植酸酶生產(chǎn)菌的篩選及生長條件的研究

1、文章編號:1001-411X (200103-0047-03植酸酶生產(chǎn)菌的篩選及生長條件的研究何平1,傅雪琳2,趙亞華1,高向陽1,陳海濤1,徐鳳彩1(1華南農(nóng)業(yè)大學(xué)生物技術(shù)學(xué)院,廣東廣州510642;2華南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)系,廣東廣州510642摘要:從單胃動物的糞便垃圾堆中分離出一種可分泌植酸酶的青霉.進(jìn)一步的研究表明這種青霉培養(yǎng)液最佳的淀粉含量為40g L -1.青霉生長與其分泌植酸酶之間存在矛盾.青霉生長旺盛時產(chǎn)酶少,測出的酶活性低.青霉生長緩慢時產(chǎn)酶多,測出的酶活性高.植酸酶大量分泌前伴隨著培養(yǎng)液pH 值的急劇下降.關(guān)鍵詞:青霉;植酸;植酸酶中圖分類號:Q936文獻(xiàn)標(biāo)識碼:A植酸(phy

2、tate 又稱肌醇六磷酸酯,是植物組織中磷的主要貯存方式,在谷物、豆類、油料等作物種子中w (植酸約為1%3%,它不能為人和單胃動物消化吸收,隨糞便排出體外,不僅浪費磷資源,還污染環(huán)境;植酸能與體內(nèi)某些蛋白質(zhì)和金屬陽離子形成絡(luò)合物而降低其食品營養(yǎng)價值.植酸酶可以降解植酸為肌醇和無機磷.在動物飼料中添加植酸酶,不僅為動物提供所需的磷,而且通過解除螯合作用提高動物對礦物元素及蛋白質(zhì)的利用率,促進(jìn)動物生長發(fā)育,減少環(huán)境污染13.許多植物飼料中都含有植酸酶,但其含量極少,熱、酸不穩(wěn)定,在飼料加工過程中和動物胃中往往使之失活.微生物生產(chǎn)的植酸酶不僅耐酸,而且熱穩(wěn)定性相對于植物自身植酸酶要高.目前國內(nèi)應(yīng)用

3、的植酸酶均屬進(jìn)口產(chǎn)品,價格昂貴.國內(nèi)僅在近幾年有幾家單位開始此項工作的實驗室研究,但產(chǎn)酶活力低,成本高,因而至今仍無商品級植酸酶面世4,5.因此,培育和篩選產(chǎn)植酸酶高并具有廣泛的生長適應(yīng)性的菌株在目前顯得尤為重要.作者已從單胃動物的糞便垃圾堆中分離出一種青霉菌(Penicillium sp.,并對其生長條件及產(chǎn)酶特性進(jìn)行了初步研究.1材料與方法1.1植酸鈣的制備在植酸(pH12,密度111g m L -1中加入飽和CaCl 2溶液,滴入高濃度的NaOH 溶液至中性,過濾,用大量蒸餾水沖洗沉淀后烘干至恒質(zhì)量.1.2培養(yǎng)基及培養(yǎng)方法(1培養(yǎng)基母液的制備:5g L -1MgS O 47H 2O +5

4、0g L -1NH 4NO 3+5g L -1K Cl +1g L -1MnS O 42H 2O +0.1g L -1FeS O 47H 2O ,使用時稀釋10倍.(2固體培養(yǎng)基的制備及培養(yǎng)方法:15g L -1葡萄糖+30g L -1瓊脂+稀釋10倍的培養(yǎng)基母液,5g L -1植酸鈣,pH 5.5,溶解后倒入培養(yǎng)皿,冷卻后劃線培養(yǎng),30,35d.(3液體培養(yǎng)基的制備及培養(yǎng)方法:30g L -1葡萄糖+2080g L -1淀粉+3g L -1植酸鈣+稀釋10倍的培養(yǎng)基母液,pH5.5.500m L 三角瓶中裝液體培養(yǎng)基100m L ,在固體培養(yǎng)基上挑取3環(huán)青霉菌到液體培養(yǎng)基,于30,120次/

