DNA和RNA提取方法及原理 和 提取方法及原理 DNA提取專題 DNA提取專題第一部分

1、.DNA和RNA提取方法及原理 和 提取方法及原理 DNA提取專題 DNA提取專題第一部分： 第一部分：DNA提取方法簡介 提取方法簡介 第二部分： 第二部分：DNA提取常見問題分析及對策 提取常見問題分析及對策 前言 DNA是遺傳信息的載體，是最重要的生物 是遺傳信息的載體， 是遺傳信息的載體 信息分子，是分子生物學研究的主要對象。 信息分子，是分子生物學研究的主要對象。為 了進行測序、雜交和基因的表達，獲得高分子 了進行測序、雜交和基因的表達， 量和高純度的DNA是非常重要的前提。 是非常重要的前提。 量和高純度的 是非常重要的前提 DNA提取原則 DNA提取原則保證DNA結構的完整性 純

2、化后不應存在對酶有抑制作用的物質(zhì) 排除有機溶劑和金屬離子的污染 蛋白質(zhì)、多糖、脂類等降低到最低程度 排除其他核酸分子的污染 DNA提取的幾種方法 DNA提取的幾種方法染色體DNA的提取 染色體DNA的提取 DNA CTAB法 法 SDS法 SDS法 其它 DNA提取的幾種方法 DNA提取的幾種方法非染色體DNA的提取 的提取 非染色體 質(zhì)粒DNA的提取 的提取 質(zhì)粒 ? 堿裂解法 ? 煮沸法 線粒體、葉綠體 線粒體、葉綠體DNA的提取 的提取 ? 差速離心結合 差速離心結合SDS裂解法 裂解法 基因組DNA CTAB法 基因組DNA CTAB法 CTAB法原理（植物 提取經(jīng)典方法） 法原理 植

3、物DNA提取經(jīng)典方法 提取經(jīng)典方法） CTAB（hexadecyltrimethylammonium bromide，十六烷基三甲基 （ ， 溴化銨），是一種陽離子去污劑，可溶解細胞膜， ），是一種陽離子去污劑 溴化銨），是一種陽離子去污劑，可溶解細胞膜，并與核酸形成復合 物。 該復合物在高鹽溶液中（ 該復合物在高鹽溶液中（>0.7mol/L NaCl）是可溶的，通過有機溶劑 ）是可溶的， 抽提，去除蛋白、多糖、 抽提，去除蛋白、多糖、酚類等雜質(zhì)后加入乙醇沉淀即可使核酸分離 出來。 出來。 溶液在低于15 時會形成沉淀析出， 注：CTAB溶液在低于 時會形成沉淀析出，因此在將其加入冰冷的

4、 溶液在低于 植物材料之前必須預熱，且離心時溫度不要低于 植物材料之前必須預熱，且離心時溫度不要低于15。 基因組DNA CTAB法 基因組DNA CTAB法 CTAB提取緩沖液的經(jīng)典配方 提取緩沖液的經(jīng)典配方 Tris-HCl （pH8.0）提供一個緩沖環(huán)境，防止核酸被破壞； ）提供一個緩沖環(huán)境，防止核酸被破壞； EDTA螯合 2+或Mn2+離子，抑制 螯合Mg 離子，抑制DNase活性； 活性； 螯合 活性 NaCl 提供一個高鹽環(huán)境，使DNP充分溶解，存在于液相中； 提供一個高鹽環(huán)境， DNP充分溶解 存在于液相中； 充分溶解， CTAB溶解細胞膜，并結合核酸，使核酸便于分離； 溶解細胞

5、膜，并結合核酸，使核酸便于分離； 溶解細胞膜 -巰基乙醇是抗氧化劑，有效地防止酚氧化成醌，避免褐變，使酚容易去除 巰基乙醇是抗氧化劑，有效地防止酚氧化成醌，避免褐變， 巰基乙醇是抗氧化劑 CTAB提取緩沖液的改進配方 提取緩沖液的改進配方 PVP（聚乙烯吡咯烷酮）是酚的絡合物，能與多酚形成一種不溶的絡合 （聚乙烯吡咯烷酮）是酚的絡合物， 物質(zhì)，有效去除多酚，減少 中酚的污染； 物質(zhì)，有效去除多酚，減少DNA中酚的污染；同時它也能和多糖結合， 中酚的污染 同時它也能和多糖結合， 有效去除多糖。 有效去除多糖。 基因組DNA CTAB法 基因組DNA CTAB法 CTAB法流程圖 法流程圖植物材料

