流動注射化學(xué)發(fā)光法測定氫化可的松

1、流動注射化學(xué)發(fā)光法測定氫化可的松                 作者：熊迅宇，唐玉海，王楠楠，武世界【摘要】  目的 確定以高錳酸鉀亞硫酸鈉體系測定氫化可的松的流動注射化學(xué)發(fā)光分析方法。方法 在酸性條件下，氫化可的松對高錳酸鉀亞硫酸鈉體系發(fā)光反應(yīng)具有明顯的增敏作用。據(jù)此，建立了流動注射化學(xué)發(fā)光測定氫化可的松的分析方法。結(jié)果 在優(yōu)化的實驗條件下，氫化可的松質(zhì)量濃度在1.0×10-9-1.0×10-6g/mL

2、范圍內(nèi)與發(fā)光強(qiáng)度呈良好的線性關(guān)系，檢出限(3R)為4.0×10-10g/mL，對氫化可的松進(jìn)行11次平行測定，其相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.2%。結(jié)論 本方法應(yīng)用于注射液中氫化可的松含量的測定，快速、準(zhǔn)確、簡便，靈敏度高、線性范圍寬。 【關(guān)鍵詞】  流動注射；化學(xué)發(fā)光；氫化可的松Determination of hydrocortisone by flowinjection chemiluminescenceABSTRACT: Objective  To establish a new flowinjection chemiluminescence(CL) method f

3、or the determination of hydrocortisone. Methods  In H2SO4 solution, hydrocortisone could obviously enhance the chemiluminescence intensity of the reaction of KMnO4Na2SO3 system. Based on this, a new flowinjection CL method for the determination of hydrocortisone was developed. Results  The

4、re was a good linear relationship between CL intensity and the concentration of hydrocortisone in the range of 1.0×10-9-1.0×10-6g/mL. The detection limit was 4.0×10-10g/mL at a signaltonoise ratio of 31. The RSD of 11 assays was 2.2%. Conclusion  This method can be successfully u

5、sed to determine the quantity of hydrocortisone in injection. It is rapid, accurate, simple, and has high sensitivity and wide linear range.KEY WORDS: flow injection; chemiluminescence; hydrocortisone氫化可的松(hydrocortisone, Hd)，又名可的索、皮質(zhì)醇，是腎上腺分泌的糖皮質(zhì)激素的一種，其藥理作用主要有抗炎、抗過敏和免疫抑制、抗核分裂等。臨床上主要用于腎上腺功能不全所引起的疾病、類

6、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、過敏性皮炎、角膜炎、神經(jīng)性皮炎、結(jié)核性腦膜炎等。目前，測定氫化可的松的方法主要有高效液相色譜法16、分光光度法712、旋光法1314、光譜法1516。但這些方法存在靈敏度低和操作繁瑣等不足?；瘜W(xué)發(fā)光分析法由于靈敏度高、分析速度快、方法簡便等特點(diǎn)，越來越受到人們的青睞1719。范順利等20采用鐵氰化鉀奎寧發(fā)光體系測定氫化可的松，但其靈敏度較低，方法的線性范圍和檢出限分別為5.0×10-8-5.0×10-5g/mL和2.0×10-8g/mL。本試驗發(fā)現(xiàn)，在酸性介質(zhì)中，氫化可的松對高錳酸鉀亞硫酸鈉體系有明顯的增敏作用。據(jù)此，建立了氫化可的松的流動注射化學(xué)發(fā)

7、光新方法。1  材料與方法1.1  材料  IFFLDD 流動注射化學(xué)發(fā)光分析儀系西安瑞邁電子科技有限公司產(chǎn)品。氫化可的松對照品溶液：精密稱取氫化可的松對照品(中國藥品生物制品檢驗所提供)0.0100g，用少量乙醇溶解后，用蒸餾水定容于100mL容量瓶中，即得1.0×10-4g/mL儲備液，低溫避光保存，使用時逐級稀釋至所需濃度。亞硫酸鈉溶液(5.0×10-2mol/L)：準(zhǔn)確稱取亞硫酸鈉1.5755g，用蒸餾水溶解并定容于250mL容量瓶中，得5.0×10-2mol/L溶液，新鮮配制。高錳酸鉀溶液(1.0×10-2mol/

