大黃蟲丸經(jīng)旁分泌途徑對早期肝纖維化的干預作用

1、大黃蟲丸經(jīng)旁分泌途徑對早期肝纖維化的干預作用         作者：成家茂，潘志恒，謝瑤，何宏文，曲懷剛 【摘要】 目的觀察大黃蟲丸經(jīng)旁分泌途徑對大鼠肝星狀細胞增殖及其表達TGF-1 基因的影響。 方法采用Nycodenz 分離液非連續(xù)密度梯度離心法同步分離急性CCl4 損傷模型大鼠和正常大鼠肝的枯否細胞（KC）和星狀細胞（HSC）。                &

2、#160;        作者：成家茂，潘志恒，謝瑤，何宏文，曲懷剛【摘要】  目的觀察大黃蟲丸經(jīng)旁分泌途徑對大鼠肝星狀細胞增殖及其表達TGF-1 基因的影響。方法采用Nycodenz 分離液非連續(xù)密度梯度離心法同步分離急性CCl4 損傷模型大鼠和正常大鼠肝的枯否細胞（KC）和星狀細胞（HSC）。在制備正常鼠血清和大黃蟲丸藥物血清的基礎上，將它們分別加入KC 培養(yǎng)板內(nèi)作用48 h 后制備成正常鼠KC 條件培養(yǎng)液（NKCCM）和損傷鼠KC 條件培養(yǎng)液（KCCM）。將NKCCM 和KCCM 作用于活化的HSC 24 h

3、 后，采用MTT 法和3H-TdR 摻入法檢測HSC 增殖的變化；采用半定量RT-PCR 法擴增TGF-1 mRNA 以檢測HSC 表達TGF-1 基因的情況。結果旁分泌組各組的HSC 增殖幅度及TGF-1 基因的相對表達量較正常對照組NKCCM 組均明顯增加（P0.05或0.01）。同時旁分泌組中，含藥血清作用的5%，10%和20% KCCM 組較無藥物血清作用的0% KCCM 組HSC 的增殖能力及TGF-1 基因的相對表達量則下降，且隨藥物濃度的升高逐漸降低，其組間差別有統(tǒng)計學意義（P0.05或P0.01）。結論大黃蟲丸可明顯抑制經(jīng)旁分泌途徑活化的大鼠HSC 的增殖及TGF-1 基因的表

4、達，且其抗肝纖維化效應與藥物劑量間存在一定的依賴關系。 【關鍵詞】  大黃蟲丸肝纖維化 肝星狀細胞旁分泌Abstract：ObjectiveTo observe the effects of Dahuang Zhechong Pill on the proliferation of rat hepatic stellate cells(HSCs) activated by paracrine pathway and the expression of transforming growth factor-beta 1(TGF-1) gene.MethodsThe CCl4-injur

5、ed and normal rat Kupffer cells(KCs), hepatic stellate cells were separated by non-continuous density gradient centrifugation of Nycodenz medium. After the common rat and the drug sera prepared, they were added respectively into Kupffer cell culture plates for normal Kupffer cells conditioned medium

6、(NKCCM) and injured rat Kupffer cells conditioned medium(KCCM) after 48 h. We observed the changes of proliferative HSCs by the methods of MTT and 3H-thymidine(3H-TdR) incorporation assay, and the expression of TGF-1 gene in HSCs by semi-quantitative RT-PCR when HSCs were actived for 24 h by those c

7、onditioned medium.ResultsIn all paracrine groups, the multiplication of HSCs and the relative expression of TGF-1 gene were increased markedly compared to normal control group(P0.05 or P0.01), and gradually decreased in all drug and no drug serum groups with elevated drug concentration.There had sig

8、nificant diferences among all groups.ConclusionDahuang Zhechong Pill can obviously inhibit the proliferation of rat HSCs activated by paracrine pathway and the expression of TGF-1 gene in HSCs and deerease hepatic fibrosis in  a concentration-dependent manner.Key words： Dahuang Zhechong Pill;&#

9、160;  Liver fibrosis;   Hepatic stellate cell;  Paracrine     肝纖維化是從各型慢性肝病轉化為肝硬化的一個重要病變過程，有效逆轉肝纖維化已成為防治肝硬化的重要手段。它是一個伴隨肝內(nèi)細胞外基質(zhì)（ECM）增多和沉積的瘢痕化過程，在細胞和分子水平上以HSC 的活化、轉化生長因子1 （transforming growth factor-beta 1，TGF-1）及其下游細胞調(diào)節(jié)因子活性異常為主要特征1。因此，抑制HSC活化和減少肝組織內(nèi)TGF-1 的表達是逆轉肝纖維化的中

