邊做邊學(xué)目的DNA片段的體外擴增

1、課題2 多聚酶鏈式反應(yīng)擴增DNA片段1、 情景建構(gòu)DNA指紋法在案件偵破中有重要作用，刑偵人員通過案發(fā)現(xiàn)場的血液、頭發(fā)等樣品中提取的DNA，與犯罪嫌疑人的DNA進行比較，就由可能為案件的偵破提供證據(jù)。犯罪嫌疑人留在現(xiàn)場的樣品一般都是極少量的，刑偵人員要怎樣才能得到足夠量的DNA呢？2、 基礎(chǔ)知識引導(dǎo)（一）細胞內(nèi)DNA復(fù)制條件分析條件組分作用模板DNA的兩條單鏈提供復(fù)制的模板原料四種脫氧核苷酸合成DNA子鏈的原料酶解旋酶DNA聚合酶打開DNA雙螺旋催化合成DNA子鏈能量ATP為解螺旋和合成子鏈供能引物RNA為DNA聚合酶提供合成的3端起點（二）細胞內(nèi)DNA復(fù)制過程1、DNA的反向平行結(jié)構(gòu)：（1）

2、核苷酸分子的結(jié)構(gòu)與方向性：（2）DNA分子的平面結(jié)構(gòu)：2、DNA聚合酶的特性：DNA聚合酶不能從頭開始合成DNA，而只能從3端延伸DNA鏈。因此，DNA復(fù)制需要引物。3、DNA合成的方向：53合成（三）PCR的原理1、DNA 分子的熱變性原理：2、體外DNA復(fù)制的條件（PCR 反應(yīng)的條件）DNA模板；四種脫氧核苷酸；兩種引物：分別與兩條模板鏈相結(jié)合；耐高溫的聚合酶（不需解旋酶）；緩沖液：模擬核基質(zhì)，維持pH基本不變；溫控設(shè)備：嚴格控制溫度（PCR儀）。3、PCR的反應(yīng)過程（1）三個基本步驟變性、復(fù)性和延伸。（2）反應(yīng)循環(huán)數(shù)：2530。（3）擴增倍數(shù)：106109。第一輪反應(yīng)：4、循環(huán)特點上一次

3、循環(huán)的產(chǎn)物為下一循環(huán)的模板；子代DNA中只有2個DNA含有最初母鏈的一條；其它子代DNA分子都為雙引物形式；處于兩引物之間的DNA序列呈指數(shù)增長1×2N。二、實驗操作1、PCR反應(yīng)體系：緩沖液、DNA模板，四種脫氧核苷酸原料、熱穩(wěn)定DNA聚合酶、兩種RNA引物，水。2、操作步驟（準備）按配方將所需試劑擺放在實驗桌上；（移液）用微量移液器按配方在微量離心管中依次加入各組分；（混合）蓋嚴離心管口的蓋子，用手指輕輕彈擊管壁；（離心）將微量離心管放在離心機上；（反應(yīng)）將離心管放入PCR儀上，設(shè)置好PCR儀的循環(huán)程序。三、操作提示1、避免外源DNA污染：所用儀器、緩沖液、蒸餾水等使用前高壓滅菌

4、。2、緩沖液和酶分裝成小份，20低溫保存。使用前，將所需試劑從冰箱拿出，放在冰塊上緩慢融化。3、在微量離心管中添加反應(yīng)成分時，每吸取一種試劑后，移液器上的槍頭都必須更換。所有的成分都加入后，蓋嚴離心管口的蓋子，用手指輕輕彈擊管的側(cè)壁，使反應(yīng)液混合均勻，再將微量離心管放在離心機上，離心約10s，使反應(yīng)液集中在離心管底部，再放入PCR儀中進行反應(yīng)。目的：避免外源性DNA大量擴增造成假陽性反應(yīng)。四、結(jié)果分析與評價1、DNA含量的測定原理：DNA在260nm的紫外線波段有一強烈的吸收峰。可以利用DNA的這一特點進行DNA含量的測定。2、具體方法將樣品進行50倍稀釋：取2LPCR反應(yīng)液，加入98L蒸餾水

