USP 色譜法 中文譯稿

1、<621>色譜法介紹色譜分離技術(shù)是通過樣品組分在固定相和流動(dòng)相兩相中的分布差異進(jìn)行分離的技術(shù)。其中固定相可以是固體、有固相支持的液體或凝膠。 固定相可以填充于柱、分散成層、分布為膜或者應(yīng)用于其他技術(shù)中。流動(dòng)相可以為氣態(tài)、液態(tài)或超臨界流體。分離可以基于吸附性、質(zhì)量分布（分配）或離子交換，也可以基于分子物理化學(xué)性質(zhì)的差異，如大小、質(zhì)量和體積。本章節(jié)包括了基本步驟、定義和對(duì)一般參數(shù)的計(jì)算并描述了對(duì)于系統(tǒng)適應(yīng)性的基本要求。在USP中應(yīng)用于定量和定性分析的色譜方法類型有柱色譜法、氣象色譜法、紙色譜法、薄層色譜法（包括高效薄層色譜）和加壓液相色譜法（一般稱作高壓或高效液相色譜）?；静襟E本部分

2、描述了使用某種色譜方法的基本步驟。除另有各論規(guī)定外，以下色譜分離方法的步驟將會(huì)被遵循。紙色譜法固定相：固定相為一張適當(dāng)質(zhì)地和厚度的紙。色譜圖的形成過程可以是上行的，這樣溶劑被毛細(xì)管作用力支撐著沿著紙向上，這個(gè)過程也可以是下行的，在此情況下溶劑流動(dòng)也受到重力的影響。與溶劑流動(dòng)有關(guān)的紙張紋理定向應(yīng)該在一系列色譜圖中保持恒定。（纖維方向通常由制造商在色譜紙的包裝上標(biāo)出。）儀器：紙色譜法的必備儀器包括裝有添加溶劑的入口的氣密室和短于該室內(nèi)部高度5cm的耐腐蝕材料支架。該支架作為用于溶劑槽以及用于抗虹吸棒的支撐，這些抗虹吸棒依次撐起色譜紙。氣密室的底部以規(guī)定的容積系統(tǒng)或流動(dòng)相覆蓋。使用以規(guī)定溶劑系統(tǒng)潤(rùn)濕

3、的紙張襯托于氣密室的內(nèi)壁，以增加氣密室的溶劑蒸汽飽和度。斑點(diǎn)：將待分析的一個(gè)或多個(gè)物質(zhì)溶解于適當(dāng)溶劑中。以微量吸管吸取適當(dāng)體積的溶液，其中通常含有1-20µg該化合物，點(diǎn)樣為6-10mm大小斑點(diǎn)且斑點(diǎn)間的間隔不小于3cm。下行色譜法步驟1. 帶斑點(diǎn)的色譜紙以抗虹吸棒懸掛在氣密室內(nèi)，該棒將該色譜紙的上端固定在溶劑槽中。（注：確保色譜紙掛在抗虹吸棒下的部分自由的懸掛在氣密室中，沒有接觸到支架、室壁或室內(nèi)的液體。2. 氣密室被密閉，以便使該室與色譜紙達(dá)到溶劑蒸汽平衡（飽和）釋放任何多余壓力。3. 在氣密室平衡后，將配制好的流動(dòng)相溶劑通過入口添加到溶劑槽中。4. 關(guān)閉入口，且讓流動(dòng)溶劑相沿著

4、色譜紙向下行進(jìn)需要的距離。5. 從氣密室內(nèi)取出色譜紙。6. 迅速標(biāo)注溶劑前沿的位置，并干燥色譜紙。7. 直接或用適當(dāng)措施顯示被分離出來的一個(gè)或多個(gè)藥物的斑點(diǎn)位置之后，觀察并測(cè)量該色譜圖。上行色譜法步驟1. 將流動(dòng)相加入氣密室底部。2. 氣密室被密閉，以便使該室與色譜紙達(dá)到溶劑蒸汽平衡（飽和）。在需要時(shí)，釋放任何多余壓力。3. 固定相的下邊緣浸入到流動(dòng)相中以使其通過毛細(xì)管作用力支撐著沿著色譜紙向上。4. 當(dāng)溶劑到達(dá)預(yù)先設(shè)定的高度時(shí)，打開氣密室，取出色譜紙，迅速標(biāo)注溶劑前端的位置，并干燥色譜紙。5. 直接或用適當(dāng)措施顯示被分離出來的一個(gè)或多個(gè)藥物的斑點(diǎn)位置之后，觀察并測(cè)量該色譜圖。薄層色譜法固定相