6、 裂解液酒精沉淀 液氮研磨 抽提 離心洗滌 DNA溶液 溶液 細胞裂解 上層溶液 干燥溶解 基因組DNASDS法 基因組DNASDS法 SDS法原理 法原理 SDS是一種陰離子去垢劑， 在高溫 （ 5565） 條件下能裂解細 是一種陰離子去垢劑，在高溫（ 是一種陰離子去垢劑 使染色體離析，蛋白變性，釋放出核酸； 胞，使染色體離析，蛋白變性，釋放出核酸； 提高鹽(KAc或NH4Ac)濃度并降低溫度（冰浴），使蛋白質(zhì)及多糖 或 濃度并降低溫度（ 提高鹽 濃度并降低溫度 冰?。?雜質(zhì)沉淀，離心后除去沉淀； 雜質(zhì)沉淀，離心后除去沉淀； 上清液中的DNA用酚 氯仿抽提，反復抽提后用乙醇沉淀水相中的 用酚

7、/氯仿抽提 上清液中的 用酚 氯仿抽提， DNA。 。 基因組DNASDS法 基因組DNASDS法 SDS法流程圖 以動物組織為例） SDS法流程圖 （以動物組織為例）動物組織抽提 離心洗滌 組織勻漿 上層溶液 干燥溶解 細胞裂解 酒精沉淀 DNA溶液 溶液 基因組DNA 基因組DNA其它方法根據(jù)細胞裂解方式的不同有： 根據(jù)細胞裂解方式的不同有：物理方式：玻璃珠法、超聲波法、研磨法、 物理方式：玻璃珠法、超聲波法、研磨法、凍融法 化學方式：異硫氰酸胍法、 化學方式：異硫氰酸胍法、堿裂解法 生物方式： 生物方式：酶法 基因組DNA 基因組DNA其它方法根據(jù)核酸分離純化方式的不同有： 根據(jù)核酸分離

8、純化方式的不同有：吸附材料結合法： 吸附材料結合法： ? ? ? 硅質(zhì)材料 高鹽低pH值結合核酸，低鹽高pH值洗脫。 高鹽低pH值結合核酸，低鹽高pH值洗脫。 pH值結合核酸 pH值洗脫 快捷高效。 快捷高效。 陰離子交換樹脂 低鹽高pH值結合核酸，高鹽低pH值洗脫。 低鹽高pH值結合核酸，高鹽低pH值洗脫。 pH值結合核酸 pH值洗脫 適用于純度要求高的實驗。 適用于純度要求高的實驗。 磁珠 磁性微粒掛上不同基團可吸附不同的目的 物，從而達到分離目的。 從而達到分離目的。 基因組DNA 基因組DNA其它方法濃鹽法： 濃鹽法：利用RNP和DNP在鹽溶液中溶解度不同，將二者分離 和 在鹽溶液中溶

9、解度不同， 利用 在鹽溶液中溶解度不同 有機溶劑抽提法： 有機溶劑抽提法：有機溶劑作為蛋白變性劑， 有機溶劑作為蛋白變性劑，同時抑制核酸酶的降解作用 密度梯度離心法： 密度梯度離心法：利用不同內(nèi)容物密度不同的原理分離各種內(nèi)容物 質(zhì)粒DNA 質(zhì)粒DNA堿裂解法堿裂解法原理染色體DNA比質(zhì)粒DNA分子大得多，且染色體DNA為 染色體DNA比質(zhì)粒DNA分子大得多，且染色體DNA為線狀分 DNA比質(zhì)粒DNA分子大得多 DNA 而質(zhì)粒DNA為共價閉合環(huán)狀分子； DNA為共價閉合環(huán)狀分子 子，而質(zhì)粒DNA為共價閉合環(huán)狀分子； 當用堿處理DNA溶液時，線狀染色體DNA容易發(fā)生變性， 當用堿處理DNA溶液時，

