HPLC法測(cè)定雙黃連顆粒中綠原酸的含量-實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

1、儀器分析實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案HPLC法測(cè)定雙黃連顆粒中綠原酸的含量一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康恼莆罩兴幒繙y(cè)定方法的實(shí)驗(yàn)方案設(shè)計(jì)和測(cè)定方法原理及操作。掌握高效液相色譜法的測(cè)定原理和高效液相色譜儀的使用。熟悉高效液相色譜法在中藥制劑定量分析中的應(yīng)用。二、實(shí)驗(yàn)原理雙黃連顆粒收載于2010版中華人民共和國(guó)藥典（一部）1，由金銀花、黃芩、連翹組成，功能疏風(fēng)解表，清熱解毒，用于外感風(fēng)熱所致的感冒。金銀花為方中君藥，其主要有效成分為綠原酸和異綠原酸。而2010版藥典中只收載了黃芩和連翹的含量測(cè)定方法，沒(méi)有金銀花的含量測(cè)定方法，為了更好的控制雙黃連顆粒的質(zhì)量，提高雙黃連顆粒的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，本方案依據(jù)綠原酸在25水中溶解度為4%，熱水中

2、溶解度更大，易溶于甲醇、乙醇及丙酮,有紫外吸收等特性，本方案擬定采用HPLC法測(cè)定雙黃連顆粒中金銀花的主要成分綠原酸的含量。綠原酸三、 儀器與試藥高效液相色譜儀：型號(hào)？公司？ ；紫外分光儀：型號(hào)？公司？；超聲波清洗器：型號(hào)？公司？；電子天平: 型號(hào)？公司？；綠原酸對(duì)照品由中國(guó)藥品生物制品檢定所提供（批號(hào)：？，含量測(cè)定用）；雙黃連顆粒由？公司提供（批號(hào)：）；甲醇為色譜純：公司？；水為純凈水（公司）；其它試劑均為分析純。儀器分析實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案四、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容及步驟4.1 缺金銀花陰性樣品的制備2黃芩50g加水煎煮三次，第一次1h，第二、三次各0.5h，合并煎煮液，濾過(guò)，濾液濃縮至相對(duì)密度1.051.10

3、（80），于80時(shí)加2mol/L鹽酸溶液調(diào)節(jié)PH值至1.02.0，保溫1h，靜置24h，濾過(guò)，沉淀用水洗至PH值5.0，繼用70%乙醇洗至PH值為7.0，低溫干燥，備用。連翹100g，加水溫浸30min，煎煮2次，每次1h，分次濾過(guò)，合并濾液，濃縮至相對(duì)密度為1.21.25（7080）的清膏，冷至40時(shí)，攪拌下加入乙醇，使乙醇量達(dá)75%，充分?jǐn)嚢?，靜置12h，濾過(guò)，合并乙醇液，回收至無(wú)醇味，并濃縮成相對(duì)密度為1.301.32（6065）的清膏，減壓干燥，與上述黃芩提取物粉碎成細(xì)粉，加入糊精等輔料適量，混勻，制成顆粒，干燥，制成1000g，或加入蔗糖，糊精等輔料適量，混勻，制成顆粒，干燥成200

4、g，即得。4.2 對(duì)照品溶液的配制3精密稱取適量綠原酸對(duì)照品，置100mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度, 搖勻，制得約0.1mg/mL的對(duì)照品儲(chǔ)備液。然后再用該儲(chǔ)備液制成對(duì)照品溶液。4.3 色譜條件的選擇4.3.1 測(cè)定波長(zhǎng)的選擇 取綠原酸對(duì)照品儲(chǔ)備液稀釋至約5ug/ml于200-400nm波長(zhǎng)進(jìn)行紫外掃描，結(jié)果在？nm處有最大吸收，結(jié)合參考文獻(xiàn)故選擇？nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。4.3.2 流動(dòng)相的選擇取一批雙黃連顆粒樣品,研細(xì),取約0.5g,精密稱定,置50mL的錐形瓶中,精密加入50%甲醇25mL,稱定重量，超聲處理20min。放置至室溫,加50%甲醇補(bǔ)足失重,搖勻,濾過(guò),取續(xù)濾液過(guò)0.45&

5、#181;m微孔濾膜作為供試品溶液4。分別吸取綠原酸對(duì)照品溶液和供試品溶液各10ul，以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑, 流速為1.0mL/min, 柱溫為25。檢測(cè)波長(zhǎng)為 ？nm，以甲醇-水-冰醋酸(15851) 4 乙腈- 0.4%磷酸溶液( 13: 87) 為流動(dòng)相,為流動(dòng)相（跟據(jù)色譜圖微調(diào)調(diào)節(jié)流5儀器分析實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案動(dòng)相比例）,綜合考慮保留時(shí)間、分離度、峰形、拖尾因子等優(yōu)選出適宜的色譜條件。色譜條件定為：色譜柱為？，以？為流動(dòng)相，流速為？，檢測(cè)波長(zhǎng)為？，進(jìn)樣量為？，柱溫25。4.4 供試品溶液制備方法的選擇4.4.1提取方法的選擇 取一批雙黃連顆粒樣品,研細(xì),取約0.5g,精密稱定,置5

