LCMSMS測(cè)定伊曲康唑脂質(zhì)體小鼠血漿中濃度

1、LC-MS/MS測(cè)定伊曲康唑脂質(zhì)體小鼠血漿中濃度魏華1，劉艷1，董迪1，宋笑丹2，吳琳華1*(1. 哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院藥學(xué)部；黑龍江省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱 150086；2. 哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院藥學(xué)部，哈爾濱 150001)摘要:目的建立LC-MS/MS測(cè)定小鼠血漿中伊曲康唑濃度的方法。方法以尼莫地平為內(nèi)標(biāo)，采用乙腈-水-甲酸(80：20：0.2)為流動(dòng)相，以Cl8色譜柱(Waters XTerra®MS-C18，2.1×150 mm, 3.5 µm)為分析柱，流速為0.2 mL . min-1，通過(guò)正離子電離(ESI)，以多反應(yīng)離子監(jiān)測(cè)(MRM

2、)方式進(jìn)行正離子檢測(cè)。用于定量分析的離子反應(yīng)分別為m/z 705.3m/z 392.1(伊曲康唑)和m/z 419.3m/z 343.3(內(nèi)標(biāo)，尼莫地平)。結(jié)果測(cè)定血漿中伊曲康唑的線性范圍為10-1280 ng . mL-1，定量下限為10.00 ng . mL-1。日內(nèi)、日間精密度(RSD)小于10%，回收率大于90%。結(jié)論 本方法專屬性強(qiáng)、靈敏度高、操作簡(jiǎn)便、適用于伊曲康唑脂質(zhì)體在小鼠體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)研究。關(guān)鍵詞:伊曲康唑；液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法；脂質(zhì)體；血漿藥物濃度LC-MS/MS Determination of Itraconazole Liposome in Mice PlasmaWE

3、I Hua1, LIU Yan, DONG Di1, SONG Xiao-dan2, WU Lin-hua1* (1. Department of Pharmacy, the Second Affiliated Hospital of Harbin Medical University, Key Laboratory of College in Heilongjiang Province, Harbin 150086, China; 2. Department of Pharmacy, the First Affiliated Hospital of Harbin Medical Univer

4、sity, Harbin 150001, China)ABSTRACT: OBJECTIVE To establish a LC-MS/MS method for the determination of itraconazole in mice plasma. METHODS Nimodipine was used as the internal standard. Itraconazole was separated using a Cl8 column（Waters XTerra®MS-C18，2.1×150 mm, 3.5 µm).The mobile p

5、hase consisted of acetonitrile-water-formic acid（80:20:0.2,v/v/v）, at a flow-rate of 0.20 mL·min-1. Waters Micromass Quattro API tandem mass spectrometer equipped with electrospray ionization source (ESI) was used as detector operated in the positive ion mode. multiple reaction monitoring (MRM)

6、 with the precursor to product ion combinations of m/z 705.3m/z 392.1 and m/z 419.3m/z 343.3 were performed to quantify itraconazole and the internal standard(nimodipine), respectively. RESULTS The linear calibration curves were obtained in the concentration range of 10-1280 ng·mL-1 .The lowest

7、 limit of quantification was 10.0 ng·mL-1 . The inter-and intra-day precision（RSD）was less than 10% .The average recoveries were above 90% . CONCLUSION The method was proved to be sensitive, rapid, convenient and suitable for pharmacokinetics of itraconazole liposome in mice.KEY WORDS： itracona

8、zole; liquid chromatography-tandem mass spectrometry; liposome；plasma concentration伊曲康唑(itraconazole , ITR)是三唑類衍生物，對(duì)念珠菌屬及酵母菌、霉菌、皮膚癬菌和其他治病真菌具有光譜抗真菌活性。通過(guò)干擾真菌細(xì)胞膜中麥角甾醇的合成，最終導(dǎo)致真菌膜的通透性變異，而產(chǎn)生抗真菌活性1。已上市的伊曲康唑注射液，主要用于深部真菌感染2，但是其輔料羥丙基-環(huán)糊精，是通過(guò)腎小球過(guò)濾排泄，具有腎毒性3。將伊曲康唑制成脂質(zhì)體的劑型，可以更好地發(fā)揮其疏水性，減少用藥劑量，提高其生物利用度，提高伊曲康唑在靶器官的濃

