常見(jiàn)豬病PCR檢測(cè)操作步驟及試劑配制

1、常見(jiàn)豬病PCR檢測(cè)操作步驟及試劑配制一、RNA病毒(藍(lán)耳病、豬瘟、乙腦、豬傳染性胃腸炎病毒、豬流行性腹瀉病毒、輪狀病毒等包括病料的處理、RNA的提取、反轉(zhuǎn)錄、和PCR擴(kuò)增、凝膠電泳四個(gè)步驟。1、病料的處理取組織病料約2克,加入4-5毫升滅菌的PBS或者生理鹽水,置研磨器(滅菌中研磨或者用剪刀細(xì)心剪碎,置-20中反復(fù)凍融三次,即可用于檢測(cè)。2、RNA的提取1取上述凍融三次的病料約200微升置1.5毫升的離心管中,加入500-600微升TRIzol劇烈振搖30秒后,靜置5分鐘后,再次劇烈振搖30秒后,靜置5分鐘。2在加入200微升的氯仿,上下顛倒混勻30s,靜置5分鐘,4 12000g 離心15

2、min。離心完畢后,取上清約400-500微升(注意不要吸到中間層白色物質(zhì)置新的滅菌好的離心管中,加入等體積的異丙醇,顛倒數(shù)次后(不可劇烈震動(dòng)靜置10分鐘,412000g離心10 min.可見(jiàn)管底部有少量白色沉淀,倒掉異丙醇,加入1毫升75%的乙醇(DEPC水配制,振搖,將白色沉淀懸浮,47500g離心5 min。棄去上清,干燥沉淀物(將離心管倒置于衛(wèi)生紙或者其它吸水紙上,室溫約5 min即可加入20LDEPC水溶解用于RT-PCR,或于-20保存?zhèn)溆?。兩步?1、反轉(zhuǎn)錄在10L的反轉(zhuǎn)錄體系中加入:上述步驟中提取的RNA7L、5Buffer 2L、0.5L或者下游引物0.5L;6510分鐘,

3、10 mM dNTP 0.25L、Oligo (dT18迅速放置-20攝氏度冰箱中2分鐘,加入M-MLV 100U/L 0.25L(反轉(zhuǎn)錄酶 37水浴1h,即可做為PCR擴(kuò)增的模板,立即用于PCR擴(kuò)增或置于- 20 保存?zhèn)溆谩?、PCR擴(kuò)增設(shè)立陽(yáng)性和陰性對(duì)照,陽(yáng)性對(duì)照一般為病毒液,陰性對(duì)照用滅菌的雙蒸水做為PCR反應(yīng)模板。反應(yīng)總體系為25LcDNA 2L,(模板25mmol/L Mg2+ 1.5L,2.5mmol/L dNTPs 2.0L,10 Mg2+ free PCR Buffer 2.5L,20mmol/ L上下游引物各1L,無(wú)菌雙蒸水補(bǔ)至25.0L。PCR反應(yīng)條件為:94預(yù)變性3 mi

4、n;94 45s,56 45s,72 45s,共進(jìn)行36個(gè)循環(huán);最后72延伸10min。(根據(jù)不同的病毒設(shè)定時(shí)間和溫度一步法:采用的是TaKaRa 的PrimeScript One Step RT-PCR Kit Ver.2試劑盒在25uL反應(yīng)總體系: PrimeScript 1 Step Enzyme Mix , 1uL RNase Free dH2 20mmol/ L上下游引物各1L, 提取的RNA模板:3ul反應(yīng)條件:50反轉(zhuǎn)錄30min,94預(yù)變性2min,進(jìn)行30個(gè)循環(huán)(94變性1min, 56退火1min,72延伸1min, 最后72延伸10min。擴(kuò)增完的PCR產(chǎn)物放4保存。3、

5、凝膠電泳1%瓊脂糖凝膠的配制0.25瓊脂糖+25毫升TAE+1.25微升Goidview放入錐形瓶中,置烤箱中約1分鐘沸騰后,搖勻,放置室外,約20-30分鐘后倒入板中,約30-45分鐘凝固后即可使用。點(diǎn)樣:將凝膠放入電泳槽中,DL2000的DNA Marker3-5微升,其它樣品5微升+0.5-1微升的londingbuffer混合后點(diǎn)樣,開(kāi)啟電泳儀,電壓80-150V。4、PCR 產(chǎn)物回收純化取20L PCR產(chǎn)物與4L 6Loading Buffer混勻,1%瓊脂糖凝膠(GoldView 0.5ug/ml電泳。電泳結(jié)束后,在紫外燈下切出含有目的DNA條帶的瓊脂糖凝膠,用紙巾吸盡凝膠表面的電

6、泳緩沖液,此時(shí)應(yīng)注意盡量切除不含目的DNA部分的多余凝膠以減小凝膠體積,從而提高DNA的回收產(chǎn)率。之后按照膠回收試劑盒產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)回收目的片段,并取1L回收產(chǎn)物點(diǎn)樣觀察回收效果。純化步驟如下:(1 稱(chēng)量膠塊重量,計(jì)算膠塊體積,按照1mg等于1L計(jì)算膠塊體積;(2 向膠塊中加入3倍膠塊體積的融化液DR-I Buffer;(3 均勻混合后65水浴10 min,其間搖晃3-5次使膠塊完全溶化;(4 向上述膠塊融化液中加入DR-I Buffer 0.5倍體積量的DR-II Buffer,均勻混合;(5 轉(zhuǎn)移液體至Spin column中,12,000 rpm 離心1min,棄濾液(可將濾出液體回收再離心