5、min 振蕩搖床上培養(yǎng)57d.1.3菌種的來源在雞糞的垃圾堆中,取1g 濕泥稀釋1000倍.吸取1m L 在固體培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng),初步篩選出分解植酸鈣的菌落.114植酸酶檢測方法6在固體培養(yǎng)基上挑取3環(huán)青霉菌到液體培養(yǎng)基,30振蕩培養(yǎng),將菌液在10000r/min 離心5min ,取上清液作為粗酶液.取酶液015m L 加底物緩沖液(0125m ol/L 乙酸-乙酸鈉,114mg m L -1植酸,pH510115m L ,45保溫30min ,然后加011g m L -1TC A 1m L ,定磷試劑3m L ,在660nm 下測定A 660nm值.以每毫升粗酶液作用1min 放出1nm o

6、l 無機磷為1酶活力單位(nm ol min -1m L -1.115青霉生長量測定采用質(zhì)量法,先稱量濾紙質(zhì)量,作好記錄和標(biāo)號.取10m L 菌液進(jìn)行過濾,烘干稱質(zhì)量,減去濾紙質(zhì)量得菌絲凈質(zhì)量.收稿日期:2000-12-27作者簡介:何平(1967-,男,講師,碩士.基金項目:華南農(nóng)業(yè)大學(xué)校長基金資助項目(99003第22卷第3期2001年7月華南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報Journal of S outh China Agricultural University V ol.22,N o.3Jul.20012結(jié)果與分析211植酸酶野生菌的篩選從單胃動物(雞、豬的糞便垃圾堆中取濕泥進(jìn)行多次稀釋培養(yǎng),發(fā)現(xiàn)了一

7、種能自然產(chǎn)生植酸酶的菌落,對其進(jìn)行了初步提純復(fù)壯,繁殖培養(yǎng),經(jīng)鑒定確認(rèn)為青霉,如圖1所示,菌落為青綠色,有白色邊緣,四周的植酸鈣白色沉淀被分解,培養(yǎng)基呈透明,初步表明此青霉具有產(chǎn)生植酸酶的能力,挑選出有透明斑、生長旺盛的大菌落,進(jìn)行酶活性測定.212培養(yǎng)液中淀粉含量對青霉生長的影響在液體培養(yǎng)基中添加不同含量的淀粉(20、40、60、80g L -1,對青霉進(jìn)行培養(yǎng),培養(yǎng)溫度為 30,結(jié)果表明(表1:淀粉經(jīng)過高溫高壓滅菌后,晶格化被破壞,呈糊狀.培養(yǎng)液淀粉含量80g L -1時,菌液受淀粉糊化影響,粘稠搖動困難,溶解氧量少,浪費營養(yǎng).20g L -1時菌液呈水狀,溶解氧量多,但浪費發(fā)酵空間,產(chǎn)率

8、低.初步認(rèn)為培養(yǎng)液中淀粉含量為圖1產(chǎn)生植酸酶的青霉菌落Fig 11Penicillium sp.colony producing phytase40g L -1較合適,此時淀粉利用充分,產(chǎn)率高.表1培養(yǎng)基中淀粉含量對青霉生長的影響T ab 11E ffects of starch content on Penicillium sp.grow th(淀粉starch /(g L -1t (培養(yǎng)culture 36h60h5d80白色,呈稠粘的漿糊狀深紫色,呈稠粘的漿糊狀青色,呈漿糊狀,有較多的淀粉剩余60微紅色,呈稀糊狀深紫色,呈稀糊狀青色,呈稀糊狀,有少量的淀粉剩余40粉紅色,呈稀糊狀深紫色,

9、呈稀糊狀青色,菌液呈水狀,大量青霉菌落懸浮于水中,無淀粉剩余20紫紅色, 呈水狀深紫色,呈水狀青色,呈水狀,菌落稀疏,無淀粉剩余213青霉生長曲線青霉的培養(yǎng)溫度為30.從圖2看出,在培養(yǎng)初期(12h 內(nèi),青霉的生長表現(xiàn)出快速生長的趨勢,以后交替出現(xiàn)快慢快慢的動態(tài),且間隔時間為6h ,青霉生長總體呈階梯狀上升趨勢.圖2青霉生長曲線Fig.2G rowth curve of Penicillium sp.214植酸酶活性與青霉生長時間的關(guān)系從圖3可以看出隨青霉生長時間的延長,其分泌的植酸酶活性呈波浪狀變化,培養(yǎng)的第24、36、54、66h 的酶活性較高,而且是對應(yīng)發(fā)生在青霉生長的平緩期(圖2,這可