10、心環(huán)節(jié)。大黃蟲丸（DHZCW）具有緩中補虛、活血化瘀、通絡軟堅等功效，以往的臨床和實驗研究表明該藥在防治肝纖維化方面效果明顯2，3。本實驗擬觀察大黃蟲丸對CCl4 損傷大鼠肝組織內(nèi)經(jīng)旁分泌途徑活化的星狀細胞（HSC ）的增殖和TGF-1 基因表達情況的影響，進一步探討該藥抗肝纖維化的作用機制。1  材料與儀器1.1  動物雄性Sprague Dawley（SD）大鼠，SPF 級，體質(zhì)量400500 g，均由中山大學中山醫(yī)學院實驗動物中心提供，普通飼料和普通飲水飼養(yǎng)。實驗前禁食12 h。1.2  HSC 細胞株由北京大學人民醫(yī)院肝膽外科中心魏玉華老師惠贈。1.3&#

11、160; 藥物大黃蟲丸藥粉為暗紫色粉末，由廣東陽江制藥廠惠贈。1.4  試劑和儀器鏈霉蛋白酶E（Pronase E）、型膠原酶（Type collagenase）、DNase I、胰蛋白酶（Trypsine）、Nycodenz 原液、噻唑藍（MTT）均購自Sigma 公司；四氯化碳（CCl4）、高純度瓊脂糖、核酸染料等生化試劑購自上海生物工程有限公司；M199 培養(yǎng)液（標準型）、DMEM 干粉均購自Invitrogen 公司產(chǎn)品；標準胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）購自杭州四季青生物制品公司；總RNA提取試劑（RNAiso Reagent）、RT-PCR試劑盒

12、（TaKaRa RNA PCR Kit (AMV) Ver. 3.0）及100 bp DNA Markers 均購自寶生物工程（大連）有限公司；引物由上海英駿生物技術有限公司合成；氚-胸腺嘧啶核苷（3H-TdR）購自中國科學院上海原子核研究所等。OLYMPUS CX31 型倒置相差顯微鏡（OLYMPUS 公司）；Heraeus Biofuge 15R型臺式高速冷凍離心機（德國Heraeus 公司）；Heraeus BB16 型CO2 恒溫培養(yǎng)箱（德國Heraeus 公司）；SDJ-SP 三相單人水平層流潔凈工作臺（上海淀山湖凈化廠）；FJ - 211G 雙道液體閃爍儀（西安二六二廠產(chǎn)品）；Bi

13、o-Tek EL×800型全自動酶標儀（美國Bio-Tek 公司產(chǎn)品）；POWER-PAC300 型電泳儀（美國BIO-RAD 公司產(chǎn)品）；MJ PTC-100TM 型PCR 儀（美國MJ Rearch 公司產(chǎn)品）； BIO-MATE 5 型紫外可見光分光光度計（BIO-MATE 日本公司生產(chǎn)）等。2 方法2.1  含藥血清及正常鼠血清的制備參考文獻方法4給予SD 大鼠灌胃服用大黃蟲丸藥粉（每只每天2.7 g）。將上述藥粉用超純水溶解，每天分兩次灌胃給藥，4 ml/次，連續(xù)給藥5 d。空白對照組為正常大鼠組，灌胃等量超純水。采血時間為末次灌胃后1 h，以乙醚麻醉大鼠，無菌狀

14、態(tài)下打開大鼠心臟，經(jīng)右心房抽血，2 000 r/min 離心15 min，血清經(jīng)56滅活30 min 后置于-20冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆谩?.2  造模采用SD 雄性大鼠，皮下注射50% CCl4 5 ml/kg （與植物油按11比例混合），5 d 后分離KC。2.3  KC 的分離參考文獻5 并改進，分離培養(yǎng)損傷模型鼠和正常鼠的KC，臺盼藍染色法檢測細胞活性，碳素墨汁吞噬實驗鑒定細胞。正常大鼠的細胞得率為0.5×1071.0×107 /肝，損傷模型鼠的細胞得率為1.0×107 1.5×107/肝,純度均90%。2.4  HSC 細

