全內(nèi)反射熒光顯微術(shù)及其在生物單分子科學(xué)中的應(yīng)用

1、全內(nèi)反射熒光顯微術(shù)及其在生物單分子科學(xué)中的應(yīng)用北京大學(xué)力學(xué)與工程科學(xué)系生物醫(yī)學(xué)工程專業(yè)02級博士鐘建學(xué)號: 10203829摘要:全內(nèi)反射熒光顯微技術(shù)利用全內(nèi)反射產(chǎn)生的隱失波激發(fā)樣品,由于隱失波強(qiáng)度成指數(shù)衰減,使激發(fā)區(qū)域限定在樣品表面的一薄層范圍內(nèi),因此具有其它光學(xué)成像技術(shù)無法比擬的高的信噪比。它是當(dāng)今世界上研究單分子科學(xué)最具前途的新型生物光學(xué)顯微技術(shù)之一,可以用來實(shí)現(xiàn)對單個(gè)熒光分子的直接探測。近年來,已被生物物理學(xué)家們廣泛應(yīng)用于單分子的熒光成像中。本文主要介紹了全內(nèi)反射熒光顯微技術(shù)的基本知識及其在生物單分子科學(xué)上的應(yīng)用。關(guān)鍵詞:全內(nèi)反射熒光顯微技術(shù),生物單分子,隱失波生物單分子研究是指在單分

2、子水平上對生物分子行為(包括構(gòu)象變化、相互識別、相互作用等的實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)檢測以及在此基礎(chǔ)上的操縱和調(diào)控等,籍此深入闡明構(gòu)效、構(gòu)性關(guān)系。生物單分子研究已經(jīng)成為21世紀(jì)生命科學(xué)領(lǐng)域的一個(gè)重點(diǎn)研究方向。在生命科學(xué)領(lǐng)域有著廣泛的研究前景。生物單分子研究要求發(fā)展超高分辨率的成像技術(shù),從而在分子尺度上探測生命活動(dòng)的細(xì)節(jié)。新一代光學(xué)顯微技術(shù)以其高的空間分辨率和時(shí)間分辨率、無損傷、以及對單分子活體探測的可行性,成為生物學(xué)家和物理學(xué)家的研究熱點(diǎn)。目前國際上公認(rèn)的最有前途的單分子光學(xué)成像技術(shù)有全場相襯顯微術(shù)、共焦熒光顯微術(shù),近場光學(xué)掃描顯微術(shù)和全內(nèi)反射熒光顯微術(shù)1。這些技術(shù)在分子生物學(xué)、分子化學(xué)、激光醫(yī)學(xué)及納米材料等

3、領(lǐng)域受到廣泛關(guān)注,并產(chǎn)生了深遠(yuǎn)的影響。其中,全內(nèi)反射熒光顯微術(shù)是近年來新興的一種光學(xué)成像技術(shù),它利用全內(nèi)反射產(chǎn)生的隱失場來照明樣品,從而致使在百納米級厚的光學(xué)薄層內(nèi)的熒光團(tuán)受到激發(fā),熒光成像的信噪比很高。這種方法的成像裝置簡單,極易和其它成像技術(shù)、探測技術(shù)相結(jié)合。目前已成功的實(shí)現(xiàn)200nm甚至更低的空間分辨率。因此被生物物理學(xué)家用來觀察單分子成像,也被細(xì)胞生物學(xué)家和神經(jīng)科學(xué)家來觀測發(fā)生在細(xì)胞膜上的生理反應(yīng)2。1. 全內(nèi)反射的基本理論全內(nèi)反射是一種普遍存在的光學(xué)現(xiàn)象。考慮一束平面光波從折射率為n1的介質(zhì)進(jìn)入到折射率為n2的介質(zhì)中。入射光在表面上一部分發(fā)生反射,另一部分則發(fā)生透射。入射角1和透射角

4、2之間滿足關(guān)系式n1sin1=n2sin2(1若n1大于n2,例如折射率為1的是玻璃,折射率為n2的是液體溶液。當(dāng)入射角增大,增大到臨界角c時(shí),這時(shí)的透射角為90,當(dāng)入射角大于或者等于臨界角時(shí),光不再透射進(jìn)溶液,也就是發(fā)生了全反射,如圖1所示。由snell定律可知2=90c=sin-1(n2/n1 (2由上式可知,當(dāng)n1大于n2時(shí),全反射就可能發(fā)生。如果玻璃的折射率取為1.52,溶液的折射率取為1.33(生物細(xì)胞的折射率范圍是1.331.38,則玻璃/界面處的臨界角為61.74。從幾何光學(xué)的角度來看,當(dāng)光發(fā)生全反射時(shí),光會在玻璃界面上完全反射而不進(jìn)入液體溶液中。實(shí)際上,由于波動(dòng)效應(yīng),有一部分光

