實(shí)驗(yàn)五蛋白質(zhì)序列

1、復(fù)旦大學(xué) 實(shí)驗(yàn)五：蛋白質(zhì)序列分析實(shí)驗(yàn)五：蛋白質(zhì)序列分析杜杜 娟娟基因與蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)分析基因與蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)分析實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目五：蛋白質(zhì)序列分析實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目五：蛋白質(zhì)序列分析一、 實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮鸵螅?掌握蛋白質(zhì)基本性質(zhì)分析；基本理化性質(zhì)和疏水性分析。 掌握蛋白質(zhì)信號(hào)肽的預(yù)測(cè)，亞細(xì)胞定位的預(yù)測(cè)，跨膜結(jié)構(gòu)及卷曲螺旋結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)。 了解基于motif、結(jié)構(gòu)位點(diǎn)、結(jié)構(gòu)功能域數(shù)據(jù)庫的蛋白質(zhì)功能預(yù)測(cè) 掌握基于序列同源性分析的蛋白質(zhì)功能預(yù)測(cè)。2（一）蛋白質(zhì)基本理化性質(zhì)分析蛋白質(zhì)理化性質(zhì)是蛋白質(zhì)研究的基礎(chǔ) 蛋白質(zhì)的基本性質(zhì)： 相對(duì)分子質(zhì)量 氨基酸組成 等電點(diǎn)（PI） 消光系數(shù) 半衰期 不穩(wěn)定系數(shù) 總平均親水性 實(shí)驗(yàn)方法：

2、相對(duì)分子質(zhì)量的測(cè)定、等電點(diǎn)實(shí)驗(yàn)、沉降實(shí)驗(yàn) 缺點(diǎn)：費(fèi)時(shí)、耗資基于實(shí)驗(yàn)經(jīng)驗(yàn)值的計(jì)算機(jī)分析方法 軟件 Bioedit 網(wǎng)絡(luò)工具ProtParam， Compute PI34基于一級(jí)序列的組分分析氨基酸親疏水性等分析為高級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)提供參考ExPASy（ Expert Protein Analysis System ） 開發(fā)的針對(duì)蛋白質(zhì)基本理化性質(zhì)的分析： Protparam 工具 /tools/protparam.html蛋白質(zhì)理化性質(zhì)分析蛋白質(zhì)理化性質(zhì)分析 Protparam 工具工具 /tools/protparam.

3、html計(jì)算以下物理化學(xué)性質(zhì)：計(jì)算以下物理化學(xué)性質(zhì)： 相對(duì)分子質(zhì)量相對(duì)分子質(zhì)量 理論理論 pI pI 值值 氨基酸組成氨基酸組成 原子組成原子組成 消光系數(shù)消光系數(shù) 半衰期半衰期 不穩(wěn)定系數(shù)不穩(wěn)定系數(shù) 脂肪系數(shù)脂肪系數(shù) 總平均親水性總平均親水性5主要選項(xiàng)主要選項(xiàng)/參數(shù)參數(shù)序列在線提交形式：序列在線提交形式： 如果分析SWISS-PORT和TrEMBL數(shù)據(jù)庫中序列 直接填寫Swiss-Prot/TrEMBL AC號(hào)(accession number) 如果分析新序列： 直接在搜索框中粘貼氨基酸序列輸入Swiss-Prot/TrEMBL AC號(hào)打開protein.txt，將蛋白質(zhì)序列粘貼在搜索框中

4、6 輸入Swiss-Prot/TrEMBL AC號(hào)分不同的功能域肽段 以P02699為例輸出結(jié)果輸出結(jié)果 功能域用戶自定義區(qū)段7點(diǎn)擊不同功能域得到以下結(jié)果點(diǎn)擊不同功能域得到以下結(jié)果氨基酸數(shù)目相對(duì)分子質(zhì)量理論 pI 值氨基酸組成正/負(fù)電荷殘基數(shù)89消光系數(shù)半衰期原子組成分子式總原子數(shù)不穩(wěn)定系數(shù)脂肪系數(shù)總平均親水性40 unstable10（二）蛋白質(zhì)疏水性分析 疏水作用是蛋白質(zhì)折疊的主要驅(qū)動(dòng)力 分析蛋白質(zhì)氨基酸親疏水性是了解蛋白質(zhì)折疊的第一步 氨基酸疏水分析為蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)提供佐證 是分析蛋白質(zhì)跨膜區(qū)重要一步11 ProtScale工具 /tools/p

5、rotscale.html 氨基酸標(biāo)度 表示氨基酸在某種實(shí)驗(yàn)狀態(tài)下相對(duì)其他氨基酸在某些性質(zhì)的差異，如疏水性、親水性等 收集50多個(gè)文獻(xiàn)中提供的氨基酸標(biāo)度 默認(rèn)值以Hphob. Kyte & Doolittle做疏水性分析 ProtScale能計(jì)算超過50種蛋白質(zhì)的特性。僅一項(xiàng)需要額外設(shè)定的參數(shù)是輸入框的寬度，該參數(shù)將指示系統(tǒng)每次運(yùn)行計(jì)算和顯示的殘基數(shù)，其缺省值為9。如果想考慮跨膜螺旋特性，該參數(shù)設(shè)置應(yīng)為20，因?yàn)橐粋€(gè)跨膜螺旋通常有20個(gè)氨基酸長(zhǎng)度蛋白質(zhì)親疏水性分析12主要選項(xiàng)/參數(shù)序列在線提交形式：如果分析SWISS-PORT和TrEMBL數(shù)據(jù)庫中序列 直接填寫Swiss-Prot/T

