肺炎衣原體抗體的制備及應(yīng)用

1、肺炎衣原體抗體的制備及應(yīng)用              作者：王衛(wèi)群 張瑞華 余竹元【摘要】  目的  肺炎衣原體抗體(Cpn-PcAb)的制備及應(yīng)用。方法  用10l Cpn菌株TW-183(2×108ifu)與300l福氏完全佐劑混勻后皮下多點(diǎn)注射新西蘭白兔。雙向瓊脂擴(kuò)散法鑒定血清抗體的效價(jià)為164，用硫酸銨鹽析法、DEAE-Sephadex-50層析法純化免疫球蛋白(IgG)，然后用異硫氰酸熒光素(FITG)標(biāo)記IgG。用

2、Cpn-PcAb與美國(guó)進(jìn)口Cpn-單抗(Cpn-McAb)同時(shí)檢測(cè)病人外周血標(biāo)本294例。另外，分別從Cpn-PcAb檢測(cè)出Cpn特異性抗原陽(yáng)性的外周血單核細(xì)胞(PBMC)標(biāo)本(A組)中和對(duì)照組(B組)中隨機(jī)各挑選20例，用PCR檢測(cè)PBMC中的Cpn-DNA。結(jié)果  Cpn-PcAb檢測(cè)的陽(yáng)性率為45.9%(135/294)，Cpn-McAb檢測(cè)的陽(yáng)性率為43.5%(128/294)，兩種抗體同時(shí)陽(yáng)性的標(biāo)本有110例，Kappa值是07，根據(jù)其判斷標(biāo)準(zhǔn)提示兩者有較高的一致性。A、B兩組Cpn-DNA陽(yáng)性標(biāo)本分別為17例和3例。結(jié)論  Cpn抗體幾乎和Cpn單抗一樣有較高的

3、特異性和敏感性，可能可以替代進(jìn)口單抗用于臨床Cpn感染的檢測(cè)，有助于相關(guān)疾病的診治。        【關(guān)鍵詞】  肺炎衣原體多克隆抗體  肺炎衣原體單克隆抗體  微量免疫熒光  外周血單核細(xì)胞        Production and application of polyclonal antibody to chlamydia pneumoniae       &

4、#160;       【Abstract】  Objective  Production and application of polyclonal antibody to chlamydia pneumoniae (Cpn).Methods  The New Zealand white rabbit was subcutaneously injected with 10l Cpn strain TW-183(2×108ifu) and 300l complete Freund adjuvan

5、t.The serum antibody titer of 164 was identified by two dimensional immunodiffusion test.IgG was extracted from serum and purified by ammonium sulphate salting out and DEAE-Sephadex A-50 chromatography，then was labeled by fluorescein isothiacyanate.In order to evalute Cpn-PcAb，the blood specimens of

6、 294 patients were deected by Cpn-PcAb and Cpn monoclonal antibody (Cpn-PcAb) from USA at the same time.On the other hand，we randomly selected 20 peripheral blood mononuclear cell (PBMC) specimens with Cpn antigen positive (group A) and 20 ones with Cpn antigen negative (group B) by Cpn-PcAb detecti

7、on，then detected Cpn-DNA in PBMC by PCR.Results  The positive rate was 45.9% (135/294) for Cpn-PcAb and 43.5%(128/294) for Cpn-McAb，and 110 cases have the same positive for them，showing the high concordance between them (Kappa=0.7).The specimens of positive Cpn-DNA were in 17 and 3 respectively

8、 between group A and group B.Conclusion  The Cpn-PcAb has almost the same high specificity and sensitivity as Cpn-McAb.The Cpn-PcAb may be replace Cpn-McAb to detect the Cpn specific antigen and be helpful to diagnose and treat the clinical diseases associated with Cpn infection.  

9、60;     【Key words】  polyclonal antibody to chlamydia pneumoniae (Cpn-PcAb)  monoclonal antibody to Cpn(Cpn-McAb)  micro-immunofluorescence  peripheral blood mononuclear cell        肺炎衣原體(Chlamydia pneumoniae，Cpn)是嗜衣原體(Chlamydohila pne

10、umoniae)屬下的一個(gè)種，是一種常見(jiàn)的呼吸道病原體，帶菌者和隱性感染者非常普遍，。近年來(lái)在多種系統(tǒng)疾病患者血清中檢出的Cpn-抗體均顯著高于相應(yīng)對(duì)照組3，如心血管系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)、血液系統(tǒng)疾病等，因此Cpn已成為危害人類(lèi)健康的一種病原體，尤其是它在動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)形成過(guò)程中的作用日益受到國(guó)內(nèi)外學(xué)者廣泛關(guān)注。Cpn感染和AS之間的關(guān)系已為血清流行病學(xué)、病理學(xué)和分子生物學(xué)等實(shí)驗(yàn)技術(shù)所證實(shí)4。筆者亦建立了外周血單個(gè)核細(xì)胞中Cpn-抗原的檢測(cè)方法5，并用于臨床檢測(cè)，為臨床相關(guān)疾病的診治提供可靠依據(jù)。但是，目前檢測(cè)Cpn-抗原所用的單抗主要依賴(lài)進(jìn)口，為此筆者嘗試用家