5、：是相當(dāng)薄的均勻涂層，以干燥、細(xì)粉狀物料涂于玻璃、塑料、或金屬薄片或薄板（通常統(tǒng)稱為薄板）。薄層色譜板的固定相的平均粒子尺寸為1015µm，而高效薄層色譜板為5µm。如果在各論中有相關(guān)規(guī)定，則可以使用帶有預(yù)吸附區(qū)域的市售薄板。樣品點(diǎn)于預(yù)吸附區(qū)域應(yīng)在預(yù)吸附吸附劑表面上形成的尖銳、狹窄的區(qū)間。分離的實(shí)現(xiàn)是基于吸附性、分配或雙方的結(jié)合效率依賴于固定相的特殊性。儀器：色譜室需由惰性、透明物質(zhì)構(gòu)成的，并符合以下標(biāo)準(zhǔn)：平底或雙槽，能蓋嚴(yán)密的蓋子和適于薄板的尺寸。將色譜室內(nèi)至少一側(cè)內(nèi)壁襯以濾紙。將相對(duì)色譜室大小而言足夠量的流動(dòng)相倒入該室，以便在加入濾紙之后在能合適于薄板大小的深度。為了飽

6、和色譜室，蓋上蓋子，并使該系統(tǒng)達(dá)到平衡。（注：除另有規(guī)定，色譜分離都需要在飽和的色譜室內(nèi)進(jìn)行）。檢測(cè)：適用于在短波（254nm）和長(zhǎng)波（365nm）下觀察的紫外光源以及能使斑點(diǎn)顯現(xiàn)的一系列試劑。斑點(diǎn)：使用規(guī)定體積的供試溶液和標(biāo)準(zhǔn)溶液，分成足夠多的小份進(jìn)行點(diǎn)樣，以得到直徑2-5mm（在高效薄層色譜板上為1-2mm）的圓形斑點(diǎn)或者10-20mm × 1-2mm（在高效薄層色譜板上為5-10mm × 0.5-1mm）帶狀斑，并與下邊緣和薄板的側(cè)面保持適當(dāng)距離?！咀ⅲ涸谏V過程中，點(diǎn)樣位置必須在展開溶劑水平面至少3mm（高效薄層色譜法）至5mm（薄層色譜法）以上?！繉⑦@些溶液點(diǎn)在平

7、行于該薄板下邊緣的直線上，并且斑點(diǎn)的中心之間距離至少10mm（在高效薄層色譜板上5mm）或者帶狀斑邊緣之間的距離至少4mm（在高效薄層色譜板上2mm），并待其變干。步驟：1. 將薄板放入色譜室內(nèi)，確保斑點(diǎn)或帶狀斑在流動(dòng)相的表面之上。2. 關(guān)閉色譜室。3. 允許流動(dòng)相上行至薄板的四分之三位置處或在各論中規(guī)定的距離。4. 取出薄板，用鉛筆標(biāo)注溶液前行所至的位置并干燥薄板。5. 按規(guī)定將色譜顯色。6. 確定基本斑點(diǎn)或區(qū)域的比移值（RF）。7. 推定鑒別能夠這樣實(shí)現(xiàn)，分別使用未知樣品和標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)樣品在同一塊薄板上進(jìn)行層析，并觀察所得結(jié)果中RF值完全相同且大小大致相等的斑點(diǎn)或區(qū)域。對(duì)于斑點(diǎn)或區(qū)域的大小或亮

8、度可視性比較可用于半定量估測(cè)。用于薄板上直接定量測(cè)量的儀器是一個(gè)光密度計(jì)（吸收率或熒光測(cè)定）。柱色譜法固相載體：純硅質(zhì)土用作普通分離。硅烷化的色譜純硅質(zhì)土用作反相分配色譜法分離。固定相：載體通過添加各論中規(guī)定的固定相做出修改。如果液體混合物要用作固定相，應(yīng)在加入載體物前要預(yù)先混合好。流動(dòng)相：流動(dòng)相在各論中分別進(jìn)行規(guī)定。如果固定相是一種水溶液，用水使其平衡。如果固定相是一種極性有機(jī)液體，用該液體使其平衡。儀器：除非在具體各論中另有規(guī)定，色譜柱的內(nèi)徑為約22毫米，長(zhǎng)度為200至300毫米。附內(nèi)徑約4毫米、長(zhǎng)度約50毫米、不帶旋塞的導(dǎo)管。儀器準(zhǔn)備： 將一縷玻璃棉填充在色譜柱底部。將規(guī)定體積的固定相與

