜黑腐病塊莖，用75 %酒精進(jìn)行表面消毒；用滅菌解剖刀切去表面，并向內(nèi)切取病組織，切成長(zhǎng)條小塊（2mm*3mm），用無(wú)菌操作法將病組織移至平板培養(yǎng)基上，每皿內(nèi)放3-5塊。（在將病組織小塊移放到平板表面之前，應(yīng)將其在無(wú)菌吸水紙上吸去多余的水，以大大減少病組織附近出現(xiàn)細(xì)菌污染）。（4）將培養(yǎng)皿倒置放人28 左右恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)。一般34d后觀察待分離菌生長(zhǎng)結(jié)果；若病組

7、織小塊上均長(zhǎng)出較為一致的菌落，則多半為要分離的病原菌。（5）根據(jù)菌落的一致性初步確定長(zhǎng)出的菌落，選擇長(zhǎng)出的三種菌落（黃、紅、生防），分別在無(wú)菌條件下在NB培養(yǎng)基進(jìn)行劃線；在28左右恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)，數(shù)經(jīng)培養(yǎng)后出現(xiàn)的菌落在形態(tài)特征都趨于一致，并與典型描述的特征相一致時(shí)，即表明已獲得純培養(yǎng)；最好要經(jīng)過(guò)連續(xù)三次單菌落的分離，才能確保純化。（6）觀察到的菌落特征：蘿卜黑腐病菌，圓形，同心環(huán)狀，內(nèi)環(huán)呈金黃色，外圍白色菌膿，濕潤(rùn)，隨環(huán)隆起、凹陷，半透明，邊緣不整齊。四資料查詢其他分離培養(yǎng)方法1.病原真菌稀釋分離法(1)取滅菌培養(yǎng)皿三個(gè)，平放在濕紗布上，編號(hào)，并注明日期、分離材料及分離人姓名。(2)用滅菌吸管吸

8、取滅菌水，在每一皿中分別注入0510ml。(3)用移植環(huán)蘸一滴孢子懸浮液，與第一個(gè)培養(yǎng)皿中的滅菌水混合，再?gòu)牡谝粋€(gè)培養(yǎng)皿移三環(huán)到第二個(gè)培養(yǎng)皿中，混合后再移三環(huán)到第三個(gè)培養(yǎng)皿中。(4)將熔化開(kāi)冷卻到4550C的培養(yǎng)基，分別倒在三個(gè)培養(yǎng)皿中(為防止細(xì)菌污染，也可以向每個(gè)培養(yǎng)皿中事先加入1-2滴25乳酸)，搖勻，凝固，要使培養(yǎng)基與稀釋的菌液充分混勻。提示：倒平板時(shí)的培養(yǎng)基溫度一定要掌握好，過(guò)熱易將病原菌燙死而使分離失敗，過(guò)冷則倒入培養(yǎng)皿中后難以形成平板，而成為起伏不平的表面，不利于分離。為大體估計(jì)培養(yǎng)基溫度，可將盛培養(yǎng)基的器皿靠在人手背上，如果手背感到燙但尚可以忍耐，則大體為4550C。(5)將培養(yǎng)

9、皿翻轉(zhuǎn)后置恒溫箱(25)中培養(yǎng)，數(shù)日后觀察菌落生長(zhǎng)情況。(6)挑菌。將培養(yǎng)后長(zhǎng)出較為整齊一致的單個(gè)菌落分別挑取，接種到斜面培養(yǎng)基上，置25左右培養(yǎng)。待菌長(zhǎng)出后，檢查菌是否單純，若有其他菌混雜，就要再一次進(jìn)行分離純化，直到獲得純株培養(yǎng)。2.病原細(xì)菌病原細(xì)菌的分離方法以稀釋分離法和劃線分離法為最常用。在進(jìn)行分離之前，首先應(yīng)對(duì)病組織材料進(jìn)行細(xì)菌學(xué)初步診斷，即經(jīng)過(guò)鏡檢確認(rèn)有噴菌現(xiàn)象以后，才對(duì)該病組織作分離工作。稀釋分離法是最經(jīng)典的標(biāo)準(zhǔn)分離法，方法同上述真菌分離。除去上述稀釋分離法以外，較為方便的是劃線分離法：(1)預(yù)先把熔化好的肉膏蛋白胨培養(yǎng)基倒在培養(yǎng)皿中，凝成平板后，翻轉(zhuǎn)放在30C恒溫箱中24h，使

10、表面無(wú)水滴凝結(jié)。也可凝成平板后直接使用。(2)將病組織先用01升汞表面消毒05-2min，再用無(wú)菌水換洗3次后，放在滅菌培養(yǎng)皿中的滅菌水中，用滅菌玻棒研碎，并讓組織碎塊在水中浸泡2060min，讓細(xì)菌釋放到滅菌水中。(3)用滅菌的接種鉺(接種環(huán))蘸取浸泡液在干燥的培養(yǎng)基平板表面劃線，盡量不要把平板表面劃破。劃過(guò)第一批線后的接種環(huán)應(yīng)放在火焰上燒灼冷卻后直接在第一批劃線的末端向另一方向劃線。滅菌后再劃第三次線。提示：劃過(guò)第一批線后接種鉺放在火焰上燒過(guò)這一步驟非常重要，這樣做可以使第一批線和第二批線上的細(xì)菌數(shù)量相差很大。(4)用玻璃鉛筆在培養(yǎng)皿上寫(xiě)上分離材料、日期和分離者姓名后，翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)皿，放在26

11、28C恒溫箱中培養(yǎng)。13d后觀察有無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)，在哪些地方有單菌落生長(zhǎng)出來(lái)?其中的優(yōu)勢(shì)單菌落應(yīng)為待分離菌形成的。(5)仔細(xì)挑取病原菌的單菌落，并移植到斜面培養(yǎng)基上。同時(shí)，再把單菌落用滅菌水稀釋成懸浮液作第二次劃線分離，經(jīng)培養(yǎng)后出現(xiàn)的菌落在形態(tài)特征都趨于一致，并與典型描述的特征相一致時(shí)，即表明已獲得純培養(yǎng)。最好要經(jīng)過(guò)連續(xù)三次單菌落的分離，才能確保純化。五 常用的幾種典型的病原菌分離方法 1斑點(diǎn)病原菌的分離。從病斑部分切取每邊35mm的小塊組織，在70酒精中浸數(shù)秒鐘后，移人01的升汞水溶液中處理35rain，以滅菌水沖洗3次，移置培養(yǎng)皿的培養(yǎng)基中，然后培養(yǎng)。2維管束組織內(nèi)病原菌的分離。從根莖維管束組織分離病菌，可先將寄主病部表面用70酒精擦拭消毒，將表皮組織用滅菌的解剖刀削去，然后切取其中小塊變色的維管束組織，用升汞或漂白粉液消毒后，用滅菌水沖洗幾次，移置培養(yǎng)基面上。3根腐病病原菌的分離。根腐或基腐病的分離，由材料的大小決定。材料小的可仿照斑點(diǎn)病的分離法，材料大的則可以用維管束組織內(nèi)病原的分離法。4肉質(zhì)組織中病原菌的分離。多肉的根、莖及果實(shí)等，可以采用維管束組織內(nèi)病菌分離法除去表面組織，切取小塊病組織分離。如有雜菌感染可采用“直接接種”法，待出現(xiàn)癥狀后，用此法