11、兔自制抗Cpn抗體，并已獲得成功，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。        1  材料與方法        1.1  兔抗肺炎衣原體抗體的制備  用10l Cpn菌株TW-183(2×108ifu)與300l福氏完全佐劑混勻后皮下多點(diǎn)注射新西蘭白兔(New Zealand white，NZW)，在第14、28和42天，用10l Cpn菌株與300l福氏不完全佐劑混勻后皮下多點(diǎn)注射N(xiāo)ZW，用雙向瓊脂擴(kuò)散法鑒定其抗血清效價(jià)(164)后，頸動(dòng)脈插管放

12、血55ml，分離出血清25ml，用硫酸銨鹽析法、DEAE-Sephadex-50層析法逐步純化兔免疫球蛋白(IgG)，用考馬氏亮藍(lán)法測(cè)其蛋白含量為3.45mg/ml。        1.21.3  Cpn-PcAb與Cpn-McAb同時(shí)檢測(cè)標(biāo)本  復(fù)旦大學(xué)附屬金山醫(yī)院住院患者共294例，其中冠心病、高血壓、心肌梗死、糖尿病等患者109例，肺炎、支氣管炎、哮喘、肺氣腫等患者135例，慢性鼻炎、鼻息肉、鼻竇炎、咽喉炎、扁桃體炎等患者50例。常規(guī)無(wú)菌采集靜脈血3ml，EDTA抗凝。外周血單核細(xì)胞(PBMC)分離參照Moa

13、zed等6方法略加修改：抗凝血2000rpm離心5min，吸出血漿后的余血用等體積PBS稀釋混勻，再緩慢加到含有3ml淋巴細(xì)胞分離液試管中，然后于室溫2200rpm離心30min，吸出含有PBMC的中間云霧狀層，用PBS洗至不含紅細(xì)胞后，懸浮于PBS中，使其約含PBMC 5×106個(gè)。PBMC中Cpn-抗原的檢測(cè)參照Timms等7方法略加改進(jìn)：吸取新鮮制備的PBMC懸浮液10l(約含PBMC 6×105個(gè))分別在載玻片上涂出2個(gè)直徑45mm的圓點(diǎn)，電吹風(fēng)吹干后丙酮固定3次。其中一個(gè)圓點(diǎn)作為空白對(duì)照，另一個(gè)圓點(diǎn)加上5l Cpn-McAb(FITC-TT-401)稀釋液(工作濃

14、度140，即5l FITC-TT-401原液+195l 0.01%伊文氏藍(lán)PBS)，置濕盒于37溫育1h，PBS洗3次，每次3min，再用蒸餾水洗3次，電吹風(fēng)吹干。同時(shí)用自制FITC-Cpn-PcAb進(jìn)行平行操作。然后將載玻片置熒光顯微鏡下(HB0200汞燈，第一濾片：BG-12，第二濾片：CG-13和WILD8075)由2人觀察并核對(duì)大小均勻的特征性蘋(píng)果綠亮點(diǎn)。測(cè)定圓點(diǎn)內(nèi)的熒光亮點(diǎn)數(shù)減去空白圓點(diǎn)內(nèi)的熒光亮點(diǎn)數(shù)后的差數(shù)，作為特異性抗原陽(yáng)性的依據(jù)。陽(yáng)性對(duì)照：Cpn菌株(TW-185)牛奶稀釋液作為抗原，以PBS為陰性對(duì)照?？乖?yáng)性判斷標(biāo)準(zhǔn)參照Muhlestain等8的標(biāo)準(zhǔn)：強(qiáng)陽(yáng)性(100個(gè)亮點(diǎn)/

15、原點(diǎn))，陽(yáng)性(10100個(gè)亮點(diǎn)/原點(diǎn))，陰性(10個(gè)亮點(diǎn)/原點(diǎn))。        1.4  PCR法檢測(cè)外周血單核細(xì)胞中Cpn-DNA  按筆者已發(fā)表的方法進(jìn)行9。1.5%凝膠于5V/cm下電泳1h，在紫外燈下觀察結(jié)果，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物為474bp。        1.5  統(tǒng)計(jì)學(xué)處理          采用2檢測(cè)法  P0.05為差異有顯著性。          采用Kappa值判斷兩種方法的一致性強(qiáng)度  Kappa值在0.610.80，一致性強(qiáng)度屬于高度。        2  結(jié)果        2.1  Cpn抗體效價(jià)和交叉反應(yīng)鑒定  應(yīng)用進(jìn)口可溶性Cp