9、指定數(shù)量的載體相混合成一個(gè)均質(zhì)、蓬松的混合物。轉(zhuǎn)移該混合物至色譜柱，并用輕柔壓力搗實(shí)，以獲得一個(gè)均勻結(jié)塊。如果指定數(shù)量的載體多于3克，將此混合物以約2克每份轉(zhuǎn)移至色譜柱，并搗實(shí)每個(gè)部分。如果定量測(cè)定或檢驗(yàn)需要每段指定不同的固定相的多段柱，則在加入并搗實(shí)一段后，直接在此前的段上加入下一個(gè)連續(xù)部分。將一縷玻璃棉填充在裝好的色譜柱上?！咀ⅲ毫鲃?dòng)相適度地流過，或者在反相色譜法中緩慢滴過一個(gè)適當(dāng)填充柱。】如果被分析物的溶液被混合到固定相中，使用約1克載體和若干滴用于配制供試溶液的溶劑組成的混合物來擦洗用于制備供試混合物的燒杯，以完成向色譜柱的定量轉(zhuǎn)移。將一團(tuán)細(xì)玻璃棉裝填在已裝柱的柱填料上。步驟：1. 將

10、流動(dòng)相轉(zhuǎn)移至柱內(nèi)置于柱填料上面，并使其在重力影響下沿柱流下。2. 在每次變更流動(dòng)相組成之前和洗脫完成之后，以約1毫升流動(dòng)相沖洗色譜柱頂端。3. 如果被分析物作為在流動(dòng)相中的溶液被加入到色譜柱中，則使其徹底滲入柱填料中，然后在加入大量流動(dòng)相之前，加入若干小份流動(dòng)相，使每一份徹底滲下去。4. 如定量測(cè)定或檢驗(yàn)需要使用連續(xù)安裝的多重色譜柱并且已規(guī)定流動(dòng)相分成幾份加入，則讓每一份徹底滲入每個(gè)色譜柱，并在加入后續(xù)部分之前以流動(dòng)相沖洗每個(gè)色譜柱頂部。氣象色譜法液體固定相：此類型的固定相可見于填充柱或毛細(xì)管柱中。氣象填充柱：在填充柱中，液體相置于一種精細(xì)分割的惰性載體上，例如硅藻土、多孔聚合物、石墨化碳，而

11、該載體裝填到通常內(nèi)徑2至4毫米、長(zhǎng)度1至3米的色譜柱中。氣象毛細(xì)管柱：在毛細(xì)管柱中，此類色譜柱不含填料，液體相涂于色譜柱的內(nèi)表面上并且可能用化學(xué)鍵合于其上。固體固定相：此類型固定相僅適用于填充柱。在此類型的柱中，固體相是填充于色譜柱中的一種活性吸附劑，如鋁、硅或碳。聚芳烴多孔樹脂，時(shí)常用于填充柱中，不涂布液相。（注：填充柱和毛細(xì)管柱在使用前要調(diào)整至基線和其他性質(zhì)穩(wěn)定。色譜柱和填充材料的供應(yīng)商要對(duì)建議的調(diào)整步驟提供介紹。）儀器：氣相色譜儀包含載氣源、氣化室、色譜柱、檢測(cè)器和記錄設(shè)備。氣化室、色譜柱、檢測(cè)器都是溫度受控的，且溫度的變動(dòng)亦作為分析的一部分。常見載氣有氦氣、氮?dú)?、或氫氣，根?jù)使用的色譜

