一代、二代、三代測(cè)序技術(shù)

1、一代、二代、三代測(cè)序技術(shù)（2014-01-22 10:42:13）轉(zhuǎn)載 第一代測(cè)序技術(shù)-Sanger鏈終止法一代測(cè)序技術(shù)是20世紀(jì)70年代中期由Fred San ger及其同事首先發(fā)明。其基本原理是，聚 丙烯酰胺凝膠電泳能夠把長(zhǎng)度只差一個(gè)核苷酸的單鏈DNA分子區(qū)分開(kāi)來(lái)。一代測(cè)序?qū)嶒?yàn)的起始材料是均一的單鏈DNA分子。第一步是短寡聚核苷酸在每個(gè)分子的相同位置上退火，然后該寡聚核苷酸就充當(dāng)引物來(lái)合成與模板互補(bǔ)的新的DNA鏈。用雙脫氧核苷酸作為鏈終止試劑（雙脫氧核苷酸在脫氧核糖上沒(méi)有聚合酶延伸鏈所需要的3-OH基團(tuán)，所以可被用作鏈終止試劑）通過(guò)聚合酶的引物延伸產(chǎn)生一系列大小不同的分子后再進(jìn)行分離的方法

2、。測(cè)序引物與單鏈 DNA模板分子結(jié)合后，DNA聚合酶用dNTP延伸引物。延伸反應(yīng)分四組進(jìn)行， 每一組分別用四種 ddNTP （雙脫氧核苷酸）中的一種來(lái)進(jìn)行終止，再用PAGE分析四組樣品。從得到的PAGE膠上可以讀出我們需要的序列。第二代測(cè)序技術(shù)-大規(guī)模平行測(cè)序大規(guī)模平行測(cè)序平臺(tái)（massively parallel DNA sequencing platform ）的出現(xiàn)不僅令 DNA測(cè)序費(fèi)用降到了以前的百分之一，還讓基因組測(cè)序這項(xiàng)以前專屬于大型測(cè)序中心的特權(quán)”能夠被眾多研究人員分享。新一代DNA測(cè)序技術(shù)有助于人們以更低廉的價(jià)格，更全面、更深入地分析基因組、轉(zhuǎn)錄組及蛋白質(zhì)之間交互作用組的各項(xiàng)數(shù)

3、據(jù)。市面上出現(xiàn)了很多新一代測(cè)序儀產(chǎn)品，例如美國(guó)Roche Applied Science公司的454基因組測(cè)序儀、美國(guó)Illumina公司和英國(guó) Solexa tech no logy 公司合作開(kāi)發(fā)的 Illumi na 測(cè)序儀、美國(guó) Applied Biosystems 公司的 SOLiD 測(cè)序儀。Illumina/Solexa Genome Analyzer測(cè)序的基本原理是邊合成邊測(cè)序。在Sanger等測(cè)序方法的基礎(chǔ)上，通過(guò)技術(shù)創(chuàng)新，用不同顏色的熒光標(biāo)記四種不同的dNTP，當(dāng)DNA聚合酶合成互補(bǔ)鏈時(shí)，每添加一種dNTP就會(huì)釋放出不同的熒光，根據(jù)捕捉的熒光信號(hào)并經(jīng)過(guò)特 定的計(jì)算機(jī)軟件處理，從

4、而獲得待測(cè)DNA的序列信息。 以Illumina測(cè)序儀說(shuō)明二代測(cè)序的一般流程，（1 ）文庫(kù)制備，將 DNA用霧化或超聲波隨機(jī)片段化成幾百堿基或更短的小 片段。用聚合酶和外切核酸酶把DNA片段切成平末端，緊接著磷酸化并增加一個(gè)核苷酸黏性末端。然后將Illumina測(cè)序接頭與片段連接。（2）簇的創(chuàng)建，將模板分子加入芯片用于 產(chǎn)生克隆簇和測(cè)序循環(huán)。芯片有8個(gè)縱向泳道的硅基片。每個(gè)泳道內(nèi)芯片表面有無(wú)數(shù)的被固定的單鏈接頭。上述步驟得到的帶接頭的DNA片段變性成單鏈后與測(cè)序通道上的接頭引物結(jié)合形成橋狀結(jié)構(gòu)，以供后續(xù)的預(yù)擴(kuò)增使用。通過(guò)不斷循環(huán)獲得上百萬(wàn)條成簇分布的雙鏈待測(cè)片段。（3）測(cè)序，分三步：DNA聚合