5、的能量會穿過界面滲透到溶液中,是一種非均勻波,它沿著入射面上的介質(zhì)邊界傳播,而振幅隨離界面的距離z作指數(shù)衰減?？梢钥闯?透射電磁場的振幅隨進(jìn)入樣品的深度z減小得非?？?這種電磁場只存在于界面附近一薄層內(nèi),因此,我們稱此非均勻場為隱失場,。其在第二介質(zhì)中的有效進(jìn)入深度約為一個(gè)波長3。隱失波激發(fā)在一個(gè)波長范圍之內(nèi)的熒光分子發(fā)出熒光(如圖1。 圖1 左圖為全內(nèi)反射示意圖。箭頭表示激光的方向,激光被全反射,同時(shí)產(chǎn)生在z方向成指數(shù)衰減的隱失波。黃色小圓點(diǎn)表示被隱失波激發(fā)的熒光分子,白色小圓點(diǎn)表示未被激發(fā)的熒光分子。右圖表示隱失波的強(qiáng)度-深度圖。2. 全內(nèi)反射的儀器組成到目前為止,已經(jīng)發(fā)展了多種全內(nèi)反射熒

6、光顯微鏡成像系統(tǒng)。其中最為普遍的有兩種類型:棱鏡型和物鏡型2。如圖2。 圖2 兩種類型的全內(nèi)反射熒光顯微鏡成像系統(tǒng),1為棱鏡型,2為物鏡型。棱鏡型成像系統(tǒng)只需要顯微鏡,棱鏡和激光光源,所以容易實(shí)現(xiàn)。棱鏡作為發(fā)生全內(nèi)反射的光學(xué)器件。物鏡只是作為熒光信號收集器。在探測上,它也不容易受到入射光的干擾。缺點(diǎn)是放置樣品的空間位于棱鏡和蓋玻片之間,所以樣品大小和樣品的放置受到限制。而在物鏡型成像系統(tǒng)中,顯微鏡的物鏡既是發(fā)生全內(nèi)反射的光學(xué)器件,又是樣品熒光信號的收集器。其優(yōu)點(diǎn)是樣品的大小沒有棱鏡的限制,樣品的放置非常方便,并且由于樣品遠(yuǎn)離物鏡而可以與多種其他技術(shù)相結(jié)合,例如微操作,微分干涉成像系統(tǒng),光鑷技術(shù)

7、,掃描探針顯微術(shù)等等,因而相對于棱鏡型展現(xiàn)出更加廣闊的生物應(yīng)用前景。3. 物鏡型光學(xué)成像系統(tǒng)中物鏡由于細(xì)胞的典型折射率為1.331.38,因此要實(shí)現(xiàn)全內(nèi)反射,在物鏡型全內(nèi)反射熒光成像系統(tǒng)中物鏡的數(shù)值孔徑(NA必須大于1.38。表達(dá)式為NA=nsin; nsinnsinc (3 其中NA為物鏡的數(shù)值孔徑,n,分別為物鏡的折射率(浸沒油和孔徑角。c為發(fā)生全內(nèi)反射的臨界角。當(dāng)物鏡數(shù)值孔徑為1.4時(shí),只有很小的一部分?jǐn)?shù)值孔徑范圍(1.4-1.38=0.02被利用,入射角可調(diào)節(jié)范圍(最大孔徑角與全內(nèi)反射角的差值很小,光束校準(zhǔn)比較難,同時(shí)光束的強(qiáng)度也很難提高。若使用數(shù)值孔徑為 1.65的物鏡,則有一個(gè)大的