12、柱和檢測(cè)器進(jìn)行選擇。檢測(cè)器輸出的數(shù)據(jù)記錄為時(shí)間函數(shù)，并且設(shè)備的響應(yīng)值，以峰面積或峰高來衡量，是其數(shù)量的函數(shù)。溫度程序：氣象色譜分離的長(zhǎng)度和質(zhì)量可以由改變色譜柱的柱溫來進(jìn)行控制。當(dāng)需要設(shè)置溫度程序時(shí)，另有各論會(huì)對(duì)條件以表格的形式進(jìn)行規(guī)定。表格中規(guī)定了起始溫度，溫度變化速率，最終溫度和最終溫度的保留時(shí)間。步驟：1. 用流動(dòng)的載氣平衡色譜柱、進(jìn)樣器和檢測(cè)器直至獲得恒定的信號(hào)。2. 通過進(jìn)樣膜或自動(dòng)進(jìn)樣器進(jìn)一份樣品。3. 開啟溫度程序。4. 記錄色譜。5. 按各論規(guī)定進(jìn)行分析。液相色譜法此綱要中所應(yīng)用的液相色譜法等同于高壓液相色譜和高效液相色譜。液相色譜法是一種基于固體固定相和液體流動(dòng)相的分離技術(shù)。固

13、定相：分離的實(shí)現(xiàn)通過分配、吸收或離子交換，取決于所用的固定相。最常用的固定相是改造硅膠或聚合物顆粒。顆粒通過加入長(zhǎng)鏈碳?xì)浠衔镞M(jìn)行改造。為完成分析而進(jìn)行的特殊的填充類型，需要按照各論中的指示 “L”（見下色譜柱 部分）。顆粒的大小通常也在各論中進(jìn)行規(guī)定。填充類型和大小的變化在本章節(jié)的系統(tǒng)適用性 部分也進(jìn)行了描述。色譜柱：色譜柱包括填充了固定相的不銹鋼柱、線性的不銹鋼柱和聚合物柱。色譜柱的長(zhǎng)度和內(nèi)徑影響著分離程度，因此柱子的大小在各論中分別有規(guī)定。柱子大小的變化在本章的系統(tǒng)適用性 部分也作了相關(guān)討論。綱要中不再包括色譜柱的名稱；此處省略以避免出現(xiàn)對(duì)供應(yīng)商的產(chǎn)品名及產(chǎn)地的變化的認(rèn)可。詳見色譜柱 部

14、分。流動(dòng)相：流動(dòng)相為溶劑或溶劑混合物，在各論中均有所規(guī)定。儀器：液相色譜儀由裝有流動(dòng)相的貯液器、以高壓推動(dòng)流動(dòng)相通過系統(tǒng)的泵、將樣品注入到流動(dòng)相的進(jìn)樣器、色譜柱、檢測(cè)器和數(shù)據(jù)采集裝置。梯度洗脫：在色譜儀器運(yùn)行過程中持續(xù)改變?nèi)軇┙M成的方法被稱為梯度洗脫或溶劑程序化。梯度洗脫通常以表格的形式在各論中進(jìn)行規(guī)定，其中包括運(yùn)行時(shí)間和流動(dòng)相在不同時(shí)間的成分比例。步驟：1. 使用流動(dòng)相在特定的流速下平衡色譜柱和檢測(cè)器直至得到恒定的信號(hào)。2. 通過進(jìn)樣器或使用自動(dòng)進(jìn)樣器進(jìn)樣。3. 啟動(dòng)梯度程序。4. 記錄色譜。5. 按各論進(jìn)行分析。色譜柱用于USP-NF檢測(cè)中的填料（L）、相（G）、載體（S）的完整清單位于試

15、劑、指示劑、溶液 部分中的色譜試劑 項(xiàng)下。此清單是為了方便色譜操作者參考，以識(shí)別在具體各論中規(guī)定的相關(guān)色譜試劑。色譜相關(guān)定義和解釋色譜圖：一張色譜圖是用圖示的形式展現(xiàn)了檢測(cè)器的響應(yīng)、流出物中的待分析物的濃度或用以定量測(cè)定流出物濃度或與之相對(duì)應(yīng)的流出體積或時(shí)間。在平面色譜法中，色譜圖參考紙或薄層的不同區(qū)域。圖1代表了兩種物質(zhì)（物質(zhì)1和2）的典型色譜分離，其中t1和t2是各自的保留時(shí)間，h、h/2、和Wh/2分別是峰1的峰高、半峰高、半峰寬。W1和W2分別是峰1和2的峰寬。各空氣峰是氣相色譜圖的一個(gè)特征，就像在液相色譜法中的前面的溶劑峰一樣。這些未保留組分的保留時(shí)間被指定為tM。圖一.兩種物質(zhì)的分