6、0mL的錐形瓶中,加50%甲醇25mL,稱定重量，分別超聲20min、回流處理60min。放置至室溫,加50%甲醇補(bǔ)足失重,搖勻,濾過(guò),取續(xù)濾液過(guò)0.45µm微孔濾膜。續(xù)濾液即為供試品溶液，按上述已定色譜條件測(cè)定，結(jié)果如下：提取方法 綠原酸含量（%）回流超聲4.4.2提取溶劑的選擇 取一批雙黃連顆粒樣品,研細(xì),取約0.5g,精密稱定,置50mL的量瓶中,分別加水、50%甲醇、甲醇、50%乙醇各25mL,稱定重量，用項(xiàng)4.1優(yōu)選出的提取方法提取。放置至室溫,用相應(yīng)溶劑補(bǔ)足失重,搖勻,濾過(guò),取續(xù)濾液過(guò)0.45µm微孔濾膜即為供試品溶液，按已定的色譜條件進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果如下：提取溶

7、劑 綠原酸平均含量（%）水50%甲醇甲醇50%乙醇4.4.3提取時(shí)間的選擇 取一批雙黃連顆粒樣品,研細(xì),取約0.5g,精密稱定,置50mL的量瓶中,加項(xiàng)4.2下優(yōu)選提取溶劑25mL,稱定重量，用項(xiàng)4.1下優(yōu)選的提取方法處理。放置至室溫,加溶劑補(bǔ)足失重,搖勻,濾過(guò),取續(xù)濾液過(guò)0.45µm微孔濾膜即為供試品溶液，按已定的色譜方法測(cè)定，結(jié)果如下：提取時(shí)間(min) 綠原酸平均含量（%）203060供試品溶液制備方法定為：取一批雙黃連顆粒樣品,研細(xì),取約0.5g,精密稱定,置50mL的錐形瓶,加？25mL,稱定重量，？處理。放置至室溫,加溶劑補(bǔ)足失重,搖勻,濾過(guò),取續(xù)濾液過(guò)0.45µ

8、;m微孔濾膜作為供試品溶液。儀器分析實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案4.5 方法學(xué)考察4.5.1專屬性考察 取陰性對(duì)照品按供試品溶液的制備方法制備陰性對(duì)照品溶液，在按照已定色譜條件測(cè)定。（在圖譜中不應(yīng)出現(xiàn)綠原酸的峰）4.5.2 線性關(guān)系考察 精密稱取綠原酸對(duì)照品適量,各??？mL注入液相色譜儀,按上述色譜條件進(jìn)行測(cè)定。以對(duì)照品的進(jìn)樣量µg數(shù)為橫坐標(biāo)，峰面積積分值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。槲皮素線性關(guān)系考察表綠原酸µg 平均峰面積得線性回歸方程？, 相關(guān)系數(shù)？，結(jié)果表明，綠原酸含量在？µg范圍內(nèi)線性良好。線性關(guān)系圖？4.5.3精密度試驗(yàn)精密吸取綠原酸對(duì)照品溶液10µL,注入高效液

9、相色譜儀,連續(xù)進(jìn)樣6 次, 測(cè)定綠原酸的峰面積，結(jié)果如下:序號(hào) A12356ARSD(%)計(jì)算RSD值為？%，表明儀器的精密度是否良好。4.5.4穩(wěn)定性試驗(yàn) 分別于0、2、4、6、8、10h，精密吸取同一供試品溶液10µL,于高效液相色譜儀進(jìn)樣測(cè)定一次，測(cè)定結(jié)果如下：時(shí)間(h) 峰面積26810平均峰面積 RSD(%)計(jì)算RSD值？%，表明雙黃連顆粒樣品溶液在？h內(nèi)穩(wěn)定。4.5.5重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱取同一批號(hào)的雙黃連顆粒樣品,按供試品溶液制備方法分別制備6份供試品溶液,按上述色譜方法測(cè)定。儀器分析實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案雙黃連顆粒W(g)綠原酸平均含量% RSD（%）結(jié)果雙黃連顆粒中綠原酸平均含

10、量為？，RSD值為？%4.5.6加樣回收率試驗(yàn) 分別精密稱取已知含量的同一批雙黃連顆粒樣品9份，加入綠原酸對(duì)照品溶液，按供試品液的制備的方法處理，制備所需溶液，按已定的色譜條件測(cè)定。綠原酸加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果樣品中的含量序號(hào)（mg）1 2 3 4 5 6 7 8 9加入量（mg） 測(cè)出量（mg） 回收率(%)平均回收率(%)RSD (%)計(jì)算回收率，結(jié)果樣品中綠原酸平均回收率為？ %，RSD為？ %。說(shuō)明已定的方法具有良好的回收率，可分別用于測(cè)定雙黃連顆粒中綠原酸的含量。儀器分析實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案參考文獻(xiàn)：1 國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典(一部)S. 北京：化學(xué)工業(yè)出版社,2010:？2 國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典(一部)S. 北京:化學(xué)工業(yè)出版社,2005:4064