8、多的孔徑范圍(1.65-1.38=0.27可以被利用,則入射角可調(diào)節(jié)范圍變大,降低了操作難度。高數(shù)值孔徑的物鏡的使用是物鏡型全內(nèi)反射熒光成像系統(tǒng)的關(guān)鍵2,4。表1:全內(nèi)反射角和最大的物鏡角 4. 生物單分子熒光探測真正意義上的單分子熒光探測,有很多的困難,但是還是可能的。單分子熒光探測主要有三個(gè)問題:(1單分子發(fā)出的熒光信號通常是很微弱的,所以要尋找一個(gè)足夠靈敏的探測器。(2由于拉曼散射,瑞利散射和雜質(zhì)熒光等產(chǎn)生的背景光,極大的干擾了信號光的探測。所以應(yīng)該盡量降低背景激發(fā)光。(3本體溶液產(chǎn)生的焦點(diǎn)熒光之外的背景光。這些問題都可以利用全內(nèi)反射熒光顯微成像系統(tǒng)來解決5。近年來,超靈敏的探測設(shè)備的飛

9、速發(fā)展,為在最普適的生理狀況下實(shí)現(xiàn)生物單分子的熒光探測鋪平了道路,解決了問題(1。超靈敏的探測設(shè)備如單光子計(jì)數(shù)的雪崩光電二極管,可以達(dá)到5%的探測效率,即100個(gè)光子中有5個(gè)光子可被探測到。這樣,從單個(gè)典型的熒光團(tuán)的光發(fā)射中可以探測到約500050,000個(gè)光子。這個(gè)數(shù)目不僅對實(shí)現(xiàn)單分子探測是足夠的,對光譜識別和一定時(shí)域內(nèi)的實(shí)時(shí)監(jiān)控也是足夠的。對于包含單個(gè)的熒光團(tuán)如熒光素、若丹明或藍(lán)色素的分子來說,這種估算是嚴(yán)格的。而對于生物大分子而言,如蛋白質(zhì)和核酸,為了加強(qiáng)信號的強(qiáng)度,每一個(gè)分子要用很多個(gè)相同的熒光團(tuán)來標(biāo)記4。還有當(dāng)今最靈敏的成像探測器電子倍增電荷偶聯(lián)設(shè)備(Electron Multipl

10、ying Charge Coupled Device,它的優(yōu)點(diǎn)主要在降低了噪聲讀取基底,高的量子效率(可以達(dá)到90%以上,最少的暴光時(shí)間,降低了激發(fā)所需的強(qiáng)度,降低了熒光團(tuán)濃度,增加了放大倍數(shù)。無可比擬的信噪比。因此是最先進(jìn)的用來做單光子檢測的科學(xué)CCD照相機(jī)6。全內(nèi)反射顯微成像是采用隱失波照明。隱失波在平行界面方向以行波場方式傳播,在垂直界面方向則是一個(gè)指數(shù)衰減場。所以這種顯微成像技術(shù)成像的視野開闊,同時(shí)探測樣品的厚度卻很薄,約為百納米量級,從而解決了問題(2和(3,可以將拉曼散射,瑞利散射和雜質(zhì)熒光等產(chǎn)生的背景光減小到極低的水平,也使得在百納米量級范圍以外的本體溶液因?yàn)闆]有激發(fā)而得已解決。

11、5. 在生物單分子研究中的應(yīng)用細(xì)胞內(nèi)的很多至關(guān)重要的生命活動(dòng)過程如信號轉(zhuǎn)導(dǎo),蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn),病原體侵入均與細(xì)胞表面有關(guān),如果我們可以直接對這些細(xì)胞表面的過程進(jìn)行觀測,而不受到來自細(xì)胞內(nèi)深層區(qū)域信號的干擾,這對細(xì)胞生物學(xué)研究來說,將是具有重大意義的突破。全內(nèi)反射熒光顯微術(shù)正是憑借其獨(dú)特的優(yōu)勢,它的熒光激發(fā)深度只在200nm的薄層范圍內(nèi),從而成為研究細(xì)胞表面科學(xué)如生物化學(xué)動(dòng)力學(xué)、單分子動(dòng)力學(xué)的最有前途的光學(xué)成像技術(shù)7。如圖3?，F(xiàn)在全內(nèi)反射熒光顯微術(shù)已被廣泛用于實(shí)時(shí)觀察單個(gè)肌漿球蛋白分子的運(yùn)動(dòng)、單個(gè)蛋白分子對之間的熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET、ATP酶的翻轉(zhuǎn)8,9,聚合物內(nèi)單個(gè)分子的結(jié)構(gòu)變化10,11,等

