三種孕激素物質(zhì)甲炔諾酮、去氫孕酮和醋酸甲羥孕酮對(duì)斑馬魚(yú)的毒理效應(yīng)

1、三種孕激素物質(zhì)甲炔諾酮、去氫孕酮和醋酸甲羥孕酮對(duì)斑馬魚(yú)的毒理效應(yīng)作為一類(lèi)荷爾蒙激素,孕激素廣泛應(yīng)用于口服避孕藥和激素替代療法中,用來(lái)避孕和治療激素引起的各類(lèi)疾病。此外,孕激素還廣泛用于養(yǎng)殖業(yè)中,促進(jìn)動(dòng)物的生長(zhǎng)和增肥作用,提高產(chǎn)量。由于污水處理廠不能完全地去除孕激素,以及人畜直接排泄和廢水直接排放導(dǎo)致受納環(huán)境中廣泛檢出多種孕激素,濃度在幾ngL^-1到幾萬(wàn)ngL^-1。孕激素?fù)碛袕?qiáng)生物活性,其對(duì)環(huán)境生物的影響引起了研究人員關(guān)注。已有研究表明孕激素有多種毒性效應(yīng),如:影響魚(yú)產(chǎn)卵量、引起生物組織損傷和改變基因轉(zhuǎn)錄

2、水平。目前研究主要集中在孕激素對(duì)生物生理生化和目標(biāo)基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)的影響,而孕激素毒理效應(yīng)機(jī)制研究較少。由于孕激素種類(lèi)繁多,化學(xué)結(jié)構(gòu)差異大,導(dǎo)致不同種類(lèi)孕激素毒理效應(yīng)有較大差異,因此,有必要進(jìn)一步開(kāi)展不同孕激素物質(zhì)的毒理效應(yīng)研究。本論文以斑馬魚(yú)為模式生物，利用基因芯片技術(shù)、熒光定量PC叱術(shù)以及組織切片等生物學(xué)手段,研究目前關(guān)注較少而環(huán)境中檢測(cè)濃度較高的三種孕激素物質(zhì)(甲炔諾酮、去氫孕酮和醋酸甲羥孕酮)的毒理效應(yīng),探討了這三種孕激素物質(zhì)對(duì)斑馬魚(yú)的分子毒理效應(yīng)機(jī)制。論文主要成果如下:1.首先研究了甲炔諾酮(Norgestrel,NGT)對(duì)成年斑馬魚(yú)性腺發(fā)育毒性機(jī)制。主要分析NGT寸成年斑馬魚(yú)轉(zhuǎn)錄組和性

3、腺發(fā)育的影響。871ngL^-1NGT暴露成年斑馬魚(yú)14天后,利用基因芯片技術(shù)富集生物過(guò)程和通路。基因芯片結(jié)果顯示，NGT暴露顯著富集大量差異表達(dá)基因。基因本體(Geneontology,GO)分析發(fā)現(xiàn),發(fā)育相關(guān)的生物過(guò)程被顯著富集包括器官發(fā)育、系統(tǒng)發(fā)育、多細(xì)胞有機(jī)體發(fā)育、單細(xì)胞有機(jī)體發(fā)育和發(fā)育過(guò)程等生物過(guò)程。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)在這些發(fā)育相關(guān)生物過(guò)程中均包含有434個(gè)差異表達(dá)基因。這434個(gè)差異表達(dá)基因是屬于器官發(fā)育生物學(xué)過(guò)程。KyotoEncyclopediaofGenesandGenomes(KEGG分析這434個(gè)差異表達(dá)基因發(fā)現(xiàn)，Notch通路富集

4、程度最顯著。因此本文以Notch通路為目標(biāo)靶通路,進(jìn)一步分析了環(huán)境濃度NGT(6.7ngL^-1、83ngL^-1和912ngL^-1)暴露成年斑馬魚(yú)14天后的毒理效應(yīng)。研究結(jié)果顯示,大多數(shù)Notch通路基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)變化和暴露濃度梯度呈正相關(guān)關(guān)系。1 .7ngL^-1環(huán)境濃度NGTg露后就能引起*$錄表達(dá)差異。NGT對(duì)Notch通路中目標(biāo)基因轉(zhuǎn)錄影響,符合notch信號(hào)通路中級(jí)聯(lián)反應(yīng)。此外,所有濃度NGTB露都顯著增加了

5、精巢中成熟精子頻率，同時(shí)在912ngL^-1濃度下也增加了卵巢中成熟卵細(xì)胞頻率。因此,環(huán)境相關(guān)濃度NGTB露可影響成年斑馬魚(yú)性腺發(fā)育。2 .論文還研究了去氫孕酮(Dydrogesterone,DDG)對(duì)成年斑馬魚(yú)毒理效應(yīng)。主要分析DDGH露(32ngL^-1、304ngL^-1和2485ngL^-1)成年斑馬魚(yú)14天后對(duì)下丘腦-垂體-性腺(hypothalamic-pituitary-gonadal,HPG)軸和Notc