16、離色譜圖滯后體積(D)：（也作梯度延遲體積）指洗脫物出現(xiàn)的點(diǎn)到柱頭這一段的體積。死時(shí)間(tM)：死時(shí)間指不被固定相吸附的組分洗脫出來所需的時(shí)間（見圖1，以空氣峰或不吸附物峰的形式，在基線上以min為單位）。死體積(VM)：死體積指不被固定相吸附的組分洗脫出來所需的流動(dòng)相的體積。它可以由死時(shí)間和流速來計(jì)算，以mm/min為單位：VM = tM × F在分子排阻色譜法中，用符號(hào)V0 表示。理論塔板數(shù)(N): 理論塔板數(shù)N是柱效的衡量方法。對(duì)于高斯峰，通過此公式來計(jì)算：N=16(tR/W)2其中，tR是該物質(zhì)的保留時(shí)間，而W是此峰在其基線處的峰寬，由該峰對(duì)于基線相對(duì)延伸的直線而獲得。N的數(shù)

17、值取決于待色譜分析的物質(zhì)以及操作條件，例如流動(dòng)相或載氣流速和溫度、填料的性質(zhì)、填料在色譜柱內(nèi)的均勻程度，以及對(duì)于毛細(xì)管柱，固定相薄膜的厚度、色譜柱的內(nèi)徑和長(zhǎng)度。當(dāng)使用了電子積分儀時(shí)，它可能以此方程式方便的測(cè)定理論塔板數(shù)：N=5.54(tR/Wh/2)2其中，Wh/2是半峰高處的峰寬度，直接得自電子積分儀。但是，當(dāng)有爭(zhēng)議時(shí)，將只使用基于基線處的峰寬度的方程式。峰：當(dāng)一種組分從色譜柱中洗脫出來時(shí)檢測(cè)器產(chǎn)生的響應(yīng)的部分色譜記錄。若分離不完全，兩種或多種成分可能會(huì)洗脫產(chǎn)生一個(gè)未分離的色譜峰。峰谷比（p/v）：峰谷比用于當(dāng)分離兩峰的基線無法得到時(shí)，作為在相關(guān)物質(zhì)的測(cè)定時(shí)的系統(tǒng)適用性參數(shù)，圖2代表了兩物質(zhì)

18、部分分離，其中Hp是小峰距離基線的高度，Hv是大峰和小峰分離的最低點(diǎn)距離基線的高度：p/v=Hp/HvHpHv圖2 峰谷比相對(duì)比移值（Rret）: 相對(duì)比移值是同一時(shí)間內(nèi)待分析物移動(dòng)的距離和參照物移動(dòng)的距離之比，通常用于平面色譜法中。Rret = b/c流動(dòng)相前沿樣品斑參考斑起始點(diǎn)（線）abc圖3 薄層色譜典型圖示相對(duì)保留值（r）：一種組分和作為參照的另一種組分在特定條件下的調(diào)整保留時(shí)間之比：r = tR2-tM/tR1-tM其中tR2是待測(cè)物從進(jìn)樣起的保留時(shí)間；tR1是參照物從進(jìn)樣起的保留時(shí)間；tM是過程中不被吸附的物質(zhì)的保留時(shí)間，所有值均在同一色譜柱相同實(shí)驗(yàn)條件下所得。相對(duì)保留時(shí)間（RRT

19、）: 也作不可調(diào)節(jié)的相對(duì)保留值。在美國(guó)藥典中，通常以不可調(diào)節(jié)的相對(duì)保留值來作對(duì)比，除非有特別的規(guī)定。RRT=tR2/ tR1符號(hào)rG也用于指定不可調(diào)節(jié)的相對(duì)保留值。相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差:%RSD = 比移值(RF): 比移值是平面色譜中于從原點(diǎn)到區(qū)域中心的距離除以從原點(diǎn)到流動(dòng)相的的距離的比值。見圖3：RF = b/a保留因子(k) : 保留因子也作容量因子（k），定義為：k = 或k = 一種組分的容量因子可由色譜圖來計(jì)算：k=( tR- tM )/ tM保留時(shí)間（tR）：在液相色譜和氣象色譜中，保留時(shí)間tR定義為樣品從進(jìn)樣到洗脫區(qū)域出現(xiàn)最大峰響應(yīng)的時(shí)間。tR可用作物質(zhì)鑒別的參數(shù)。色譜保留時(shí)間是它們所