12、離子體膜附近的神經(jīng)分泌腺的顆粒運(yùn)動(dòng)12,胞內(nèi)吞和胞吐13,14等多方面。 圖3 利用物鏡型全內(nèi)反射熒光顯微鏡觀察活細(xì)胞表面示意圖。6. 與其他生物單分子研究技術(shù)的比較 圖4活細(xì)胞單分子顯微鏡方法比較。以活細(xì)胞研究為例,全內(nèi)反射熒光顯微鏡與其他單分子技術(shù)相互補(bǔ)充,從不同的角度研究細(xì)胞15,如圖4。單粒子追蹤術(shù)(SPT,單染色示蹤術(shù)(SDT,掃描近場光學(xué)顯微鏡(SNOM,原子力顯微鏡(AFM和分子識別力顯微鏡(MRFM都是研究放置在固體平面支撐物上活細(xì)胞的上表面細(xì)胞膜的技術(shù),SPT和SDT是都是成像技術(shù),SPT利用膠體金粒子來標(biāo)記細(xì)胞表面分子,從而在納米精度和毫秒尺度上追蹤細(xì)胞表面分子的運(yùn)動(dòng)。SD

13、T利用熒光分子來標(biāo)記細(xì)胞表面分子,利用熒光分子來觀察。SNOM具有較高的側(cè)向分辨率,而在細(xì)胞表面,分辨率顯著的降低,而且由于其較長的成像獲取時(shí)間而不能用于對運(yùn)動(dòng)的結(jié)構(gòu)成像,AFM與SNOM具有相似的高的側(cè)向分辨率,細(xì)胞表面成像是分辨率顯著的降低,也不能對運(yùn)動(dòng)的結(jié)構(gòu)成像,MRFM是在AFM的基礎(chǔ)上,對AFM針尖進(jìn)行修飾, 利用生物素-抗生物素蛋白,細(xì)胞黏附蛋白,抗體-抗原之間的相互作用來研究細(xì)胞表面的一些性質(zhì)的一種技術(shù)。共聚焦激光掃描顯微鏡(CLSM和雙光子激光掃描顯微鏡(TPLSM則是可以檢測細(xì)胞質(zhì)內(nèi)熒光的技術(shù),CLSM的重要優(yōu)勢在于,它提供了僅從單光學(xué)薄層收集光波的可能性。與聚焦平面共軛的針

14、孔定位(即共焦可避免來自檢測器之外的光,即從聚焦平面以外的其它地方反射/發(fā)射過來的光。但是這個(gè)光學(xué)薄層的厚度大約為500-800nm,要大于全內(nèi)反射熒光顯微鏡的光學(xué)薄層的厚度(200nm,而且其較長的成像獲取時(shí)間使得在毫秒尺度上進(jìn)行的組成型改變和動(dòng)力學(xué)重排研究成為不可能。TPLSM對生物系統(tǒng)和體內(nèi)細(xì)胞性質(zhì)具有高的分辨率,如細(xì)胞器,細(xì)胞連接,細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度,細(xì)胞膜流動(dòng)性。全內(nèi)反射熒光顯微鏡(TIRFM則是研究緊貼固體平面支撐物的細(xì)胞膜的技術(shù),但是正因?yàn)槟づc固體支撐物具有相互作用,以及隱失波強(qiáng)度的指數(shù)性下降而導(dǎo)致單分子信號的指數(shù)性下降,使得對結(jié)果的解釋具有一定的困難性。因此將全內(nèi)反射熒光顯微術(shù)與

15、其它的顯微成像技術(shù)相結(jié)合來研究將是未來發(fā)展的一個(gè)新的方向。全內(nèi)反射熒光顯微術(shù)在短短的十幾年中發(fā)展十分迅猛,已經(jīng)成為生物單分子科學(xué)研究必備的工具之一,它將成為細(xì)胞-基底接觸區(qū)域內(nèi)的豐富的細(xì)胞生命活動(dòng)最強(qiáng)有力的探測方法。如細(xì)胞膜內(nèi)蛋白質(zhì)的動(dòng)力學(xué)過程,基底附近的細(xì)胞骨架,細(xì)胞運(yùn)動(dòng)等。在未來的一段時(shí)間內(nèi),全內(nèi)反射熒光顯微術(shù)將會主要從兩個(gè)角度去改進(jìn):光電探測設(shè)備探測效率和探測速度的提高以及單分子染色技術(shù)的發(fā)展。參考文獻(xiàn):1 Shuming Nie, Richard N. Zare. Optical detection of single molecule. Annu Rev Biophys Biomol

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