10、線狀染色體DNA容易發(fā)生變性，共 DNA溶液時 DNA容易發(fā)生變性 價閉環(huán)的質(zhì)粒DNA在回到中性pH時即恢復其天然構象； DNA在回到中性pH時即恢復其天然構象 價閉環(huán)的質(zhì)粒DNA在回到中性pH時即恢復其天然構象； 變性染色體DNA片段與變性蛋白質(zhì)和細胞碎片結合形成沉 變性染色體DNA片段與變性蛋白質(zhì)和細胞碎片結合形成沉 DNA 而復性的超螺旋質(zhì)粒DNA DNA分子則以溶解狀態(tài)存在液相 淀，而復性的超螺旋質(zhì)粒DNA分子則以溶解狀態(tài)存在液相 從而可通過離心將兩者分開。 中，從而可通過離心將兩者分開。 質(zhì)粒DNA 質(zhì)粒DNA堿裂解法堿裂解法流程圖對數(shù)期菌體 上清液 沉淀 溶液I充分重懸 溶液 充分

11、重懸 抽提 干燥溶解 溶液II裂解 溶液 裂解 酒精沉淀 質(zhì)粒DNA溶液 溶液 質(zhì)粒 溶液III中和 溶液 中和 離心洗滌 質(zhì)粒DNA 質(zhì)粒DNA煮沸法煮沸法原理染色體DNA比質(zhì)粒DNA分子大得多，且染色體DNA為 染色體DNA比質(zhì)粒DNA分子大得多，且染色體DNA為線狀分 DNA比質(zhì)粒DNA分子大得多 DNA 而質(zhì)粒DNA為共價閉合環(huán)狀分子； DNA為共價閉合環(huán)狀分子 子，而質(zhì)粒DNA為共價閉合環(huán)狀分子； 當加熱處理DNA溶液時，線狀染色體DNA容易發(fā)生變性， 當加熱處理DNA溶液時，線狀染色體DNA容易發(fā)生變性，共 DNA溶液時 DNA容易發(fā)生變性 價閉環(huán)的質(zhì)粒DNA在冷卻時即恢復其天然構

12、象； DNA在冷卻時即恢復其天然構象 價閉環(huán)的質(zhì)粒DNA在冷卻時即恢復其天然構象； 變性染色體DNA片段與變性蛋白質(zhì)和細胞碎片結合形成沉 變性染色體DNA片段與變性蛋白質(zhì)和細胞碎片結合形成沉 DNA 而復性的超螺旋質(zhì)粒DNA DNA分子則以溶解狀態(tài)存在液相 淀，而復性的超螺旋質(zhì)粒DNA分子則以溶解狀態(tài)存在液相 從而可通過離心將兩者分開。 中，從而可通過離心將兩者分開。 細胞器DNA 細胞器DNA差速離心法線粒體和葉綠體是生物體內(nèi)半自主性細胞器， 線粒體和葉綠體是生物體內(nèi)半自主性細胞器，自身可編碼蛋 它們的比重和大小一定 比重和大小一定， 白，它們的比重和大小一定，因而在同一離心場內(nèi)的沉降速度

13、也一定，根據(jù)這一原理，常用不同轉速的離心法， 也一定，根據(jù)這一原理，常用不同轉速的離心法，將細胞內(nèi)各 種組分分級分離出來。 種組分分級分離出來。 差速離心法原理是利用物質(zhì)比重的不同分離混合物的一種方法。 是利用物質(zhì)比重的不同分離混合物的一種方法。 將待分離物質(zhì)置于均勻介質(zhì)（蔗糖） 將待分離物質(zhì)置于均勻介質(zhì)（蔗糖）中，以一定的轉速進 行離心，比重大的物質(zhì)優(yōu)先沉降，比重小的卻處于上層， 行離心，比重大的物質(zhì)優(yōu)先沉降，比重小的卻處于上層， 從而得以分離。 從而得以分離。 內(nèi)容第一部分： 第一部分：DNA提取方法簡介 提取方法簡介 第二部分：DNA提取及常見問題分析 第二部分： 提取及常見問題分析 D

14、NA提取的基本步驟 DNA提取的基本步驟 I.材料準備 I.材料準備 II.破碎細胞或包膜 II.破碎細胞或包膜內(nèi)容物釋放 破碎細胞或包膜 III.核酸分離、 III.核酸分離、純化 核酸分離 IV.沉淀或吸附核酸， IV.沉淀或吸附核酸，并去除雜質(zhì) 沉淀或吸附核酸 V.核酸溶解在適量緩沖液或水中 V.核酸溶解在適量緩沖液或水中 材料準備基因組DNA的提取 基因組DNA的提取 DNA 最好使用新鮮材料， 最好使用新鮮材料，低溫保 存的樣品材料不要反復凍融 提取血液基因組DNA時，要 時 提取血液基因組 選擇有核細胞（白細胞） 選擇有核細胞（白細胞） 組培細胞培養(yǎng)時間不能過長， 組培細胞培養(yǎng)時間