20、代表的物質(zhì)的特征，但是并非獨(dú)一無二。供試物質(zhì)與標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)保留時(shí)間重合可以用作鑒別概況中的一個(gè)特征，但是僅此不足以確立其鑒別。有些物質(zhì)的絕對(duì)保留時(shí)間在每個(gè)色譜圖上都不相同。保留體積（VR）：保留體積是洗脫一種組分所用的流動(dòng)相的體積。它可以通過保留時(shí)間和流速進(jìn)行計(jì)算，mL/min:VR=tR×F分離度(Rs): 某個(gè)混合物中兩種組分的分離，是由以下公式?jīng)Q定的：Rs=2(tR2-tR1)/(W1-W2)其中，tR2和tR1是此兩種組分的保留時(shí)間，而W2和W1則是通過這些峰對(duì)于基線的相對(duì)延伸線而獲得的在峰底的對(duì)應(yīng)寬度。當(dāng)使用了電子積分儀時(shí)，它可能以此方程式方便的測(cè)定分離度:RS = 1.18(

21、tR2 tR1)/(W1,h/2+ W2,h/2)分離因子()：分離因子由毗鄰的兩個(gè)峰的相對(duì)保留進(jìn)行計(jì)算（分離因子的值通常大于1）= k2 / k1對(duì)稱因子(As)：峰的對(duì)稱因子（也作拖尾因子）可以通過以下公式進(jìn)行計(jì)算（見圖4）：As =W0.05 /2f其中W0.05是5%峰高處的峰寬，f是最大峰到峰起始邊緣的距離，此距離在離基線5%的峰高處測(cè)量。圖4 不對(duì)稱色譜峰拖尾因子：見對(duì)稱因子系統(tǒng)適用性系統(tǒng)適用性測(cè)試是氣相和液相色譜法的一個(gè)不可分割的部分。它們用于證實(shí)色譜系統(tǒng)對(duì)于將要進(jìn)行的分析是充分適用的。這些測(cè)試基于這樣的概念，設(shè)備、電子儀器、分析操作和待分析樣品構(gòu)成了一個(gè)完整的系統(tǒng)，而可以作為整

22、體來評(píng)估。分離度Rs（注意：所有術(shù)語和符號(hào)均在符號(hào)術(shù)語表中做了定義）是柱效N的函數(shù)，并被規(guī)定范圍以便確保臨近的洗脫物質(zhì)彼此分離，從而確立該系統(tǒng)的常規(guī)分離效力，并且確保內(nèi)標(biāo)物質(zhì)與藥物分離。柱效也可以規(guī)定為一項(xiàng)系統(tǒng)適用性要求，特別是當(dāng)色譜圖上只有一個(gè)被關(guān)注的峰時(shí)；但是，與直接測(cè)量相比，以此方法確保分離度，是一個(gè)可靠性較低的方式。柱效是一個(gè)峰陡峭度的指標(biāo)，其對(duì)于痕量組分的檢測(cè)是非常重要的。標(biāo)準(zhǔn)溶液制備品或其他標(biāo)準(zhǔn)溶液重復(fù)進(jìn)樣可用于比較以證實(shí)精密度是否達(dá)到要求。除非在各論中另有規(guī)定，如果對(duì)于相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差的要求為2.0%或更小，要用來自五次分析物重復(fù)進(jìn)樣的數(shù)據(jù)計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD%；如果相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差的

23、要求大于2.0%，則需使用六次重復(fù)進(jìn)樣的數(shù)據(jù)。對(duì)于各論中純物質(zhì)的量為100%的藥物的含量測(cè)試中，無最大相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，允許的最大標(biāo)準(zhǔn)偏差由一系列的參考溶液的進(jìn)樣進(jìn)行計(jì)算：其中K是常數(shù)（0.349）從公式 ，其中0.6/代表了六次進(jìn)樣后B=1.0所需的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差；B是各論中給出的上限減去100%；n是參考溶液重復(fù)進(jìn)樣的次數(shù)（3n6）；是在n-1自由度90%的概率下的一組t值。除非有特殊規(guī)定，允許的最大相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差不能超過表格中重復(fù)性要求的適當(dāng)數(shù)值。此要求不適用于相關(guān)物質(zhì)測(cè)定。相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差要求進(jìn)樣次數(shù)3456B（%）允許的最大相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差2.00.410.590.730.852.50.520.74