9、度4，從而降低心臟、腎臟毒性。本實(shí)驗(yàn)采用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法，測(cè)定小鼠血漿中伊曲康唑濃度，操作簡(jiǎn)便、快速、靈敏度高、專屬性強(qiáng)，可用于伊曲康唑脂質(zhì)體小鼠體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)研究。1 儀器與試藥1.1儀器Waters2695高效液相色譜系統(tǒng)；Waters Micromass Quattro API 三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀；Mass lynx 4.0數(shù)據(jù)工作站；HH-1型旋渦混合器 (天津市富蘭斯電子科貿(mào)有限公司); LD4-2型低速離心機(jī)(北京醫(yī)用離心機(jī)廠)。 1.2試藥 伊曲康唑?qū)φ掌?中國(guó)藥品生物制品檢定所，含量99.3%，批號(hào)：200401)；伊曲康唑脂質(zhì)體(本實(shí)驗(yàn)室自制)；尼莫地平(內(nèi)標(biāo)，中國(guó)藥品

10、生物制品檢定所，批號(hào)：200501)；甲酸、乙腈(色譜純，山東禹王實(shí)業(yè)有限公司)；其它試劑均為分析純，水為超純水。1.3動(dòng)物 昆明種小鼠，雄性，體重(20±2) (哈爾濱醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)。2 實(shí)驗(yàn)方法2.1 色譜條件 采用Waters Cl8色譜柱(XTerra®MS-C18，2.1×150 mm，3.5 µm)；流動(dòng)相為乙腈-水-甲酸(80：20：0.2)，流速為0.2 mL . min-1，進(jìn)樣量為10 µL，柱溫30 。2.2 質(zhì)譜條件離子源為ESI源(電噴霧電離源)；電噴霧電壓為3.6 kv；錐孔電壓為50V；碰撞室電壓為40 V

11、；脫溶劑氣溫度為300；脫溶劑氣(N2)速為500 L·hr-1；正離子方式檢測(cè)；掃描方式為多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)，用于定量分析的離子反應(yīng)分別為m/z 705.3m/z 392.1(伊曲康唑)和m/z 419.3m/z 343.3(內(nèi)標(biāo)，尼莫地平)；掃描時(shí)間為0.3 s。2.3 血漿樣品處理取血漿樣品100 µL，置于1.5 mL聚丙烯試管中，分別加入甲醇25 µL、內(nèi)標(biāo)溶液(400 ng . mL-1尼莫地平甲醇液)25 µL和乙腈400 µL，渦旋5 min，14 000 r . min-1離心15 min，分取上清液，0.45µm

12、濾膜過(guò)濾，取10 µL進(jìn)行LC-MS/MS分析。2.4 質(zhì)譜分析伊曲康唑和內(nèi)標(biāo)尼莫地平在電噴霧電離方式下，(一級(jí))全掃描質(zhì)譜主要生成M+H+ 準(zhǔn)分子離子峰，分別為m/z 705.3和m/z 419.3。對(duì)準(zhǔn)分子離子峰M+H+進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜分析，生成的較穩(wěn)定的主要碎片離子分別為m/z 392.1和m/z 343.3，并將其作為定量分析時(shí)監(jiān)測(cè)的產(chǎn)物離子。3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果3.1 方法的專屬性取空白血漿樣品100 µL，置于1.5 mL聚丙烯試管中，加入乙腈400 µL，按“2.3”項(xiàng)下操作，進(jìn)樣10 µL，記錄色譜圖；將一定濃度的伊曲康唑標(biāo)準(zhǔn)液加入到空白血漿中，依同

13、法操作，記錄色譜圖；待測(cè)藥物伊曲康唑的保留時(shí)間為3.93 min，內(nèi)標(biāo)尼莫地平的保留時(shí)間為3.41 min；取健康小鼠給藥后收集的血漿樣品，同法操作，記錄色譜圖。結(jié)果表明，空白血漿中的內(nèi)源性物質(zhì)不干擾伊曲康唑及內(nèi)標(biāo)物的測(cè)定。圖1 小鼠血漿中伊曲康唑及內(nèi)標(biāo)尼莫地平的典型MRM色譜圖A,D-空白血漿；B,E-空白血漿加入伊曲康唑及內(nèi)標(biāo)；C,F-受試小鼠尾靜脈注射伊曲康唑脂質(zhì)體6 h后血漿樣品；1-伊曲康唑；2-尼莫地平(內(nèi)標(biāo))Fig1 Typical chromatogram of itraconazole and the nimodipine (internal standard, IS) in

