高分辨率光學(xué)顯微術(shù)在生命科學(xué)中的應(yīng)用

1、高分辨率光學(xué)顯微術(shù)在生命科學(xué)中的應(yīng)用     【摘要】  提高光學(xué)顯微鏡分辨率的研究主要集中在兩個方面進(jìn)行，一是利用經(jīng)典方法提高各種條件下的空間分辨率，如用于厚樣品研究的SPIM技術(shù)，用于快速測量的SHG技術(shù)以及用于活細(xì)胞研究的MPM技術(shù)等。二是將最新的非線性技術(shù)與高數(shù)值孔徑測量技術(shù)（如STED和SSIM技術(shù)）相結(jié)合。生物科學(xué)研究離不開超高分辨率顯微術(shù)的技術(shù)支撐，人們迫切需要更新顯微術(shù)來適應(yīng)時代發(fā)展的要求。近年來研究表明，光學(xué)顯微鏡的分辨率已經(jīng)成功突破200nm橫向分辨率和400nm軸向分辨率的衍射極限。高分辨率乃至超高分辨率光學(xué)顯微術(shù)的發(fā)展不

2、僅在于技術(shù)本身的進(jìn)步，而且它將會極大促進(jìn)生物樣品的研究，為亞細(xì)胞級和分子水平的研究提供新的手段。 【關(guān)鍵詞】  光學(xué)顯微鏡；高分辨率；非線性技術(shù)；納米水平在生物學(xué)發(fā)展的歷程中顯微鏡技術(shù)的作用至關(guān)重要，尤其是早期顯微術(shù)領(lǐng)域的某些重要發(fā)現(xiàn)，直接促成了細(xì)胞生物學(xué)及其相關(guān)學(xué)科的突破性發(fā)展。對固定樣品和活體樣品的生物結(jié)構(gòu)和過程的觀察，使得光學(xué)顯微鏡成為絕大多數(shù)生命科學(xué)研究的必備儀器。隨著生命科學(xué)的研究由整個物種發(fā)展到分子水平，顯微鏡的空間分辨率及鑒別精微細(xì)節(jié)的能力已經(jīng)成為一個非常關(guān)鍵的技術(shù)問題。光學(xué)顯微鏡的發(fā)展史就是人類不斷挑戰(zhàn)分辨率極限的歷史。在400760nm的可見光范圍內(nèi)，顯微鏡的分辨極

3、限大約是光波的半個波長，約為200nm，而最新取得的研究成果所能達(dá)到的極限值為2030nm。本文主要從高分辨率三維顯微術(shù)和高分辨率表面顯微術(shù)兩個方面，綜述高分辨率光學(xué)顯微鏡的各種技術(shù)原理以及近年來在突破光的衍射極限方面所取得的研究進(jìn)展。1   傳統(tǒng)光學(xué)顯微鏡的分辨率光學(xué)顯微鏡圖像的大小主要取決于光線的波長和顯微鏡物鏡的有限尺寸。類似點源的物體在像空間的亮度分布稱為光學(xué)系統(tǒng)的點擴散函數(shù)(point spread function, PSF)。因為光學(xué)系統(tǒng)的特點和發(fā)射光的性質(zhì)決定了光學(xué)顯微鏡不是真正意義上的線性移不變系統(tǒng)，所以PSF通常在垂直于光軸的x-y平面上呈徑向?qū)ΨQ分布，

4、但沿z光軸方向具有明顯的擴展。由Rayleigh判據(jù)可知，兩點間能夠分辨的最小間距大約等于PSF的寬度。根據(jù)Rayleigh判據(jù)，傳統(tǒng)光學(xué)顯微鏡的分辨率極限由以下公式表示1：橫向分辨率(x-y平面)：dx，y=軸向分辨率(沿z光軸)：dz=可見，光學(xué)顯微鏡分辨率的提高受到光波波長和顯微鏡的數(shù)值孔徑N.A等因素的制約；PSF越窄，光學(xué)成像系統(tǒng)的分辨率就越高。為提高分辨率，可通過以下兩個途徑：（1）選擇更短的波長；（2）為提高數(shù)值孔徑, 用折射率很高的材料。Rayleigh判據(jù)是建立在傳播波的假設(shè)上的，若能夠探測非輻射場，就有可能突破Rayleigh判據(jù)關(guān)于衍射壁壘的限制。2  