5、酶結(jié)合熒光可逆終止子，熒光標(biāo)記簇成像，在下一 個(gè)循環(huán)開(kāi)始前將結(jié)合的核苷酸剪切并分解。（4）數(shù)據(jù)分析第三代測(cè)序技術(shù)-高通量、單分子測(cè)序被稱為第三代的測(cè)序的He-licos單分子測(cè)序儀，PacificBioscienee的SMRT技術(shù)和Oxford Nan opore Tech no logies公司正在研究的納米孔單分子測(cè)序技術(shù)正向著高通量低成本長(zhǎng)讀取長(zhǎng)度的方向發(fā)展。不同于第二代測(cè)序依賴于DNA模板與固體表面相結(jié)合然后邊合成邊測(cè)序，第三代分子測(cè)序，不需要進(jìn)行PCR擴(kuò)增。（1） Helico BioScienee單分子測(cè)序技術(shù)。該測(cè)序是基于邊合成邊測(cè)序的思想，將待測(cè)序列隨機(jī)打斷成小分子片段并用末端

6、轉(zhuǎn)移poly(T)的平板雜交成像來(lái)獲得已經(jīng)雜交模板所處的位置，建立邊合成邊測(cè)序的位點(diǎn)加入聚合酶和被Cy3熒光標(biāo)記脫氧核苷酸進(jìn)行DNA合成，每次只加入一種脫氧核苷酸，然后將未參與合成的dNTP和DNA聚合酶洗脫，直接對(duì) Cy3成像，觀測(cè)模板位點(diǎn)上是否有熒光信 號(hào)，然后化學(xué)裂解核苷酸上的燃料并釋放加入下一種脫氧核苷酸和聚合酶的混合物，進(jìn)行下一輪反應(yīng)。(2)Pacific BioscienceSMRTT 技術(shù)。該測(cè)序也是基于邊合成邊測(cè)序的原理， 這項(xiàng)技于使用了 Zero-ModeWaveguide(ZMW)(零級(jí)波導(dǎo))。測(cè)序的過(guò)程：被熒光標(biāo)記磷酸集 團(tuán)的核苷酸在聚合酶活性位點(diǎn)上與模板鏈結(jié)合(每種脫氧

7、核苷酸被不用顏色的染料標(biāo) 記)，被激發(fā)出熒光，在熒光脈沖結(jié)束后，被標(biāo)記的磷酸集團(tuán)被切割并釋放，聚合酶轉(zhuǎn)移到 下一個(gè)位置，下一個(gè)脫氧核苷酸連接到位點(diǎn)上開(kāi)始釋放熒光脈沖，進(jìn)行下一個(gè)循環(huán)。(3)Oxford Na nopore Tech nologies的納米孔單分子測(cè)序技術(shù)。大多數(shù)納米孔測(cè)序技術(shù)的基本原 理是當(dāng)DNA分子或者它的組成堿基從一個(gè)孔洞經(jīng)過(guò)時(shí)而檢測(cè)到被影響的電流或光信號(hào)。OxfordNanopore測(cè)序技術(shù)是以 a溶血素來(lái)構(gòu)建生物納米孔，核酸外切酶依附在孔一側(cè)的外 表面，一種合成的環(huán)糊精做為傳感器共價(jià)結(jié)合到納米孔的內(nèi)表面。這個(gè)系統(tǒng)被鑲嵌在一個(gè)脂雙分子層內(nèi)，為了提供既符合堿基區(qū)分檢測(cè)又滿足