7、一次以提高DNA回收率;(6 將500ul 的RinseA加入Spin column 中,12,000 rpm 離心30s,棄濾液;(7 將700 ul 的Rinse B加入Spin column 中,靜置2-3 min,12,000 rpm 離心30s,棄濾液;(8 重復(fù)上一步操作;(9 10,000 rpm,離心1min,棄濾液;(10 將Spin column 安置于一滅菌的1.5ml Eppendorf管中,在濾膜中央處加入滅菌雙蒸水或者試劑盒中的洗脫緩沖液20-30微升,室溫靜置1-2 min; (11 12,000 rpm 離心1min,收集濾出液體再離心洗脫一次,即得到純化的PC

8、R 產(chǎn)物。注:PCR純化產(chǎn)物可直接用于測(cè)序,如用PCR回收產(chǎn)物直接測(cè)序時(shí),回收第10步中不可用洗脫緩沖液,只可用雙蒸水。5、DNA病毒(PCV2、偽狂犬病毒、細(xì)小病毒等包括病料處理、DNA的提取和PCR擴(kuò)增、凝膠電泳四個(gè)步驟。1、病料處理同上2、DNA的提取1取處理好的病料約1毫升置1.5毫升的離心管中,12000 rpm/min離心五分鐘,取上清液(500-700l.繳入等體積的氯仿劇烈振搖靜止5分鐘,12000 rpm 離心10分鐘,2去上清至新的離心管中,加入終濃度為分別為10% 的SDS(約50微升和50g/ml蛋白酶K(約10微升,55作用1.5h-2h(提前準(zhǔn)備好水浴鍋。3加入20

9、0uL Tris飽和酚,振蕩混勻,4,12000 rpm/min離心15min;4取上清液,于一個(gè)新的離心管中,加入Tris飽和酚和氯仿各200uL,充分混勻, 12000 rpm/min離心15min;5取上清于一新的離心管中,加入200uL氯仿,充分混勻,12000 rpm/min離心15min;6去上清于新的離心管中,加入2倍體積無(wú)水乙醇,-20放置20min, 12000rpm/min離心15min,棄上清。(無(wú)水乙醇提前冰浴7加入70%的乙醇(提前放入冰箱沖洗沉淀表面和管壁,棄乙醇,晾干。(若無(wú)沉淀可以離心7500 rpm/min離心5min;8最后加入20l 無(wú)菌ddH2O溶解,-

10、20保存?zhèn)溆谩?、PCR擴(kuò)增設(shè)立陽(yáng)性和陰性對(duì)照,陽(yáng)性對(duì)照一般為病毒液,陰性對(duì)照用滅菌的雙蒸水做為PCR反應(yīng)模板。反應(yīng)總體系為25LcDNA 2L,(模板25mmol/L Mg2+ 1.5L,2.5mmol/L dNTPs 2.0L,10 Mg2+ free PCR Buffer 2.5L,20mmol/ L上下游引物各1L,無(wú)菌雙蒸水補(bǔ)至25.0L。PCR反應(yīng)條件為:94預(yù)變性3 min;94 45s,56 45s,72 45s,共進(jìn)行36個(gè)循環(huán);最后72延伸10min。(根據(jù)不同的病毒設(shè)定時(shí)間和溫度3、凝膠電泳同上4、PCR產(chǎn)物的純化回收以及測(cè)序同上。試劑配制1、DEPC水的配制向滅菌的玻璃

11、瓶中加入超純水,然后加入DEPC至終濃度為0.01%(V/V過(guò)夜攪拌(放置搖床中,高壓滅菌即可。2、病料處理用PBS的配制Na2HPO41.42 gKH2PO4向燒杯中加入800毫升去離子水,充分?jǐn)嚢?用濃鹽酸調(diào)節(jié)PH至7.4,加入去離子水定容至1升,高壓滅菌后即可使用。1、TAE電泳液150TAE貯存液:Tris242g,冰乙酸28.5 ml和Na2O 37.2混合,向燒杯中加入800毫升去離子水,充分?jǐn)嚢?加入57.1毫升醋酸,充分?jǐn)嚢?加入去離子水定容至1升,室溫保存。(21TAE工作液:50TAE貯存液20 ml,加純水定容至1000 ml。4、10%SDS:10gSDS置于100-2

12、00ml燒杯中,加入80ml的去離子水,68溶解,調(diào)PH7.2,早定容100ml.購(gòu)自TaKaRa公司。Tris飽和酚,購(gòu)自Solarbio。檢測(cè)用的引物:1.藍(lán)耳:上游:JN1 5 CGGTTTTGATGGGCGACA 3下游:JN2 5 TGCAGGCGTGCGAGGTAA 3退火溫度:53-56檢測(cè)缺失毒株用檢測(cè)疫苗毒用上游:HCV1 5AAACGGAGGGACTAGCCGT 3下游:HCV2 5GATTCAACTCCATGTGCCATG3退火溫度:56檢測(cè)野毒上游:CSFV1 5-ACCTAATCTTACACTATGCAATC-3下游:CSFV2 5-CTGGACTAGTCCCATCAAAT-3退火溫度:51-54 上游:TGEV1 5-GATGGCGACCAGATAGAAGT-3下游:TGEV2 5-GCAATAGGGTTGCTTGTACC-3退火溫度:51 上游:PEDV1 5- GAAATAACCAGGGTCGTGGA-3下游:PEDV2 5-GCTCACGAACAGCCACATTA-3退火溫度:51 上游:JE -1 5 AACAGCATGCAAATCGAAGAC3下游:JE- 2 5 CCAGAAACATCACCAGAAGG3退火溫度:55 上游:PRV-gB-F 5CGTCGAAGTAC