14、 mice plasma by the multiple reaction monitoring (MRM) scan modeA,D-blank plasma; B,E-blank spiked with itraconazole and internal standard; C,F- plasma sample 6 h after an iv administration itraconazole liposome and itraconazole injection in mice; 1-itraconazole; 2- nimodipine(internal standard)3.2

15、線性范圍及檢測(cè)靈敏度取空白血漿100 µL，依次加入伊曲康唑標(biāo)準(zhǔn)系列溶液25 µL(用甲醇配制成400g.mL-1的儲(chǔ)備液，按一定比例稀釋成標(biāo)準(zhǔn)系列溶液)配制成相當(dāng)于伊曲康唑血漿濃度為10.0， 20.0，40.0，80.0，160.0，320.0，640.0，1280.0 ng . mL-1 的血漿樣品)，按“2.3”項(xiàng)下操作，進(jìn)樣10 µL，記錄色譜圖；以待測(cè)藥物濃度X(ng . mL-1)為橫坐標(biāo)，待測(cè)藥物與內(nèi)標(biāo)的峰面積比Y為縱坐標(biāo)，用加權(quán)(w = 1/X2)最小二乘法進(jìn)行回歸計(jì)算，求得的直線回歸方程為：Y = 3.764×10-3 X +2.79

16、2×10-2 (r = 0.9975)。結(jié)果表明，伊曲康唑血漿濃度在10.0 1280.0 ng . mL-1內(nèi)，質(zhì)譜響應(yīng)的線性關(guān)系良好，最低檢測(cè)限為10.0 ng . mL-1。3.3 日內(nèi)與日間精密度及方法回收率取空白血漿100 µL，按“3.2”項(xiàng)下制備伊曲康唑低、中、高3個(gè)濃度(分別為10.0，160.0，1280.0 ng . mL-1)的質(zhì)量控制(QC)樣品，每一濃度進(jìn)行5樣本分析，連續(xù)進(jìn)行5 d，并與標(biāo)準(zhǔn)曲線同時(shí)測(cè)定，以當(dāng)日的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算QC樣品的濃度，將QC樣品的結(jié)果進(jìn)行分析，求算本法的回收率與精密度，結(jié)果見(jiàn)表1。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，日內(nèi)、日間精密度(RSD)均小

17、于10.0%，方法回收率良好。表1 測(cè)定方法的準(zhǔn)確度和精密度(n=5)Tab 1 Accuracy and precision (n=5)加入濃度 /ng . mL-1測(cè)得濃度/ng . mL-1RSD/%方法回收率/%日內(nèi)日間 10.0 9.169.797.7591.63160.0157.683.676.2298.561280.01269.212.014.7299.163.4 穩(wěn)定性考察3.4.1 冰凍穩(wěn)定性 按“3.2”項(xiàng)下制備備伊曲康唑低、中、高3個(gè)濃度(分別為10.0，160.0，1280.0 ng . mL-1)的樣品，置冰箱中分別冷凍保存15，30 d后取出化凍，按“2.3”項(xiàng)下操

18、作測(cè)定，并將結(jié)果與0 d結(jié)果進(jìn)行比較。結(jié)果表明，伊曲康唑血漿樣品在冰凍15 d及30 d條件下穩(wěn)定，測(cè)定結(jié)果的RSD分別為2.73%，6.54%，7.92%。3.4.2 溶液穩(wěn)定性 對(duì)伊曲康唑血漿樣品經(jīng)蛋白沉淀處理后，低、中、高3個(gè)濃度（10.0，160.0，1280.0 ng . mL-1）的溶液常溫放置的穩(wěn)定性進(jìn)行考察，結(jié)果表明處理后的伊曲康唑血漿樣品在常溫放置4h,10h,24 h穩(wěn)定，測(cè)定結(jié)果的RSD分別為5.35%，3.72%，8.17%。3.5 分析方法在藥代動(dòng)力學(xué)研究中的應(yīng)用昆明種雄性小鼠36只，隨機(jī)分為6組，每組6只。設(shè)10 min，30 min，2 h，4 h，8 h，12