8、L)：準(zhǔn)確稱取0.1580g KMnO4，用蒸餾水溶解并定容于100mL容量瓶中，得1.0×10-2mol/L儲備液，使用時稀釋。氫化可的松注射液為山西晉新雙鶴藥業(yè)有限責(zé)任公司產(chǎn)品，標(biāo)示量：10mg/支。試驗所用試劑均為分析純，水為二次蒸餾水。1.2  方法  流動注射化學(xué)發(fā)光儀器流路圖見圖1。流路a、b、c分別用來輸送Na2SO3溶液、樣品溶液、酸性KMnO4溶液。試驗中，樣品溶液和KMnO4溶液在三叉管M中混合，再與流路a中的Na2SO3溶液混合，發(fā)生化學(xué)發(fā)光反應(yīng)，所產(chǎn)生的化學(xué)發(fā)光信號立即被光電倍增管檢測，計算機(jī)記錄的數(shù)據(jù)利用IFFLDD型流動注射化學(xué)發(fā)光分析

9、軟件分析。按圖1所示裝置裝好流路，開啟蠕動泵，待基線穩(wěn)定后進(jìn)行測定，以相對發(fā)光強(qiáng)度I進(jìn)行定量。圖1  流動注射化學(xué)發(fā)光分析儀流路圖（略）Fig.1 Schematic diagram of the CL flow system for the determination of hydrocortisonea: Na2SO3 solution; b: Sample solution; c: KMnO4H2SO4 solution; M: Manifold; V: Six way values; P1, P2: Peristaltic pump; F: Flow cell; PMT: M

10、ultiplier phototube; HV: High voltage; COM: Computer; W: Waste solution2  結(jié)果與討論本實驗用1.0 × 106 g/mL氫化可的松對照品溶液進(jìn)行條件優(yōu)化。2.1  儀器參數(shù)的優(yōu)化  流路的選擇：考察了不同流路對化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度的影響。由于b、c管路無區(qū)別，所以只考慮a管路的情況。當(dāng)a管路分別為 Na2SO3溶液、酸性KMnO4溶液和樣品溶液，b、c管路為其他二者時，2.0×10-4mol/L KMnO41.0×10-2mol/L Na2SO31.0×10-

11、6g/mL Hd中的相對發(fā)光強(qiáng)度分別為255、42、2。因此，當(dāng)采用如圖1所示流路時，氫化可的松的相對化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度最大，且信號穩(wěn)定。故本文選擇此流路進(jìn)行分析。流路參數(shù)的選擇：蠕動泵轉(zhuǎn)速、采樣管長和閥池距都會影響反應(yīng)混合液進(jìn)入檢測器的時間，從而影響檢測器對發(fā)光信號的檢測。本試驗選擇流通管內(nèi)徑為0.8mm。結(jié)果表明，當(dāng)蠕動泵主泵轉(zhuǎn)速為30r/min，副泵轉(zhuǎn)速為35r/min，采樣管長為10cm，閥池距為10cm時，測定具有最大的信噪比。2.2  實驗條件的優(yōu)化  反應(yīng)介質(zhì)及其濃度的選擇：分別考察了以HCl、HNO3、HAc、H2SO4、H3PO4和NaOH為反應(yīng)介質(zhì)的發(fā)光強(qiáng)度。

12、在這些介質(zhì)中，2.0×10-4 mol/L KMnO41.0×10-2mol/L Na2SO31.0×10-6g/mL氫化可的松的相對發(fā)光強(qiáng)度分別為2、8、15、136、109和1。H2SO4介質(zhì)中化學(xué)發(fā)光信號最大，且信號穩(wěn)定。因此，該實驗選擇H2SO4為反應(yīng)介質(zhì)。試驗觀察到，當(dāng)H2SO4存在于Na2SO3中時，其濃度對發(fā)光無影響。所以選擇將H2SO4加入KMnO4中，對H2SO4在0.01-0.5mol/L濃度范圍進(jìn)行了考察。試驗表明，化學(xué)發(fā)光信號隨著H2SO4濃度的增加而增加，當(dāng)H2SO4濃度超過0.1mol/L時，發(fā)光信號隨H2SO4濃度變化很小?？紤]到發(fā)光