15、不能過長， 否則會造成DNA降解 否則會造成 降解 含病毒的液體材料DNA含量較 含病毒的液體材料DNA含量較 DNA 少，提取前先富集 質(zhì)粒DNA的提取 質(zhì)粒DNA的提取 DNA 使用處于對數(shù)期的新鮮菌體 老化菌體導致開環(huán)質(zhì)粒增加） （老化菌體導致開環(huán)質(zhì)粒增加） 培養(yǎng)時應加入篩選壓力， 培養(yǎng)時應加入篩選壓力，否則 菌體易污染， 菌體易污染，質(zhì)粒易丟失 盡量選擇高拷貝的質(zhì)粒， 盡量選擇高拷貝的質(zhì)粒，如為 低拷貝或大質(zhì)粒， 低拷貝或大質(zhì)粒，則應加大菌 體用量 菌株不要頻繁轉接（質(zhì)粒丟失） 菌株不要頻繁轉接（質(zhì)粒丟失） 細胞裂解基因組DNA的提取 基因組DNA的提取 DNA 材料應適量，過多會影響

16、裂解， 材料應適量，過多會影響裂解， 導致DNA量少，純度低 量少， 導致 量少 針對不同材料， 針對不同材料，選擇適當?shù)牧?解預處理方式： 解預處理方式： 植物材料 液氮研磨 植物材料液氮研磨 動物組織 勻漿或液氮研磨 動物組織勻漿或液氮研磨 組培細胞蛋白酶K 蛋白酶 組培細胞蛋白酶 細菌 溶菌酶破壁 細菌溶菌酶破壁 酵母 破壁酶或玻璃珠 酵母破壁酶或玻璃珠 高溫溫浴時， 高溫溫浴時，定時輕柔振蕩 質(zhì)粒DNA的提取 質(zhì)粒DNA的提取 DNA 菌體量適當 培養(yǎng)基去除干凈， 培養(yǎng)基去除干凈，同時保證菌 體在懸浮液中充分懸浮 變性的時間不要過長（ 分鐘 分鐘）， 變性的時間不要過長（5分鐘）， 否

17、則質(zhì)粒易被打斷 復性時間也不宜過長， 復性時間也不宜過長，否則會 有基因組DNA的污染 有基因組 的污染 G菌、酵母質(zhì)粒的提取，應先 酵母質(zhì)粒的提取， 用酶法或機械法處理， 用酶法或機械法處理，以破壁 ? ? ? ? ? 核酸分離、 核酸分離、純化基因組DNA的提取 基因組DNA的提取 DNA 質(zhì)粒DNA的提取 質(zhì)粒DNA的提取 DNA 采用吸附材料吸附的方式分離DNA時，應提 時 采用吸附材料吸附的方式分離 供相應的緩沖體系 采用有機（ 氯仿 抽提時應充分混勻， 氯仿） 采用有機（酚/氯仿）抽提時應充分混勻，但 動作要輕柔 離心分離兩相時， 離心分離兩相時，應保證一定的轉速和時間 針對不同材

18、料的特點， 針對不同材料的特點，在提取過程中輔以相 應的去雜質(zhì)的方法 核酸分離、 核酸分離、純化蛋白質(zhì)的去除： 蛋白質(zhì)的去除：酚/氯仿抽提 使用變性劑變性（SDS、異硫氰酸胍等） 使用變性劑變性（SDS、異硫氰酸胍等） 高鹽洗滌 蛋白酶處理 核酸分離、 核酸分離、純化多糖的去除： 多糖的去除：高鹽法：用乙醇沉淀時，在待沉淀溶液中加入1/2體 高鹽法：用乙醇沉淀時，在待沉淀溶液中加入1/2體 1/2 積的5M NaCl，高鹽可溶解多糖。 積的5M NaCl，高鹽可溶解多糖。 用多糖水解酶將多糖降解。 用多糖水解酶將多糖降解。 在提取緩沖液中加一定量的氯苯(1/2體積) 在提取緩沖液中加一定量的氯