24、0.921.063.00.620.891.101.27對(duì)稱因子As，用以測(cè)定峰的對(duì)稱性，對(duì)于完美對(duì)稱峰它的值是單位1；它的值隨著拖尾的發(fā)生而顯著增加（見圖4）。在某些情況下，會(huì)出現(xiàn)小于單位1的數(shù)值。隨著對(duì)稱因子偏離單位1，積分結(jié)果和精密度的可信程度會(huì)減小。信噪比（S/N）對(duì)于衡量系統(tǒng)適用性是很有用的參數(shù)。它的計(jì)算如下：S/N=2H/h其中H是從峰頂?shù)交€延伸大于等于5倍的半峰高處的峰寬距離內(nèi)所測(cè)定目標(biāo)峰峰的峰高，h是延伸大于等于5倍的半峰高處的峰寬距離內(nèi)最大和最小噪聲峰的差，如有可能，目標(biāo)峰兩側(cè)取相同的距離。Hh圖5 噪聲和色譜峰，物質(zhì)的信噪比根據(jù)具體各論中的規(guī)定，收集來自標(biāo)準(zhǔn)或其他溶液重復(fù)進(jìn)

25、樣的數(shù)據(jù)進(jìn)行這些測(cè)試。某個(gè)各論中的確定參數(shù)的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)不妨礙使用其他適合的操作條件。調(diào)整是被允許的僅當(dāng)：l 用于系統(tǒng)適用性測(cè)試的全部物質(zhì)均具備適當(dāng)?shù)臉?biāo)準(zhǔn)（包括標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照品）；l 這些標(biāo)準(zhǔn)用于顯示這些調(diào)整已經(jīng)從符合系統(tǒng)適用性方面改進(jìn)了色譜的質(zhì)量。對(duì)色譜系統(tǒng)的調(diào)整是為了符合系統(tǒng)適用性要求而不是為了補(bǔ)償色譜柱故障或系統(tǒng)失常。如果必須調(diào)整操作條件以滿足系統(tǒng)適應(yīng)性要求，以下調(diào)整的項(xiàng)目均是可以接受的最大變化，除非在具體的各論中另有規(guī)定。為驗(yàn)證該方法在新條件下的適用性，應(yīng)該通過評(píng)價(jià)受到該變更影響的相關(guān)分析性能特征。多重調(diào)整可能對(duì)于系統(tǒng)的性能具有疊加效果，應(yīng)在實(shí)施前仔細(xì)考慮。對(duì)于梯度洗脫中流動(dòng)相組分的調(diào)整是不被建

26、議的。如果必須要調(diào)整，建議只調(diào)節(jié)色譜柱（相同填充材料）或容量體積。流動(dòng)相的pH(HPLC): 用于制備流動(dòng)相的水溶性緩沖液的pH值可以在規(guī)定數(shù)值±0.2單位以內(nèi)或規(guī)定范圍以內(nèi)調(diào)節(jié)。緩沖液的鹽濃度(HPLC): 用于制備在流動(dòng)相中使用的水性緩沖液的鹽類的濃度可以在±10%的范圍內(nèi)調(diào)節(jié)，只要符合準(zhǔn)許的pH值變化。流動(dòng)相比例(HPLC):下列調(diào)節(jié)限度應(yīng)用于流動(dòng)相的少數(shù)組分（規(guī)定為50%或更少）。這些組分的數(shù)量可以相對(duì)其自身做最多±30%的調(diào)整。但是，在任何組分中的改變不得超過10個(gè)百分點(diǎn)（例如，相對(duì)于總流動(dòng)相）?？梢詫?duì)三元混合物中的某個(gè)少數(shù)組分進(jìn)行調(diào)整。對(duì)二元和三元混合