8、外切酶活性的物理?xiàng)l件，脂雙分子層兩側(cè)為不同的鹽濃度 在適合的電壓下，核酸外切酶消化單鏈DNA，單個(gè)堿基落入孔中，并與孔內(nèi)的環(huán)糊精短暫的相互作用，影響了流過(guò)納米孔原本的電流，腺嘌呤與胸腺嘧啶的電信號(hào)大小很相近，但胸腺嘧啶在環(huán)糊精停留是時(shí)間是其他核苷酸的2-3倍，所以每個(gè)堿基都因其產(chǎn)生電流干擾振幅是特有的而被區(qū)分開(kāi)來(lái)。第一代指雙脫氧末端終止法，擴(kuò)增后通過(guò)毛細(xì)管電泳讀取序列，每次獲取數(shù)據(jù)量少第二代為高通量測(cè)序，采用微珠或高密度芯片邊合成邊測(cè)序，代表有454 , solexa , solid ,高通量，可一次獲得數(shù)G數(shù)據(jù)，相對(duì)與第三代，都仍然需要擴(kuò)增的方法放大信號(hào)，擴(kuò)增后再檢測(cè)。第三代特點(diǎn)是單分子測(cè)序

9、，多基于納米科技，無(wú)需擴(kuò)增，對(duì)單分鏈DNA/RNA直接用合成、降解、通過(guò)納米孔等方式直接測(cè)序，核心特點(diǎn)是無(wú)需擴(kuò)增所以成本更低第二代DNA測(cè)序技術(shù)編輯本詞條缺少信息欄，補(bǔ)充相關(guān)內(nèi)容使詞條更完整，還能快速升級(jí)，趕緊來(lái)編輯吧！第二代測(cè)序技術(shù)的核心思想是邊合成邊測(cè)序(Sequencing by Synthesis),即通過(guò)捕捉新合成的末端的標(biāo)記來(lái)確定DNA的序列，現(xiàn)有的技術(shù)平臺(tái)主要包括Roche/454 FLX、Illumina/Solexa Genome Analyzer禾口 Applied Biosystems SOLID system 。目錄1. 1概述2. 2基本原理3. 3操作流程概述編輯D

10、NA測(cè)序(DNA sequencing )作為一種重要的實(shí)驗(yàn)技術(shù)，在生物學(xué)研究中有著廣泛 的應(yīng)用。早在 DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)(Watson and Crick,1953) 被發(fā)現(xiàn)后不久就有人報(bào)道過(guò)DNA測(cè)序技術(shù)，但是當(dāng)時(shí)的操作流程復(fù)雜，沒(méi)能形成規(guī)模。隨后在1977年Sanger發(fā)明了具有里程碑意義的末端終止測(cè)序法，同年A.M.Maxam 和W.Gilbert發(fā)明了化學(xué)降解法。Sanger法因?yàn)榧群?jiǎn)便又快速，并經(jīng)過(guò)后續(xù)的不斷改良，成為了迄今為止DNA測(cè)序的主流。然而隨著科學(xué)的發(fā)展，傳統(tǒng)的 Sanger測(cè)序已經(jīng)不能完全滿足研究的需要，對(duì)模式生物 進(jìn)行基因組重測(cè)序以及對(duì)一些非模式生物的基因組測(cè)序，都需要

11、費(fèi)用更低、通量更高、速度更快的測(cè)序技術(shù)，第二代測(cè)序技術(shù)(Next-generation sequencing)應(yīng)運(yùn)而生。這三個(gè)技術(shù)平臺(tái)各有優(yōu)點(diǎn)，454 FLX的測(cè)序片段比較長(zhǎng)，高質(zhì)量的讀長(zhǎng)(read )能達(dá)到4OObp ； Solexa測(cè)序性價(jià)比最高，不僅機(jī)器的售價(jià)比其他兩種低，而且運(yùn)行成本也低，在數(shù)據(jù)量相同的情況下，成本只有454測(cè)序的1/10 ； SOLID測(cè)序的準(zhǔn)確度高，原始?jí)A基數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確度大于99.94%，而在15X覆蓋率時(shí)的準(zhǔn)確度可以達(dá)到99.999%，是目前第二代測(cè)序技術(shù)中準(zhǔn)確度最高的。雖然第二代測(cè)序技術(shù)的工作一般都由專業(yè)的商業(yè)公司來(lái)完成，但是了解測(cè)序原理、操作流程等會(huì)對(duì)后續(xù)的數(shù)據(jù)