6、rEMBL AC號(hào)(accession number)如果分析新序列： 直接在搜索框中粘貼氨基酸序列以P02699為例輸入Swiss-Prot/TrEMBL AC號(hào)打開protein.txt，將一條蛋白質(zhì)序列粘貼在搜索框中13氨基酸標(biāo)度計(jì)算窗口（7-11）相對(duì)權(quán)重值 權(quán)重值變化趨勢(shì) 是否歸一化14所用氨基酸所用氨基酸標(biāo)度信息標(biāo)度信息分析所用參分析所用參數(shù)信息數(shù)信息輸出結(jié)果輸出結(jié)果15圖形結(jié)果圖形結(jié)果 文本結(jié)果文本結(jié)果 參數(shù)參數(shù) 每個(gè)位置每個(gè)位置 的得分的得分16三三 信號(hào)肽預(yù)測(cè)信號(hào)肽預(yù)測(cè) 蛋白質(zhì)合成后要運(yùn)送到細(xì)胞中不同的部位，有的蛋白質(zhì)要通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜進(jìn)入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)，最終成為分泌蛋白分泌蛋白。

7、分泌蛋白的N端都有一段約1535個(gè)氨基酸的疏水性肽段，其功能是引導(dǎo)蛋白質(zhì)多肽鏈穿過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜進(jìn)入腔內(nèi)，稱為信號(hào)肽信號(hào)肽（signal peptide）。 按照氨基酸組成及其位置特征，可將信號(hào)肽分為4大類：分泌信號(hào)肽 2. 脂蛋白信號(hào)肽3. Pilin-like信號(hào)肽4. 細(xì)菌素和細(xì)菌素信號(hào)肽蛋白質(zhì)序列分析 信號(hào)肽主要由三個(gè)domain組成：N-region、H-regin和C-region. N-region為正電荷區(qū)域，至少含有一個(gè)精氨酸(R) 或賴氨酸(K). H-region為疏水核，一般長(zhǎng)為1214個(gè)氨基酸. C-region包含信號(hào)肽酶(SPase)的剪切位點(diǎn)，在剪切位點(diǎn)的-1位和-3

8、位上多為中性的丙氨酸，該區(qū)域也稱為富含丙氨酸區(qū)域. N H C N端 C端蛋白質(zhì)序列分析 常用工具 SignaIP（http:/www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/） 通過神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)方法的組合 預(yù)測(cè)信號(hào)肽的位置及相應(yīng)切點(diǎn)19三三 信號(hào)肽的預(yù)測(cè)信號(hào)肽的預(yù)測(cè)人的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)駐留蛋白信號(hào)肽預(yù)測(cè) Q9BS26輸入序列的輸入序列的FASTA文件文件21人的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)駐留蛋白信號(hào)肽預(yù)測(cè)曲線顏色曲線顏色此處此處C值最大；值最大；S值陡峭；值陡峭；Y值最高峰。預(yù)測(cè)為信號(hào)值最高峰。預(yù)測(cè)為信號(hào)肽剪切位點(diǎn)肽剪切位點(diǎn)文本結(jié)果，文本結(jié)果，YES代表該蛋代表該蛋白包含信號(hào)肽白包含信號(hào)肽,剪切位點(diǎn)剪切位點(diǎn)位

9、于位于29，30殘基處殘基處C score: 剪切位點(diǎn)分值剪切位點(diǎn)分值S score: 信號(hào)肽分值信號(hào)肽分值Y score: 綜合剪切位點(diǎn)分值綜合剪切位點(diǎn)分值四 蛋白質(zhì)亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè) 亞細(xì)胞定位與蛋白質(zhì)的功能存在著非常重要的聯(lián)系。亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)基于如下原理：(1)不同的細(xì)胞器往往具有不同的理化環(huán)境,它根據(jù)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)及表面理化特征,選擇性容納蛋白。(2)蛋白質(zhì)表面直接暴露于細(xì)胞器環(huán)境中,它由序列折疊過程決定,而后者取決于氨基酸組成。因此可以通過氨基酸組成進(jìn)行亞細(xì)胞定位的預(yù)測(cè)。 推薦使用PSORT(http:/psort.nibb.ac.jp/)II軟件對(duì)PDCD5蛋白的細(xì)胞內(nèi)定位進(jìn)行預(yù)測(cè)。PS