19、h，6個(gè)時(shí)間點(diǎn)，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)含伊曲康唑脂質(zhì)體和注射液各1組，按10 mg · kg-1的劑量小鼠尾靜脈注射給藥，給藥后于不同時(shí)間點(diǎn)眼眶取血，全血置肝素化離心管中，3000 r · min-1離心10 min得血漿，-20 低溫保存?zhèn)溆?。按?.3”項(xiàng)下方法操作，進(jìn)行LC-MS/MS測(cè)定，記錄色譜圖。以當(dāng)日的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算個(gè)時(shí)間點(diǎn)的血藥濃度，同時(shí)制備高、中、低3個(gè)濃度的質(zhì)控血漿（同“3.2”項(xiàng)），每個(gè)濃度各三份，測(cè)得藥時(shí)曲線見(jiàn)圖2。 圖2 36只小鼠10 mg · kg-1尾靜脈注射伊曲康唑脂質(zhì)體后的血藥濃度參比制劑； 受試制劑Fig 2 Plasma concentr

20、ation-time curve of 36 mice after an iv administration itraconazole liposome reference formulation; test formulation4 討論4.1 生物樣品常用的預(yù)處理方法有固相萃取法（SPE），液-液萃取法（LLE）等。固相萃取、液-液萃取法成本高、使用溶劑量大、提取步驟復(fù)雜、費(fèi)時(shí)。藥物代謝動(dòng)力學(xué)研究本身樣品數(shù)多，樣品分析的時(shí)間越短越好。本實(shí)驗(yàn)采用乙腈沉蛋白的方法處理生物樣品，操作簡(jiǎn)便，與所選用流動(dòng)相一致，提取回收率高，精密度好，且成本較低。本實(shí)驗(yàn)還分別考察了200 µL乙腈 、40

21、0 µL乙腈、600 µL乙腈沉蛋白效果，結(jié)果發(fā)現(xiàn)加入200 µL乙腈時(shí)蛋白沉淀不完全，加入400 µL 和600 µL乙腈時(shí)蛋白沉淀效果一樣，但是加入600 µL乙腈沉蛋白時(shí)樣品被稀釋的倍數(shù)太大。本實(shí)驗(yàn)最終選擇400 µL乙腈沉?xí)r沉，沉淀蛋白效果好，提取回收率高，而且峰形較好。4.2 文獻(xiàn)報(bào)道5-9測(cè)定生物樣品中伊曲康唑大多用高效液相色譜-熒光檢測(cè)法或紫外檢測(cè)法，但測(cè)試時(shí)間長(zhǎng)，而且由于生物樣品內(nèi)源性物質(zhì)的干擾，均需通過(guò)液-液或液-固萃取、濃縮，樣品預(yù)處理繁瑣。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用LC-MS/MS法，通過(guò)優(yōu)化條件，選用分離度高的Cl8

22、短柱（2.1×150 mm, 3.5 µm），樣品只需要100 µL，并以專屬性更好的二級(jí)MS檢測(cè)樣品，分析時(shí)間短，每一樣品只需要4.5 min。生物樣品預(yù)處理采用直接沉淀蛋白法，上清不需要濃縮，節(jié)省了樣品預(yù)處理時(shí)間。4.3 由于采用正離子檢測(cè)、沉淀蛋白法處理樣品，因此在流動(dòng)相中加入了少量甲酸，減少由于蛋白帶來(lái)的電離抑制，從而提高了靈敏度，結(jié)果良好。4.4 該法靈敏度高，專屬性強(qiáng)，具有良好精密度和準(zhǔn)確度，分析時(shí)間短，所需樣品用量少，適合于伊曲康唑體脂質(zhì)體小鼠體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)研究。REFERENCES1 Karel DB, Jef VG. Pharmacology o

23、f itraconazoleJ. Drugs, 2001, 61(Suppl 1):S27 - S37.2 CAI Yong-ning, Liang de-rong.Efficacy and safety of itraconazole injection in treatmeat of deep fungal infecfionsJ. Chinese Journal of New Drugs (中國(guó)新藥雜志), 2004，13（2）：161-163.3 Walsh PM.Physicians desk referenceM.57ed.Montvale NJ:Thomson PDR, 2003.1794- 17974 DONG D, LIU H M, SONG X D. Chin J Pharm Anal(藥物分析雜志), 2007, 27 (9) :1453-1455.5 CHEN L J. Determination of itraconazole in human plasma by HPLC J. West China J Pharm Sci(華西藥學(xué)雜志),2006,21