缺氧誘導(dǎo)因子在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎模型中的表達(dá)

1、缺氧誘導(dǎo)因子在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎模型中的表達(dá)        【摘要】     目的探討缺氧誘導(dǎo)因子-1（HIF-1）在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎組織中的表達(dá)情況。方法采用RT-PCR、免疫組化法檢測(cè)大鼠類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎模型關(guān)節(jié)組織中HIF-1蛋白的表達(dá)情況。結(jié)果HIF-1蛋白在正常大鼠關(guān)節(jié)組織中不表達(dá)，但在RA模型中表達(dá)，且表達(dá)隨模型時(shí)間的延長(zhǎng)而增加。結(jié)論HIF-1在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎組織中表達(dá), 并與炎癥嚴(yán)重程度呈正相關(guān)，提示HIF-1對(duì)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的發(fā)生發(fā)展起重要作用。  

2、   【關(guān)鍵詞】  缺氧誘導(dǎo)因子-1； 類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎； RT-PCR； 免疫組化    Expression of Hypoxia - inducible Factor 1 alpha ( HIF - 1) in RA MiceLUO Naixiang, CHEN Senzhou, WANG Xianfeng, HOU Qiaoyan（Guilin Medical University, Guilin 541004，China）Abstract：ObjectiveTo investigate the expres

3、sion of hypoxia - inducible 1 alpha (HIF - 1) in RA mice. Methods Imunohistochemistry and RT-PCR were used to detect the expression of HIF - 1 in the joint tissues of RA mice. ResultsThe joint tissues of mice showed no detectable HIF - 1. In contrast, increased level of HIF - 1 was found in RA mice.

4、The upregulated expression of HIF - 1 in RA mice models had close relationship with RA severely. ConclusionHIF - 1 plays an important role in the occurrence and progression of RA.Key words： Hypoxia - inducible factor 1alpha (HIF - 1);   Rheumatoid arthritis（RA）;   RT-PCR; &#

5、160; Immunohistochemistry    HIF-1(hypoxia inducible factor-1)是一種調(diào)節(jié)細(xì)胞氧平衡和缺氧反應(yīng)基因表達(dá)的核轉(zhuǎn)錄因子, 是在缺氧誘導(dǎo)的細(xì)胞核提取物中發(fā)現(xiàn)的, 調(diào)節(jié)細(xì)胞適應(yīng)低氧狀態(tài)下的能量代謝和氧的運(yùn)輸, 是體內(nèi)維持細(xì)胞內(nèi)氧平衡的主要調(diào)控因子1。在缺氧條件下，HIF-1蛋白及其靶基因表達(dá)增加。類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis, RA)是一種原因未明且多發(fā)的全身自身免疫性疾病，其關(guān)節(jié)腔為缺氧微環(huán)境，基本病理改變主要是滑膜慢性炎癥及關(guān)節(jié)軟骨和骨質(zhì)的破壞，臨床特征為關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)的炎癥和腫脹、慢性進(jìn)

6、行性病程，并可致多個(gè)關(guān)節(jié)完全強(qiáng)直，最終導(dǎo)致功能的喪失。有關(guān)RA組織中HIF-1的表達(dá)及作用, 目前國(guó)內(nèi)少見(jiàn)報(bào)道。我們采用RT-PCR及免疫組化方法檢測(cè)正常大鼠、RA模型大鼠中HIF-1的表達(dá)情況, 旨在探討HIF-1在RA發(fā)生發(fā)展中的作用。1  材料1.1  動(dòng)物模型制作30只體質(zhì)量為180200g 成年Wistar大鼠（雌雄不拘），24只參照熊國(guó)林等2制作大鼠類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎模型的方法造模，6只正常飼養(yǎng)。1.2  組織準(zhǔn)備24只模型動(dòng)物分期分批，每批4只分兩組分別用1%戊巴比妥鈉(50 mg/ kg)作腹腔注射。深麻醉下，一組快速開(kāi)胸經(jīng)左心室插管至升主動(dòng)脈快速灌注

7、7090 ml生理鹽水，再以0.1 mol/ L磷酸緩沖液(PB，pH 7.6，由NaH2PO4和Na2HPO4各適量加雙蒸水配置而成) 配制的4%多聚甲醛400 ml灌注固定，灌注固定后立即取膝關(guān)節(jié)周圍軟組織，置4%多聚甲醛中后固定2h，之后脫水、石蠟包埋，恒冷切片機(jī)切片, 片厚4 m, 切片裱貼于賴氨酸涂布的玻片上，用于HE染色和免疫組化染色。另一組在深麻醉下取關(guān)節(jié)組織用于RNA的提取。6只正常大鼠分兩組按上述方法分別取組織用于HE染色、免疫組化染色及總RNA提取。2  方法2.1  RT-PCR取下的關(guān)節(jié)組織用TRIZOL試劑按試劑盒說(shuō)明書(shū)提取組織總RNA。按我們?cè)?/p>