13、信號的穩(wěn)定性及H2SO4對管路的腐蝕性，我們選擇0.1mol/L的H2SO4為最佳濃度。氧化劑的選擇：試驗對高錳酸鉀、高碘酸鉀、高氯酸鉀、重鉻酸鉀等氧化劑做了考察，觀察到在KMnO4中化學(xué)發(fā)光信號最大，而在其他氧化劑中幾乎無化學(xué)發(fā)光。因此，試驗選擇KMnO4作為氧化劑。考察了KMnO4在1.0×10-4-8.0×10-4mol/L濃度內(nèi)對發(fā)光信號的影響。試驗表明，隨著KMnO4濃度的不斷增加，相對化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度也不斷增大；當(dāng)濃度增加到2.0×10-4 mol/L時，相對化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度出現(xiàn)最大值；當(dāng)濃度大于這一數(shù)值時，由于KMnO4本身顏色加深，產(chǎn)生內(nèi)濾效應(yīng)使化學(xué)發(fā)光強(qiáng)

14、度降低。因而，實驗中所選的KMnO4濃度為2.0×10-4mol/L。Na2SO3濃度的選擇：考察了5.0×10-3-0.1mol/L范圍內(nèi)不同濃度Na2SO3對化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度的影響。結(jié)果表明，隨著Na2SO3濃度的不斷增加，相對化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度也不斷增大，當(dāng)Na2SO3濃度超過1.0×10-2mol/L時，相對發(fā)光強(qiáng)度隨濃度的增大變化不大。因此，試驗中選擇1.0×10-2mol/L作為Na2SO3的最佳濃度。2.3  標(biāo)準(zhǔn)曲線、精密度及檢出限  在優(yōu)化的最佳實驗條件下按圖1所示裝置裝好流路，對氫化可的松的對照品溶液進(jìn)行逐級稀釋并測定分析，

15、以相對發(fā)光強(qiáng)度I(即樣品的化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度減去空白的強(qiáng)度)對濃度做圖。結(jié)果表明，在1.0×10-9g/mL-1.0×10-6g/mL范圍內(nèi)發(fā)光強(qiáng)度與藥物濃度呈良好的線性關(guān)系。對濃度為1.0×10-6g/mL的氫化可的松進(jìn)行11次平行測定，其相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(relative standard deviation, RSD)為2.2%。計算得氫化可的松的檢出限為4.0×10-10g/mL。為了提高檢測的精密度，標(biāo)準(zhǔn)曲線分段繪制，其相關(guān)線性參數(shù)見表1。表1  氫化可的松的標(biāo)準(zhǔn)曲線及其參數(shù)（略）Table 1  Parameters for cal

16、ibration curve and detection limit of hydrocortisone（略）I: relative CL intensity; C (concentration): ng/mL2.4  干擾實驗  在1.0×10-6g/mL的氫化可的松對照品溶液中，對實驗中可能存在的輔料以及干擾物質(zhì)進(jìn)行分析。結(jié)果表明在相對誤差為±5%條件下，1000倍的K+、Ca2+、Cl-、NO-3；200倍的Mg2+、Zn2+、CO2-3；100倍的抗壞血酸、EDTA；10倍的葡萄糖、乳糖、蔗糖不干擾測定。2.5  樣品分析 

17、取氫化可的松注射液10支，精密量取相當(dāng)于50mg的氫化可的松，用蒸餾水定容于50mL容量瓶中，配成1.0×10-3g/mL的待測溶液。精密吸取上述溶液適量，加水稀釋至工作曲線線性范圍內(nèi)，按圖1所示流路進(jìn)行測定，并采用標(biāo)準(zhǔn)加入法進(jìn)行回收率試驗，測定結(jié)果見表2。同時與藥典21方法做對比，測定結(jié)果見表3。表2  氫化可的松的回收率試驗（略）Table 2  Determination results of recovery test表3  氫化可的松注射液中氫化可的松含量的測定（略）Table 3  Determination results of hydrocortisone in pharmaceutical injections2.6  發(fā)光機(jī)理探討  氫化可的松對KMnO4Na2SO3發(fā)光反應(yīng)