19、苯(1/2體積)，氯苯可 (1/2體積 以與多糖的羥基作用， 以與多糖的羥基作用，從而去除多糖 。 代替乙醇沉淀DNA DNA： DNA液中加入 用PEG8000代替乙醇沉淀DNA：在500L DNA液中加入 冰浴20min 20min。 200l 20% PEG8000 (含1.2 M NaCl) ，冰浴20min。 核酸分離、 核酸分離、純化多酚的去除： 多酚的去除：在抽提液中加入防止酚類氧化的試劑： 在抽提液中加入防止酚類氧化的試劑：-巰基乙醇、 巰基乙醇、 抗壞血酸、半胱氨酸、二硫蘇糖醇等 抗壞血酸、半胱氨酸、 加入易與酚類結合的試劑：如PVP、PEG(聚乙二醇)，它 加入易與酚類結合

20、的試劑： PVP、PEG(聚乙二醇) 聚乙二醇 們與酚類有較強的親和力，可防止酚類與DNA DNA的結合 們與酚類有較強的親和力，可防止酚類與DNA的結合 鹽離子的去除： 鹽離子的去除： 70 70的乙醇洗滌 核酸沉淀、 核酸沉淀、溶解基因組DNA的提取 基因組DNA的提取 DNA 質(zhì)粒DNA的提取 質(zhì)粒DNA的提取 DNA 當沉淀時間有限時，用預冷的乙醇或異丙醇沉淀， 當沉淀時間有限時，用預冷的乙醇或異丙醇沉淀， 沉淀會更充分 沉淀時加入1/10體積的 體積的NaOAc（pH5.2，3M），有 ），有 沉淀時加入 體積的 （ ， ）， 利于充分沉淀 沉淀后應用70的乙醇洗滌， 沉淀后應用 的

21、乙醇洗滌，以除去鹽離子等 晾干DNA，讓乙醇充分揮發(fā)（不要過分干燥） ，讓乙醇充分揮發(fā)（不要過分干燥） 晾干 若長期儲存建議使用TE緩沖液溶解 若長期儲存建議使用 緩沖液溶解 ? ? TE中的 中的EDTA能螯和 2+或Mn2+離子，抑制 能螯和Mg 離子，抑制DNase 中的 能螯和 pH值為 ，可防止 值為8.0，可防止DNA發(fā)生酸解 值為 發(fā)生酸解 基因組DNA的檢測 基因組DNA的檢測提取的基因組DNA片段在 片段在20kb30kb之間 提取的基因組 片段在 之間 高質(zhì)量的基因組DNA帶型 單一無拖尾現(xiàn)象 帶型 高質(zhì)量的基因組 DNA濃度及純度的檢測 A260=1 約 50 ?g/ m

22、L 雙鏈 濃度及純度的檢測 雙鏈DNA； ； A260/280 約為1.8 約為 DNA提取常見問題 DNA提取常見問題問題一：DNA樣品不純 抑制后續(xù)酶解和PCR反應。 樣品不純， PCR反應 問題一：DNA樣品不純，抑制后續(xù)酶解和PCR反應。 原因 1. 2. 3. 4. DNA中含有蛋白、多 DNA中含有蛋白、 中含有蛋白 糖、多酚類雜質(zhì) DNA在溶解前 在溶解前， DNA在溶解前，有酒 精殘留， 精殘留，酒精抑制 后續(xù)酶解反應 DNA中殘留有金屬離 DNA中殘留有金屬離 子 RNA的存留 有RNA的存留 1. 對 策 2. 3. 4. 重新純化DNA， 重新純化DNA，過吸附 DNA

23、柱去除蛋白、多糖、 柱去除蛋白、多糖、 多酚等雜質(zhì) 重新沉淀DNA DNA， 重新沉淀DNA，讓酒精 充分揮發(fā) 增加70 70 增加70乙醇洗滌的 次數(shù)（ 次數(shù)（2-3次） 加入RNase降解RNA RNase降解 加入RNase降解RNA DNA提取常見問題 DNA提取常見問題問題二：DNA降解 降解。 問題二：DNA降解。 原 因 1. 2. 3. 4. 5. 1. 2. 3. 材料不新鮮或反復凍 融 未很好抑制內(nèi)源核酸 對 酶的活性 提取過程操作過于劇 策 DNA被機械打斷 烈，DNA被機械打斷 外源核酸酶污染 反復凍融 4. 5. 盡量取新鮮材料， 盡量取新鮮材料，低溫保存材料避 免反