10、能是由于青霉大量產(chǎn)生植酸酶,消耗很多蛋白和能量,導(dǎo)致生長減慢.尤其在36h 出現(xiàn)了短時間的植酸酶活性高峰后,酶活性很快降低.以后呈較平緩的波浪狀變化.這種變化似可說明當(dāng)培養(yǎng)液中缺乏磷時,生產(chǎn)植酸酶的基因被激活,植酸酶大量產(chǎn)生,大量植酸被分解而產(chǎn)生大量的磷,磷不能馬上被完全利用,不斷積累的磷反而抑制植酸酶的產(chǎn)生,從而使植酸酶的活性呈一高一低的波浪狀變化.圖3植酸酶活性與青霉生長時間的關(guān)系Fig.3The relationship between phytase activity and growth time of Penicillium sp.84華南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報第22卷215培養(yǎng)液中pH 隨

11、青霉生長變化從圖4看出隨著青霉培養(yǎng)時間的延長培養(yǎng)液pH緩慢降低,最終降至2左右,在2430h 菌液pH 降低迅速.這一時段正好是在酶活性急劇增高之前,可能由于青霉在大量產(chǎn)酶前代謝旺盛,產(chǎn)生一些酸性的代謝產(chǎn)物所致 .圖4培養(yǎng)液pH 與青霉生長時間的關(guān)系Fig.4The relationship between pH of liquid medium andgrowth time of Penicillium sp.3結(jié)論在植酸酶野生菌的篩選過程中,有些菌并不分泌植酸酶,但它也能形成透明的菌斑,后來發(fā)現(xiàn)是這些菌分泌大量酸性物質(zhì),溶解植酸鈣(pH <3時開始溶解的緣故.這是初步篩選中應(yīng)注意的問

12、題.植酸酶活性隨著青霉的生長而呈波浪狀變化,當(dāng)植酸酶活性升高時,對應(yīng)時期的青霉生長就變得緩慢,這可能是由于青霉大量產(chǎn)生植酸酶,消耗很多蛋白和能量,導(dǎo)致生長減慢.植酸酶活性的變化是由什么來決定的呢?筆者在試驗中發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)液中的無機磷含量變化與植酸酶活性的變化一致,所以推測無機磷對植酸酶有反饋抑制的作用.植酸酶大量分泌前伴隨著培養(yǎng)液pH 值的急劇下降,這可能與青霉的代謝加快有關(guān),并分泌出酸性物質(zhì),或是產(chǎn)生的C O 2形成HC O -3,在生產(chǎn)上可作為一項指標(biāo),預(yù)示著植酸酶分泌高峰的到來,因為植酸酶活性的測定不僅較培養(yǎng)液pH 值的測定要復(fù)雜得多,而且需要2h 以上,不能及時預(yù)報植酸酶分泌的情況,難以及

13、時控制生產(chǎn).參考文獻(xiàn):1武素平1植酸酶在動物飼料磷營養(yǎng)中的作用J .中國飼料,1996,(10:25-26.2SH ARM A C B ,G OE L M ,IRSH AD M.My o 2inositol hexaphos 2phate as a potential inhibitor of 2amylases of different origins J .Phytochemistry ,1978,17:201-204.3U LLAH H J.Aspergillus ficuum phytase :partial primary struc 2ture ,substrate selecti

14、vity ,and kinetic characterization J .Preparative Biochem ,1988,18:459-471.4樓洪興,許堯興.植酸酶在飼料中的應(yīng)用J .中國飼料,1994,(8:16-18.5蘇基雙,梁琳,劉漢林.添加植酸酶對肉雞鈣、磷利用的研究J .中國飼料,1997,(17:5-6.6陳紅歌,苗雪霞,張世敏,等.植酸酶高產(chǎn)菌株的誘變選育J .微生物學(xué)通報,1997,24(5:272-274.The Screening of Phytase 2Producing Penicillium sp.and Studyof Its G row th R eq

15、uirementsHE Ping 1,FU Xue 2lin 2,ZH AO Y a 2hua 1,G AO X iang 2yang 1,CHE N Hai 2tao 1,X U Feng 2cai 1(1C ollege of Biotechnology ,S outh China Agric.Univ.,G uangzhou 510642,China ;2Dept.of Agronomy ,S outh China Agric.Univ.,G uangzhou 510642,China Abstract :A strain of the fungus Penicillium sp.whi

16、ch could produce phytase was is olated from a heap of m onogastricanimal feces.The optimal concentration of the starch in the penicillium (Penicillium sp.liquid medium was 40g L -1.Phytase production of the penicillium was inversely related to its growth.When the penicillium grew fast ,phytase was produced slowly and in sma