12、分析有很重要的作用，下文將以Illumi na/Solexa Gen ome An alyzer 測(cè)序?yàn)槔?，?jiǎn)述第二代測(cè)序技術(shù)的基本原理、操作流程等方面。基本原理編輯Illumina/Solexa Genome Analyzer測(cè)序的基本原理是邊合成邊測(cè)序。在Sanger等測(cè)序方法的基礎(chǔ)上，通過(guò)技術(shù)創(chuàng)新，用不同顏色的熒光標(biāo)記四種不同的dNTP，當(dāng)DNA聚合酶合成互補(bǔ)鏈時(shí)，每添加一種 dNTP就會(huì)釋放出不同的熒光，根據(jù)捕捉的熒光信號(hào)并經(jīng)過(guò) 特定的計(jì)算機(jī)軟件處理，從而獲得待測(cè)DNA的序列信息。操作流程編輯1) 測(cè)序文庫(kù)的構(gòu)建(Library Co nstructio n )首先準(zhǔn)備基因組(雖然測(cè)序

13、公司要求樣品量要達(dá)到200ng，但是Gnome Analyzer系統(tǒng)所需的樣品量可低至100ng,能應(yīng)用在很多樣品有限的實(shí)驗(yàn)中)，然后將DNA隨機(jī)片段化成幾百堿基或更短的小片段，并在兩頭加上特定的接頭(Adaptor )。如果是轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，則文庫(kù)的構(gòu)建要相對(duì)麻煩些，RNA片段化之后需反轉(zhuǎn)成 cDNA，然后加上接頭，或者先將RNA反轉(zhuǎn)成cDNA，然后再片段化并加上接頭。片段的大小(Insert size )對(duì)于后面的數(shù)據(jù)分析有影響，可根據(jù)需要來(lái)選擇。 對(duì)于基因組測(cè)序 來(lái)說(shuō)，通常會(huì)選擇幾種不同的insert size , 以便在組裝(Assembly )的時(shí)候獲得更多的信息。2) 錨定橋接( Su

14、rface Attachment and Bridge Amplification)Solexa測(cè)序的反應(yīng)在叫做 flow cell的玻璃管中進(jìn)行，flow cell又被細(xì)分成8個(gè)Lane， 每個(gè)Lane的內(nèi)表面有無(wú)數(shù)的被固定的單鏈接頭。上述步驟得到的帶接頭的DNA片段變性成單鏈后與測(cè)序通道上的接頭 引物結(jié)合形成橋狀結(jié)構(gòu)，以供后續(xù)的預(yù)擴(kuò)增使用。3) 預(yù)擴(kuò)增(Denaturation and Complete Amplification)添加未標(biāo)記的dNTP和普通Taq酶進(jìn)行固相橋式 PCR擴(kuò)增，單鏈橋型待測(cè)片段被擴(kuò) 增成為雙鏈橋型片段。通過(guò)變性，釋放出互補(bǔ)的單鏈，錨定到附近的固相表面。通過(guò)不斷

15、循 環(huán)，將會(huì)在Flow cell的固相表面上獲得上百萬(wàn)條成簇分布的雙鏈待測(cè)片段。4) 單堿基延伸測(cè)序(Single Base Extension and Sequencing)在測(cè)序的flow cell中加入四種熒光標(biāo)記的 dNTP、DNA聚合酶以及接頭引物進(jìn)行擴(kuò)增， 在每一個(gè)測(cè)序簇延伸 互補(bǔ)鏈時(shí)，每加入一個(gè)被熒光標(biāo)記的dNTP就能釋放出相對(duì)應(yīng)的熒光，測(cè)序儀通過(guò)捕獲熒光信號(hào)，并通過(guò)計(jì)算機(jī)軟件將光信號(hào)轉(zhuǎn)化為測(cè)序峰，從而獲得待測(cè)片段的序列信息。從熒光信號(hào)獲取待測(cè)片段的序列信息的過(guò)程叫做Base Calling ，Illumina公司Base Calling 所用的軟件是 Illumina s Genome Analyzer Sequencing Control Software and Pipeli ne An alysis