5、; 高分辨率三維顯微術(shù)在提高光學(xué)顯微鏡分辨率的研究中，顯微鏡物鏡的像差和色差校正具有非常重要的意義。從一般的透鏡組合方式到利用光闌限制非近軸光線，從穩(wěn)定消色差到復(fù)消色差再到超消色差，都明顯提高了光學(xué)顯微鏡的成像質(zhì)量。最近Kam等2和Booth等3應(yīng)用自適應(yīng)光學(xué)原理，在顯微鏡像差校正方面進(jìn)行了相關(guān)研究。自適應(yīng)光學(xué)系統(tǒng)由波前傳感器、可變形透鏡、計算機、控制硬件和特定的軟件組成，用于連續(xù)測量顯微鏡系統(tǒng)的像差并進(jìn)行自動校正。一般可將現(xiàn)有的高分辨率三維顯微術(shù)分為3類：共聚焦與去卷積顯微術(shù)、干涉成像顯微術(shù)和非線性顯微術(shù)。2.1   共聚焦顯微術(shù)與去卷積顯微術(shù)   解

6、決厚的生物樣品顯微成像較為成熟的方法是使用共聚焦顯微術(shù)(confocal microscopy) 4和三維去卷積顯微術(shù)(three-dimensional deconvolution microscopy, 3-DDM) 5，它們都能在無需制備樣品物理切片的前提下，僅利用光學(xué)切片就獲得樣品的三維熒光顯微圖像。共聚焦顯微術(shù)的主要特點是，通過應(yīng)用探測針孔去除非共焦平面熒光目標(biāo)產(chǎn)生的熒光來改善圖像反差。共聚焦顯微鏡的PSF與常規(guī)顯微鏡的PSF呈平方關(guān)系，分辨率的改善約為倍。為獲得滿意的圖像，三維共聚焦技術(shù)常需使用高強度的激發(fā)光，從而導(dǎo)致染料漂白，對活生物樣品產(chǎn)生光毒性。加之結(jié)構(gòu)復(fù)雜、價格昂貴，從而使

7、應(yīng)用在一定程度上受到了限制。3-DDM采用軟件方式處理整個光學(xué)切片序列，與共聚焦顯微鏡相比，該技術(shù)采用低強度激發(fā)光，減少了光漂白和光毒性，適合對活生物樣品進(jìn)行較長時間的研究。利用科學(xué)級冷卻型CCD傳感器同時探測焦平面與鄰近離焦平面的光子，具有寬的動態(tài)范圍和較長的可曝光時間，提高了光學(xué)效率和圖像信噪比。3-DDM拓展了傳統(tǒng)寬場熒光顯微鏡的應(yīng)用領(lǐng)域受到生命科學(xué)領(lǐng)域的廣泛關(guān)注6。2.2   選擇性平面照明顯微術(shù)   針對較大的活生物樣品對光的吸收和散射特性，Huisken7等開發(fā)了選擇性平面照明顯微術(shù)(selective plane illumination

8、microscopy，SPIM)。與通常需要將樣品切割并固定在載玻片上的方式不同，SPIM能在一種近似自然的狀態(tài)下觀察23mm的較大活生物樣品。SPIM通過柱面透鏡和薄型光學(xué)窗口形成超薄層光，移動樣品獲得超薄層照明下切片圖像，還可通過可旋轉(zhuǎn)載物臺對樣品以不同的觀察角度掃描成像，從而實現(xiàn)高質(zhì)量的三維圖像重建。因為使用超薄層光，SPIM降低了光線對活生物樣品造成的損傷，使完整的樣品可繼續(xù)存活生長，這是目前其他光學(xué)顯微術(shù)無法實現(xiàn)的。SPIM技術(shù)的出現(xiàn)為觀察較大活樣品的瞬間生物現(xiàn)象提供了合適的顯微工具，對于發(fā)育生物學(xué)研究和觀察細(xì)胞的三維結(jié)構(gòu)具有特別意義。2.3   結(jié)構(gòu)照明技術(shù)和干