24、復凍融 液氮研磨或勻漿組織后， 液氮研磨或勻漿組織后，應在解凍 前加入裂解緩沖液 在提取內(nèi)源核酸酶含量豐富的材料 DNA時 的DNA時，可增加裂解液中螯合劑 的含量， 的含量，細胞裂解后的后續(xù)操作應 盡量輕柔 所有試劑用無菌水配制， 所有試劑用無菌水配制，耗材經(jīng)高 溫滅菌 DNA分裝保存于緩沖液中 分裝保存于緩沖液中， 將DNA分裝保存于緩沖液中，避免 反復凍融 DNA提取常見問題 DNA提取常見問題問題三：DNA提取量少 提取量少。 問題三：DNA提取量少。 原 因 1. 2. 3. 4. 1. 2. 實驗材料不佳或量少 破壁或裂解不充分 吸附或沉淀不完全 洗滌時DNA丟失 洗滌時DNA丟失

25、 DNA 對 策 3. 4. 盡量選用新鮮（幼嫩）的材 盡量選用新鮮（幼嫩） 料 動植物要勻漿研磨充分； 動植物要勻漿研磨充分；G 菌、酵母裂解前先用生物酶 或機械方式破壁。 或機械方式破壁。高溫裂解 時，時間適當延長（對于動 時間適當延長（ 物細胞、細菌可增加PK PK的用 物細胞、細菌可增加PK的用 量）。 增加吸附的時間， 增加吸附的時間，或低溫沉 淀 小心操作 RNA提取專題 RNA提取專題第一部分： 第一部分：RNA提取方法簡介 提取方法簡介 第二部分：RNA提取及常見問題分析 第二部分： 提取及常見問題分析 分離提純RNA的目的 分離提純RNA的目的分析不同發(fā)育時期基因的表達狀況

26、獲得新基因 研究基因的拼接 分析相應的蛋白產(chǎn)物 RNA的不穩(wěn)定性 RNA的不穩(wěn)定性由于核糖殘基的2和 位置帶有羥基 位置帶有羥基， 由于核糖殘基的 和3位置帶有羥基，RNA易 易 于被RNA酶切割水解 于被 酶切割水解 RNA酶含量豐富，加熱后仍能夠正確折疊恢復 酶含量豐富， 酶含量豐富 活性， 活性，不易失活 提取RNA的注意事項 提取RNA的注意事項經(jīng)常更換新手套。 經(jīng)常更換新手套。因為皮膚和實驗室用品上可能有 RNase，會導致RNase污染。 ，會導致 污染。 污染 使用滅過菌的塑料制品和槍頭避免交叉污染。 使用滅過菌的塑料制品和槍頭避免交叉污染。 應使用不含RNase的塑料和玻璃器皿

27、。玻璃器皿可在 應使用不含 的塑料和玻璃器皿。 的塑料和玻璃器皿 150烘烤4小時，塑料器皿可在 烘烤 小時 塑料器皿可在0.5M NaOH中浸泡 小時， 中浸泡10 中浸泡 分鐘，然后用水徹底清洗，再滅菌，即可去除 分鐘，然后用水徹底清洗，再滅菌，即可去除RNase。 。 常用RNA酶抑制劑 常用RNA酶抑制劑焦磷酸二乙酯（ 焦磷酸二乙酯（DEPC）： 與RNA酶的活性基團組氨酸的咪唑環(huán)結 ）： 酶的活性基團組氨酸的咪唑環(huán)結 合使蛋白質(zhì)變性，強烈但不徹底的 合使蛋白質(zhì)變性，強烈但不徹底的RNA酶抑制劑 。 酶抑制劑 異硫氰酸胍：目前是最有效的 酶抑制劑， 異硫氰酸胍：目前是最有效的RNA酶抑

28、制劑，裂解組織的同時也使 酶抑制劑 RNA酶失活。既可破壞細胞結構使核酸從核蛋白中解離出來，又對 酶失活。既可破壞細胞結構使核酸從核蛋白中解離出來， 酶失活 RNA酶有強烈的變性作用。 酶有強烈的變性作用。 酶有強烈的變性作用 氧釩核糖核苷復合物：由氧化釩離子和核苷形成的復合物， 氧釩核糖核苷復合物：由氧化釩離子和核苷形成的復合物，它和 RNA酶結合形成過渡態(tài)類物質(zhì)，幾乎能完全抑制RNA酶的活性。 酶結合形成過渡態(tài)類物質(zhì)，幾乎能完全抑制 酶的活性。 酶結合形成過渡態(tài)類物質(zhì) 酶的活性 RNA酶的蛋白抑制劑（RNasin）：從大鼠肝或人胎盤中提取得來 酶的蛋白抑制劑（ ）：從大鼠肝或人胎盤中提取得