8、設(shè)計(jì)的引物及反應(yīng)條件獲得產(chǎn)物，產(chǎn)物經(jīng)1.8%瓊脂糖凝膠電泳3。2.2  HE染色切片經(jīng)二甲苯脫蠟、水化后，滴加蘇木精染液20min，蒸餾水返藍(lán)5min，鹽酸酒精分色，蒸餾水沖洗，伊紅染液復(fù)染，蒸餾水沖洗，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹(shù)膠封片。用裝有數(shù)碼照相機(jī)的顯微鏡觀察并拍照。2.3  免疫組化染色 所有切片經(jīng)脫蠟、水化后，為更好暴露核抗原，將切片用EDTA（pH9.0，邁新公司產(chǎn)品）做熱修復(fù)20 min。為消除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶活性，將切片用3%H2O2室溫孵育20min后，用0.01 mol/L的PBS緩沖液（pH 7.4）沖洗3次共10 min。濾紙吸干后加

9、入濃縮型鼠抗HIF-1單克隆抗體（Newmaker，150稀釋）中4孵育過(guò)夜， 0.01 mol/L的PBS緩沖液（pH 7.4）沖洗10 min，加50 l MaxvisionTM即用型二抗（邁新產(chǎn)品）中室溫孵育15 min后，0.01 mol/L的PBS緩沖液（pH 7.4）沖洗10 min，最后, 在DAB顯色液（邁新產(chǎn)品）中反應(yīng)5 min，蒸餾水沖洗，蘇木精復(fù)染，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹(shù)膠封片，用裝有數(shù)碼照相機(jī)的顯微鏡觀察并拍照。用PBS代替一抗做陰性對(duì)照，陽(yáng)性對(duì)照片用已知人宮頸鱗癌陽(yáng)性片（本院病理科切片）。HIF-1以細(xì)胞核或胞質(zhì)內(nèi)有棕黃色細(xì)顆粒為陽(yáng)性。將照片在Adobe P

10、hotoshop 中作圖像處理。選出樣片，組版，打印。2.4  統(tǒng)計(jì)學(xué)處理應(yīng)用SPSS 10. 0 統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，樣本率的比較采用2 檢驗(yàn)；參數(shù)間的相關(guān)性采用kappa 值檢驗(yàn)。3  結(jié)果3.1  HE染色 肉眼可見(jiàn)大鼠RA模型關(guān)節(jié)局部組織充血。鏡下可見(jiàn)關(guān)節(jié)腔滑膜增生、炎癥、細(xì)胞增殖、肉芽腫形成，軟骨及骨組織破壞（圖1A）。3.2  免疫組化染色觀察 HIF-1蛋白的表達(dá): 正常大鼠關(guān)節(jié)組織中檢測(cè)不到HIF-1免疫陽(yáng)性細(xì)胞，而模型組HIF-1陽(yáng)性反應(yīng)物為棕黃色顆粒, 主要位于關(guān)節(jié)細(xì)胞的胞核及胞漿中，并且HIF-1的表達(dá)

11、隨著模型時(shí)間的延長(zhǎng)而增多（圖1B）。正常組與實(shí)驗(yàn)組結(jié)果之間有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異( P0.05）。3.3  RT-PCR結(jié)果觀察RT-PCR結(jié)果經(jīng)1.8%瓊脂糖凝膠電泳后獲得一條約2.5 kb的清晰條帶(圖2)。4  討論    HIF-1是調(diào)節(jié)機(jī)體內(nèi)細(xì)胞對(duì)缺氧反應(yīng)的核轉(zhuǎn)錄因子,其表達(dá)受氧濃度調(diào)節(jié)。HIF-1呈固定表達(dá)，HIF-1 的活性主要由HIF-1決定。通常HIF-1只能在低氧情況下穩(wěn)定表達(dá),氧濃度< 6 %時(shí)，HIF-1含量呈指數(shù)級(jí)上升，氧濃度< 0. 5 %(相當(dāng)于氧分壓1.332.00 kPa) 時(shí)其含量達(dá)最高峰。細(xì)胞缺氧時(shí)，HI

12、F-1穩(wěn)定表達(dá)并從胞漿轉(zhuǎn)移至胞核，同時(shí)HIF-1從胞漿轉(zhuǎn)移到核，兩者聚合成HIF-1分子而發(fā)揮核轉(zhuǎn)錄因子的作用。在多種病理狀態(tài)中，HIF-1的表達(dá)異常。4.1  RA關(guān)節(jié)腔為缺氧微環(huán)境，滑膜中表達(dá)HIF-1佐劑誘導(dǎo)的大鼠關(guān)節(jié)炎模型(AA)4 主要表現(xiàn)為多發(fā)性關(guān)節(jié)炎，比較接近人體RA。RA病變關(guān)節(jié)腔的滑膜細(xì)胞大量增加，滑液量增多，壓迫滑膜毛細(xì)血管致其血流減慢，導(dǎo)致RA關(guān)節(jié)腔為缺氧環(huán)境，滑膜中表達(dá)HIF-1。早在1970 年，Lund-Olesen 報(bào)道RA患者的關(guān)節(jié)腔為缺氧環(huán)境，氧分壓(PO2)為3.60kPa，骨關(guān)節(jié)炎(OA)患者中為5.73kPa ，正常對(duì)照組為8.40kPa。進(jìn)一