9、涉成像   當(dāng)熒光顯微鏡以高數(shù)值孔徑的物鏡對較厚生物樣品成像時，采用光學(xué)切片是一種獲得高分辨3D數(shù)據(jù)的理想方法，包括共聚焦顯微鏡、3D去卷積顯微鏡和Nipkow 盤顯微鏡等。1997年由Neil等報道的基于結(jié)構(gòu)照明的顯微術(shù)，是一種利用常規(guī)熒光顯微鏡實現(xiàn)光學(xué)切片的新技術(shù)，并可獲得與共聚焦顯微鏡一樣的軸向分辨率。干涉成像技術(shù)在光學(xué)顯微鏡方面的應(yīng)用1993年最早由Lanni等提出，隨著I5M、HELM和4Pi顯微鏡技術(shù)的應(yīng)用得到了進(jìn)一步發(fā)展。與常規(guī)熒光顯微鏡所觀察的熒光相比，干涉成像技術(shù)所記錄的發(fā)射熒光攜帶了更高分辨率的信息。（1）結(jié)構(gòu)照明技術(shù)：結(jié)合了特殊設(shè)計的硬件系統(tǒng)與軟件系統(tǒng)

10、，硬件包括內(nèi)含柵格結(jié)構(gòu)的滑板及其控制器，軟件實現(xiàn)對硬件系統(tǒng)的控制和圖像計算。為產(chǎn)生光學(xué)切片，利用CCD采集根據(jù)柵格線的不同位置所對應(yīng)的原始投影圖像，通過軟件計算，獲得不含非在焦平面雜散熒光的清晰圖像，同時圖像的反差和銳利度得到了明顯改善。利用結(jié)構(gòu)照明的光學(xué)切片技術(shù)，解決了2D和3D熒光成像中獲得光學(xué)切片的非在焦平面雜散熒光的干擾、費時的重建以及長時間的計算等問題。結(jié)構(gòu)照明技術(shù)的光學(xué)切片厚度可達(dá)0.01nm，軸向分辨率較常規(guī)熒光顯微鏡提高2倍，3D成像速度較共聚焦顯微鏡提高3倍。（2）4Pi 顯微鏡：基于干涉原理的4Pi顯微鏡是共聚焦/雙光子顯微鏡技術(shù)的擴展。4Pi顯微鏡在標(biāo)本的前、后方各設(shè)置1

11、個具有公共焦點的物鏡，通過3種方式獲得高分辨率的成像：樣品由兩個波前產(chǎn)生的干涉光照明；探測器探測2個發(fā)射波前產(chǎn)生的干涉光；照明和探測波前均為干涉光。4Pi顯微鏡利用激光作為共聚焦模式中的照明光源，可以給出小于100nm的空間橫向分辨率，軸向分辨率比共聚焦熒光顯微鏡技術(shù)提高47倍。利用4Pi顯微鏡技術(shù)，能夠?qū)崿F(xiàn)活細(xì)胞的超高分辨率成像。Egner等8，9利用多束平行光束和1個雙光子裝置，觀測活細(xì)胞體內(nèi)的線粒體和高爾基體等細(xì)胞器的精微細(xì)節(jié)。Carl10首次應(yīng)用4Pi顯微鏡對哺乳動物HEK293細(xì)胞的細(xì)胞膜上Kir2.1離子通道類別進(jìn)行了測量。研究表明，4Pi顯微鏡可用于對細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)納米級分辨率的形態(tài)學(xué)研究。（3）成像干涉顯微鏡(image interference microscopy, I2M)：使用2個高數(shù)值孔徑的物鏡以及光束分離器，收集相同焦平面上的熒光圖像，并使它們在CCD平面上產(chǎn)生干涉。1996年Gustaffson等用這樣的雙