29、來 酶的蛋白抑制劑 ）： 的酸性糖蛋白。 酶的一種非競爭性抑制劑， 的酸性糖蛋白。RNasin是RNA酶的一種非競爭性抑制劑，可以和 是 酶的一種非競爭性抑制劑 多種RNA酶結合，使其失活。 酶結合，使其失活。 多種 酶結合 其它： 酶也有一定抑制作用。 其它：SDS、尿素、硅藻土等對 、尿素、硅藻土等對RNA酶也有一定抑制作用。 酶也有一定抑制作用 RNA提取專題 RNA提取專題第一部分： 第一部分：RNA提取方法簡介 提取方法簡介 第二部分：RNA提取及常見問題分析 第二部分： 提取及常見問題分析 RNA提取的步驟 RNA提取的步驟材料的裂解異硫氰酸胍，亞硫氫胍，巰基乙醇， 異硫氰酸胍，亞

30、硫氫胍，巰基乙醇， N-月桂肌氨酸 等。使細胞及核蛋白復 月桂肌氨酸 合物變性，釋放RNA，有效抑制核酸 合物變性，釋放 ， 酶。 苯酚，氯仿，異戊醇抽提去除雜物， 苯酚，氯仿，異戊醇抽提去除雜物， 及蛋白沉淀到有機相。 使DNA及蛋白沉淀到有機相。 及蛋白沉淀到有機相 雜質(zhì)的去除 RNA的吸附或沉淀 的吸附或沉淀 硅質(zhì)材料的吸附 或用異丙醇沉淀濃縮RNA。 或用異丙醇沉淀濃縮 。 處理的水溶解RNA 經(jīng)DEPC 處理的水溶解 材料準備及裂解 RNA的提取 的提取盡量使用新鮮材料，植物組織選取雜質(zhì)少生長較快的幼嫩部位， 盡量使用新鮮材料，植物組織選取雜質(zhì)少生長較快的幼嫩部位， 現(xiàn)取現(xiàn)提。 現(xiàn)取

31、現(xiàn)提。 組培細胞及血液應盡量離心去除培養(yǎng)液和上清，消化系統(tǒng)的組 組培細胞及血液應盡量離心去除培養(yǎng)液和上清， 織選取雜質(zhì)少的部位, 細菌和酵母需要勻漿處理。 織選取雜質(zhì)少的部位 細菌和酵母需要勻漿處理。 對不能馬上提取的樣品切成小塊后立即投入液氮冷凍， 對不能馬上提取的樣品切成小塊后立即投入液氮冷凍，或投入 專門的RNA樣品儲存液中保存。 樣品儲存液中保存。 專門的 樣品儲存液中保存 液氮研磨時不要使液氮揮發(fā)凈，隨時補充； 液氮研磨時不要使液氮揮發(fā)凈，隨時補充；加入裂解液并且徹 底而迅速地勻漿。 底而迅速地勻漿。 雜質(zhì)的抽提 RNA的提取 的提取采用有機（ 采用有機（酚/氯仿）抽提時應充分混勻

32、氯仿） 離心分離兩相時，應保證一定的轉速和時間，使蛋白質(zhì)、多糖和 離心分離兩相時，應保證一定的轉速和時間，使蛋白質(zhì)、 DNA分布到中間層和有機相中 RNA留在水相中 分布到中間層和有機相中， DNA分布到中間層和有機相中，RNA留在水相中 對脂肪含量較多的樣品注意不要吸入油質(zhì)層， 對脂肪含量較多的樣品注意不要吸入油質(zhì)層，可以再次用有機溶 劑抽提 RNA的沉淀和溶解 的沉淀和溶解 RNA的提取 的提取含RNA的水相過吸附柱，通過去蛋白液和漂洗液去除蛋白多糖 RNA的水相過吸附柱， 的水相過吸附柱 等雜質(zhì) 或使用異丙醇沉淀RNA應充分的混勻并放置10min左右離心收集 或使用異丙醇沉淀RNA應充分的混勻