27、物的調(diào)整的范例如下。二元混合物：規(guī)定比例為50:50:50的百分之三十是15個(gè)百分點(diǎn)，但這超過了在任意組分中±10個(gè)百分點(diǎn)的最大許可變更。因此，流動(dòng)相比例僅可以在40:60至60:40的范圍內(nèi)調(diào)整。規(guī)定比例為2:98:2的百分之三十是0.6個(gè)百分點(diǎn)。因此，最大允許調(diào)整范圍是1.4:98.6至2.6:97.4。三元混合物：規(guī)定比例為60:35:5：對(duì)于第二大的組分，35的30%是10.5個(gè)百分點(diǎn)，這超過了±10個(gè)百分點(diǎn)的任意組分中的最大允許變更。因此，第二大組分僅可以在25至45個(gè)百分點(diǎn)之間調(diào)整。對(duì)于第三大的組分，5的30%是1.5個(gè)百分點(diǎn)。在所有情況下，加入足夠數(shù)量的第一大

28、組分以便組成達(dá)到100%。因此混合物范圍在50:45:5至70:25:5或者58.5:35:6.5至61.5:35:3.5將會(huì)滿足要求。紫外-可見光檢測(cè)器的波長(zhǎng)（HPLC）：偏離該方法所規(guī)定的波長(zhǎng)是不允許的。應(yīng)使用由檢測(cè)器制造商規(guī)定的程序，或其他驗(yàn)證過的程序，來確認(rèn)檢測(cè)器波長(zhǎng)的誤差不超過±3nm。固定相柱長(zhǎng)（GC、HPLC）：可以最多調(diào)整±70%。色譜柱內(nèi)徑（HPLC）：若線性速度恒定可以調(diào)整，見下流速（HPLC）。色譜柱內(nèi)徑（HPLC） 對(duì)于GC，最多調(diào)整±50%。膜厚度（毛細(xì)管GC） 可以最多調(diào)整至-50%至100%。粒度（HPLC）：最多可以減少50%，但不

29、能增加。粒度（GC）：從較大到較小或從較小到較大（只要其具備同樣的“范圍比例”，由最大顆粒的直徑除以最小顆粒的直徑而得到）粒度的GC目載體是可以接受的，只要色譜符合系統(tǒng)適用性的要求。流速（GC）：可以最多調(diào)整±50%。流速（HPLC）：當(dāng)色譜柱的大小發(fā)生變化時(shí)，流速可以用以下公式作調(diào)整：其中，F(xiàn)1 為各論中的流速，單位是mL/min; F2 是調(diào)整流速，單位是mL/min; I1 是各論中的柱長(zhǎng)；I2 是所使用的柱長(zhǎng)；d1 是各論中的柱內(nèi)徑；d2 是所使用的柱內(nèi)徑。此外，流速可以調(diào)整±50%。進(jìn)樣量（HPLC）：可以盡可能減少，只要達(dá)到可接受的精密度和檢測(cè)限；不得增加進(jìn)樣量

30、。進(jìn)樣體積和裂解體積（GC）：可以做出調(diào)整但要滿足可檢測(cè)性和重復(fù)性。柱溫（HPLC）：最多可以調(diào)整±10°。建議采用色譜柱恒溫箱，以便改進(jìn)保留時(shí)間的控制與重現(xiàn)性。爐溫（GC）：可以最多調(diào)整±10%。爐溫程序（GC）：允許的溫度調(diào)節(jié)見上述。對(duì)于規(guī)定溫度的維持時(shí)間或者從一個(gè)溫度變?yōu)榱硪粋€(gè)溫度所用的時(shí)間，允許最多±20%的調(diào)整。除非各論中另有規(guī)定，系統(tǒng)適用性參數(shù)以分析物的峰來測(cè)定。從供試物質(zhì)測(cè)得的RR、RF、或t值與從對(duì)照物質(zhì)和混合物中得到的這些值之間的偏差不得超過從對(duì)照物質(zhì)重復(fù)含量測(cè)定中以統(tǒng)計(jì)學(xué)方法確定的可靠性評(píng)估值。樣品中從參考化合物重復(fù)含量相對(duì)保留時(shí)間可以在各論中提供，僅僅作為相關(guān)信息，以幫助峰的鑒別。沒有應(yīng)用于相對(duì)保留時(shí)間的接受標(biāo)準(zhǔn)。系統(tǒng)適用性用以證實(shí)最終操作系統(tǒng)的有效性，因此系統(tǒng)應(yīng)該進(jìn)行適用性測(cè)試。通過合適的進(jìn)樣運(yùn)