6、h通路相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)以及性腺發(fā)育的影響。研究結(jié)果顯示，DDG顯著上調(diào)了at魚(yú)大腦中HPGM上游通路基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)，并影響雄魚(yú)精巢中類(lèi)固醇合成通路基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)。目標(biāo)基因gnrh2、gnrhr4、atf4b、lhb和fshb轉(zhuǎn)錄水平符合性腺通路中級(jí)聯(lián)反應(yīng)。但是,僅在高濃度(2485ngL^-1)暴露下才可顯著增加閉鎖細(xì)胞頻率，與此同時(shí)，DDG對(duì)Notch通路中相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)的影響非常小,表明DDG對(duì)斑馬魚(yú)性腺組織水平的影響很小。以上結(jié)果表明，低濃度DDGft露可以引起轉(zhuǎn)錄變化,高濃度DDGS露則會(huì)引起組織水平改變。3 .論文進(jìn)一步研究了低濃度DDG(4

7、ngL^-1、39ngL^-1和379ngL^-1)長(zhǎng)期暴露(20dayspostfertilization(dpf)至U144dpf)對(duì)斑馬魚(yú)的毒理效應(yīng)。主要分析DDG|£期暴露對(duì)斑馬魚(yú)性別分化、組織發(fā)育和內(nèi)分泌效應(yīng)的影響。長(zhǎng)期暴露結(jié)果顯示,379ngL^-1DDG顯著影響斑馬魚(yú)性別分化,導(dǎo)致產(chǎn)生更多雄魚(yú)。并且DDGl£期暴露可能通過(guò)增加dmrtl、casplb、casp3a和casp9等性別分化相

8、關(guān)基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平以及減少cyp19a1a轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平,從而影響斑馬魚(yú)性別分化。利用基因芯片技術(shù)分析了DDGfe期暴露后雄魚(yú)大腦和精巢樣品，結(jié)果顯示，在雄魚(yú)大腦中,晝夜節(jié)律相關(guān)基因在所有濃度組均被顯著富集,同時(shí)類(lèi)固醇代謝、脫氧核酸修復(fù)和花生四烯酸代謝等相關(guān)基因也被顯著富集。且這些目標(biāo)基因在雌魚(yú)大腦中轉(zhuǎn)錄表達(dá)趨勢(shì)與雄魚(yú)非常類(lèi)似。DDGT能是通過(guò)影響晝夜節(jié)律通路，從而影響下游代謝通路。芯片結(jié)果顯示，在精巢中精子發(fā)生相關(guān)生物過(guò)程(內(nèi)皮屏障和免疫應(yīng)答)在所有濃度中也被顯著富集。更為重要的是,參與調(diào)控精子成熟過(guò)程的吞噬、溶酶體和鞘脂代謝等生物通路在379ngL<sup>-1</sup&

9、gt;暴露組中被顯著富集。這些結(jié)果解釋了379ngL^-1暴露組中成熟精子數(shù)量增加的機(jī)制。在卵巢中,凋亡基因轉(zhuǎn)錄顯著上調(diào),說(shuō)明DDGSI起卵細(xì)月fi的凋亡,這個(gè)結(jié)果和卵細(xì)胞閉鎖頻率增加相吻合。同時(shí),39ngL^-1DDG暴露增加了主要組織相容性復(fù)合體I類(lèi)基因(mhclufa和mhcluea轉(zhuǎn)錄表達(dá)，組織相容性復(fù)合體I類(lèi)基因常高表達(dá)在回歸組織細(xì)胞表面,誘導(dǎo)吞噬細(xì)胞吞噬,因此閉鎖細(xì)胞可能被加速分裂和降解。以上研究結(jié)果表明，DDG后較強(qiáng)雄?素效應(yīng),對(duì)水生生物目標(biāo)基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)、生殖發(fā)育和種群動(dòng)態(tài)均具潛在的影響。4.

10、論文研究了低濃度(4.3ngL^-1、43ngL^-1和408ngL^-1)醋酸甲羥孕酮(Medroxyprogesteroneacetate,MPA)長(zhǎng)期暴露(20dpf-140dpf)對(duì)斑馬魚(yú)毒理效應(yīng)。主要分析MPAfe期暴露對(duì)斑馬魚(yú)性別分化、組織發(fā)育和內(nèi)分泌效應(yīng)的影響。長(zhǎng)期暴露結(jié)果表明，MPA有一定雄?素效應(yīng)，但是僅在43ngL^-1影響斑馬魚(yú)性別分化,導(dǎo)致產(chǎn)生較多雄魚(yú)。在35dpf,43ngL<sup>

11、;-1</sup>MPA1著增加了精巢分化關(guān)鍵基因(dmrtl)和睪酮合成重要基因(hsd17b3)轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平。在144dpf,MPA還影響雌魚(yú)和雄魚(yú)大腦中HPG由中相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)，導(dǎo)致性腺通路中級(jí)聯(lián)基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)紊亂。但是對(duì)性腺中HPG由基因影響較小。此外，MPA長(zhǎng)期暴露對(duì)斑馬魚(yú)notch通路影響較小,與組織水平結(jié)果相吻合。與DDG口NGT同在于,43ngL^-1暴露組中，MPA增加了未成熟精子細(xì)胞頻率。qPCR析顯示,43ngL^-1MPA增加了成魚(yú)精巢中精巢分化關(guān)鍵基因dmrt1轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平。因此,43ngL^-1MPA可能通過(guò)促進(jìn)dmrt1轉(zhuǎn)錄表