15、胞株的培養(yǎng)以5×103 cells/cm2接種于50 ml 培養(yǎng)瓶內(nèi)，加入含10% FBS 的M199 培養(yǎng)液，每3 天左右鋪滿單層后傳代。2.5  條件培養(yǎng)液（CM）制備正常鼠KC 條件培養(yǎng)液（NKCCM）的制備：參考文獻6 并改進。KC 以1×105 cells/cm2 密度接種于6 孔培養(yǎng)板，培養(yǎng)48 h 后吸棄培養(yǎng)液，再加入含20% 正常鼠血清的DMEM 培養(yǎng)液3 ml 繼續(xù)培養(yǎng)，24 h 后收集上清液，0.22 m 微孔濾膜過濾，記為NKCCM。同樣方法48 h 后再收集1次，兩次的NKCCM 混合，置于-70 冰箱中保存?zhèn)溆?。損傷鼠KC 條件培養(yǎng)液（K

16、CCM）的制備：方法同上，但加入的血清為藥物血清，濃度分別為含0% （0% 藥物血清+ 20% 正常鼠血清），5% （5% 藥物血清+ 15% 正常鼠血清），10% （10% 藥物血清+ 10% 正常鼠血清）和20% （20% 藥物血清，無正常鼠血清），收集的上清液分別記為0%，5%，10%和20% KCCM。2.6  實驗分組對照組：將HSC 細胞株接種于培養(yǎng)板培養(yǎng)24 h 后，棄去培養(yǎng)液，加入NKCCM，作用于HSC 24 h后即可檢測。旁分泌組：包括0%，5%，10%，20% KCCM組共4組。加入CM 方法同對照組。2.7  活化HSC 增殖的檢測采用MTT 法和3

17、H-TdR 摻入法檢測。MTT 法：稱取125 mg MTT放入小燒杯中，加25 ml PBS（0.01 mol/L，pH 7.4）攪拌15 min，用0.22 m 的微孔濾器除菌，分裝后4 避光保存?zhèn)溆谩仢M單層的HSC用0.25% 胰酶消化后，以103 cells /孔密度接種于96 孔板中。培養(yǎng)24 h 后，吸棄上清，分別加入NKCCM，0%，5%，10%，20% KCCM 各200 l（每組設3 個復孔，用不同批次的CM 重復實驗3 次）。繼續(xù)培養(yǎng)至20 h后，每孔加入MTT 溶液（5 mg/m1）20 l，孵育4 h棄上清液，PBS 洗滌，然后每孔加入200 l DMSO，小心振蕩

18、10 min，使結晶物充分溶解。選擇570 nm 波長，以酶標儀檢測各孔OD 值。3H-TdR 摻入法：將HSC以104 cells /孔密度接種于24 孔板中，培養(yǎng)24 h后吸棄培養(yǎng)液，再加入CM （方法同上），液體總量為500 l/孔。培養(yǎng)至20 h 后，再每孔加入0.5 Ci/l00 l 的3H-TdR，繼續(xù)培養(yǎng)4 h 后吸棄上清，胰酶消化，洗滌，超速離心過濾后將細胞收集于玻璃纖維濾膜上，在60 恒溫干燥箱內(nèi)放置30 min 烘干，移至測量管內(nèi)，用液閃計數(shù)儀測定每孔HSC的放射活性即每分鐘脈沖數(shù)值（cpm 值）。2.8  活化HSC 表達TGF-1 mRNA 的檢測采用半定量R

19、T-PCR 兩步法和瓊脂糖凝膠電泳實驗檢測。以-Actin 為內(nèi)參照，以GenBank 庫內(nèi)TGF-1 的最新mRNA 序列為準，同源比較后使用軟件Primer Premier 5.0 設計引物并合成引物序列：TGF-1 的上游引物為5'- CCGCAACAACGCAATCTATG-3'，下游引物為5'- AGCCCTGTATTCCGTCTCCTT -3'，產(chǎn)物片斷長度為305 bp；參照文獻7設計合成-Actin 引物：上游引物為5'-GGCATCCTGACCCTGAAGTA-3'，下游引物為5'-GCCGATAGTGATGACCTGACC-3'，產(chǎn)物片斷長度為565 bp。實驗前將HSC以106 cells /孔密度接種于6 孔板中，培養(yǎng)24 h后吸棄培養(yǎng)液，加入CM（方法同上，液體總量為1.5 ml）。繼續(xù)培養(yǎng)24 h 后吸棄CM，PBS 洗滌，加入RNAiso 試劑（1