13、步研究發(fā)現(xiàn)RA患者中PO2和疾病嚴(yán)重程度(病理學(xué)評(píng)分)負(fù)相關(guān)。最近研究表明5 ，HIF-1的水平的調(diào)節(jié)不僅僅由氧濃度調(diào)節(jié)，多種細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子已被證實(shí)在正常氧濃度下使HIF-1蛋白的穩(wěn)定性增加及其靶基因的表達(dá)增加。Gatromanolaki6 等則報(bào)道HIF-1在RA和OA滑膜中的表達(dá)均升高，且主要在成纖維細(xì)胞表達(dá)，巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞中也有部分表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示在正常大鼠關(guān)節(jié)滑膜中沒(méi)有或檢測(cè)不到HIF-1，而模型大鼠則有表達(dá)，并隨模型時(shí)間的推移而表達(dá)增加，說(shuō)明模型時(shí)間越長(zhǎng)，關(guān)節(jié)腔缺氧越嚴(yán)重。4.2  HIF-1在RA的發(fā)病機(jī)制中可能參與調(diào)控糖酵解代謝啟動(dòng)并持續(xù)髓細(xì)胞介導(dǎo)

14、的炎癥反應(yīng)髓細(xì)胞是免疫系統(tǒng)的重要組成部分，包括粒細(xì)胞、單核-巨噬細(xì)胞，在RA的整個(gè)病理過(guò)程中占重要地位。無(wú)論在缺氧還是有氧情況下，髓細(xì)胞均依賴糖酵解產(chǎn)生ATP供能，這與髓細(xì)胞中線粒體含量甚少有關(guān)。糖酵解過(guò)程的抑制劑可抑制髓細(xì)胞的上述作用，而線粒體呼吸鏈抑制劑則無(wú)此作用。HIF-1通過(guò)調(diào)控糖酵解通路影響髓細(xì)胞功能。HIF-1表達(dá)增加使糖酵解作用增強(qiáng)，髓細(xì)胞能量供給充足，從而發(fā)揮聚集、粘附、游走、浸潤(rùn)、吞噬等作用啟動(dòng)炎癥反應(yīng)并使之持續(xù)。Cramer等7在體外試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)在HIF-1基因缺失的髓細(xì)胞，無(wú)論在缺氧環(huán)境還是正常氧濃度下，其ATP和乳酸的含量均明顯降低，而乳酸含量是髓細(xì)胞活化發(fā)揮炎癥作用的標(biāo)

15、志之一。體內(nèi)試驗(yàn)進(jìn)一步證明在髓細(xì)胞HIF-1基因缺失的急性或慢性炎癥小鼠模型中，HIF-1基因缺失組較野生型組疾病嚴(yán)重程度降低。    HIF-1在RA發(fā)病機(jī)制中作用的深入研究將有助于進(jìn)一步闡明RA的本質(zhì),并為RA的基因治療領(lǐng)域開(kāi)辟新途徑。國(guó)外有學(xué)者8設(shè)想和嘗試在治療基因的啟動(dòng)子中插入HRE的基因序列后轉(zhuǎn)染巨噬細(xì)胞，將轉(zhuǎn)染后的巨噬細(xì)胞注入局部關(guān)節(jié)腔內(nèi)，使治療基因的表達(dá)在HIF-1的調(diào)控之下通過(guò)巨噬細(xì)胞作用于其它病變關(guān)節(jié)，從而提高基因治療的靶向性與效率。以HIF-1為靶點(diǎn)的基因治療方法將會(huì)成為RA等許多疾病治療研究的新方向。   

16、60;【參考文獻(xiàn)】  1Semenza GL. HIF-1: mediator of physiological and pathophysiological responses to hypoxia J. J Appl Physiol, 2000, 88:1474 .2熊國(guó)林，黃海瀟，謝玲，等.類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎大鼠模型的制備J.解放軍醫(yī)學(xué)雜志，2007，32（2）：121.3 陳森洲，王險(xiǎn)峰，駱耐香.低氧誘導(dǎo)因子-1的基因克隆J.右江醫(yī)學(xué)，2007，35（5）：498.4王金榮，王宏偉，韓秀珍,等.靜脈注射丙種球蛋白對(duì)佐劑關(guān)節(jié)炎的作用J.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床,2004,24(6):669.

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