5、。以蒸餾水作為空白對照，在波長260nm處，將紫外分光光度計的讀數(shù)調(diào)節(jié)至零。加入步驟1中的DNA稀釋液100L至比色杯中，測定260nm處的光吸收值。根據(jù)下面的公式計算DNA含量：DNA含量（g/ml）=50 ×（260nm的讀數(shù)）×稀釋倍數(shù)課堂小結(jié)：三、課堂演練一選擇題（10個）1DNA分子復(fù)制時，解旋的兩條鏈中（ ）A僅一條作為復(fù)制模板 B兩條鏈作為模板并復(fù)制出兩個不同的DNA分子C兩條鏈作為模板并復(fù)制出兩個相同的DNA分子D兩條鏈作為模板，各自合成一條子鏈，然后兩條母鏈重新結(jié)合為原來的雙螺旋分子，兩條新鏈結(jié)合成一個全新的DNA分子2.下列關(guān)于DNA復(fù)制過程的正確順序是

6、（ ）互補堿基對之間氫鍵斷裂互補堿基對之間形成氫鍵DNA分子在解旋酶的作用下解旋以解旋后的母鏈為模板進行堿基互補配對子鏈與母鏈盤旋成雙螺旋狀結(jié)構(gòu)A B C D3.下列各項過程中，遵循“堿基互補配對原則”的有（ ）DNA復(fù)制RNA復(fù)制轉(zhuǎn)錄翻譯逆轉(zhuǎn)錄A B C D4.實驗室內(nèi)模擬生物體DNA的復(fù)制必需的一組條件是（ ）酶游離的脫氧核苷酸ATPDNA分子mRNAtRNA適宜的溫度適宜的酸堿度A B C D5.利用PCR技術(shù)，把一個雙鏈DNA分子當(dāng)作第一代，經(jīng)過3次循環(huán)，在第四代DNA分子中，有幾條第一代脫氧核苷酸的長鏈？（ ）A 2 B 4 C 8 D 16，6.關(guān)于DNA分子的敘述中，正確的是（

7、）A .DNA的兩條鏈是極性相同，同向平行 B.DNA的兩條鏈是極性相同，反向平行C.DNA的兩條鏈中極性不同，反向平行的 D.DNA的兩條鏈是極性不同，同向平行7.假設(shè)PCR反應(yīng)中，只有一個DNA的片段作為模板，請計算在30次循環(huán)后，反應(yīng)物中大約有多少這樣的DNA片段（ ）A 215 B 230 C 260 D 2318.DNA的合成方向總是（ ）延伸。A從DNA分子的左端向右端 B從DNA分子的右端向左端C從子鏈的5，端向3，端 D從子鏈的3，端向5，端9.要使PCR反應(yīng)在體外的條件下順利地進行，需要嚴格的控制（ ）A 氧氣的濃度 B酸堿度 C溫度 D 大氣的濕度10.DNA分子經(jīng)PCR反

8、應(yīng)循環(huán)一次后，新合成的那條子鏈的脫氧核苷酸的序列應(yīng)與（ ）A模板母鏈相同 B非模板母鏈相同 C兩條模板母鏈相同 D兩條模板母鏈都不相同二非選擇題（2個）1PCR技術(shù)是把某一DNA片段在實驗條件下，合成許許多多相同片段的一種方法，利用這種技術(shù)能快速而特異的擴增任何要求的目的基因或者DNA分子片段，“人類基因組計劃”的研究中常用到這種技術(shù)。請結(jié)合有關(guān)知識，回答有關(guān)此技術(shù)的一些問題：PCR技術(shù)能把某一DNA片段進行擴增，依據(jù)的原理是： 在實驗條件下，DNA分子進行擴增，除了所要擴增的DNA片段處，還需要 、和 、 等條件。某DNA片段有160個堿基，其中有腺嘌呤35個，若讓該DNA分子擴增三次（即復(fù)制三次）至少需要腺嘌呤脫氧核苷酸和鳥嘌呤脫氧核苷酸的數(shù)目分別是 和 個。2將大腸桿菌置于含15N的培養(yǎng)基上培養(yǎng)。這樣，后代大腸桿菌細胞中的DNA雙鏈均被15N標記。然后將被15N標記的大腸桿菌作為親代轉(zhuǎn)到普通培養(yǎng)基中，繁殖兩代。親代、第一代、第二代大腸桿菌DNA的狀況如圖所示。第一代大腸桿菌DNA貯存的遺傳信息與親代大腸桿