10、ORT將動(dòng)物蛋白質(zhì)定位于10個(gè)細(xì)胞器：(1)細(xì)胞漿，(2)細(xì)胞骨架，(3)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，(4)胞外，(5)高爾基體，(6)溶酶體，(7)線粒體，(8)胞核，(9)過氧化物酶體(peroxisome)和(10)細(xì)胞膜。2223輸入蛋白質(zhì)序列輸入蛋白質(zhì)序列FASTA文件文件2425細(xì)胞外，細(xì)胞壁細(xì)胞外，細(xì)胞壁線粒體線粒體細(xì)胞骨架細(xì)胞骨架細(xì)胞核細(xì)胞核五 跨膜區(qū)預(yù)測(cè) 各個(gè)物種的膜蛋白的比例差別不大，約四分之一的人類已知蛋白為膜蛋白。由于膜蛋白不溶于水，分離純化困難，不容易生長(zhǎng)晶體，很難確定其結(jié)構(gòu)。因此，對(duì)膜蛋白的跨膜螺旋進(jìn)行預(yù)測(cè)是生物信息學(xué)的重要應(yīng)用。 推薦使用TMHMM軟件(http:/www.cbs.d

11、tu.dk/servICEs/TMHMM/)對(duì)蛋白進(jìn)行跨膜預(yù)測(cè)。TMHMM綜合了跨膜區(qū)疏水性、電荷偏倚、螺旋長(zhǎng)度和膜蛋白拓?fù)鋵W(xué)限制等性質(zhì)，采用隱馬氏模型(Hidden Markov Models)，對(duì)跨膜區(qū)及膜內(nèi)外區(qū)進(jìn)行整體的預(yù)測(cè)。TMHMM是目前最好的進(jìn)行跨膜區(qū)預(yù)測(cè)的軟件,它尤其長(zhǎng)于區(qū)分可溶性蛋白和膜蛋白，因此首選它來判定一個(gè)蛋白是否為膜蛋白。所有跨膜區(qū)預(yù)測(cè)軟件的準(zhǔn)確性都不超過52%，但86%的跨膜區(qū)可以通過不同的軟件進(jìn)行正確預(yù)測(cè)。因此，綜合分析不同的軟件預(yù)測(cè)結(jié)果和疏水性圖以獲得更好的預(yù)測(cè)結(jié)果。2627輸入蛋白質(zhì)序列輸入蛋白質(zhì)序列FASTA文件文件鋁激活蘋果酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的跨膜區(qū)預(yù)測(cè)鋁激活蘋果酸

12、轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的跨膜區(qū)預(yù)測(cè)28跨膜區(qū)跨膜區(qū)起始氨起始氨基酸基酸終止氨終止氨基酸基酸文字結(jié)果文字結(jié)果29跨膜區(qū)跨膜區(qū)膜外區(qū)膜外區(qū)膜內(nèi)區(qū)膜內(nèi)區(qū)圖形結(jié)果圖形結(jié)果 卷曲螺旋卷曲螺旋(coiled coil)是蛋白質(zhì)中由27條螺旋鏈纏繞成麻花狀結(jié)構(gòu)的總稱 存在于多種天然蛋白質(zhì)中，如轉(zhuǎn)錄因子、結(jié)構(gòu)蛋白、膜蛋白中，在生物體內(nèi)執(zhí)行著代謝調(diào)控、分子運(yùn)動(dòng)、膜通道、分子識(shí)別等重要的生物功能，30六六 蛋白質(zhì)卷曲螺旋域分析蛋白質(zhì)卷曲螺旋域分析 典型的有亮氨酸拉鏈，存在7殘基 重復(fù)結(jié)構(gòu)（heptad repeat)，以a，b， c，d，e，f，g位置表示，其中a和d位置為疏水性氨基酸，而其他位置 殘 基為親水性 卷曲螺旋 控

13、制蛋白質(zhì)寡聚化的元件，存在于轉(zhuǎn)錄因子、蛋白融合多肽等 一種很簡(jiǎn)單的三級(jí)結(jié)構(gòu)，容易預(yù)測(cè) 常用工具 COILS - Prediction of Coiled Coil Regions in Proteins （/software/COILS_form.html）選擇滑動(dòng)窗口大小選擇滑動(dòng)窗口大小選擇打分矩陣選擇打分矩陣和權(quán)重和權(quán)重選擇輸入格式，選擇選擇輸入格式，選擇“SwissProtID or AC”查 詢 內(nèi) 容 ， 輸 入查 詢 內(nèi) 容 ， 輸 入Q9H2G9/software/COILS_form.h

14、tml3333圖形結(jié)果圖形結(jié)果34預(yù)測(cè)為預(yù)測(cè)為卷曲螺卷曲螺旋的區(qū)旋的區(qū)域域七七 結(jié)構(gòu)域分析結(jié)構(gòu)域分析 結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)域（structure domain）是在蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)中介于二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)之間的可以明顯區(qū)分但又相對(duì)獨(dú)立的折疊單元，每個(gè)結(jié)構(gòu)域自身形成緊實(shí)的三維結(jié)構(gòu)，可以獨(dú)立存在或折疊，但結(jié)構(gòu)域與結(jié)構(gòu)域之間關(guān)系較為松散。 結(jié)構(gòu)域通常由25300個(gè)氨基酸組成，不同蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域數(shù)目或同一蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域相似度差異較大蛋白質(zhì)序列分析 常見的結(jié)構(gòu)域主要有5種： 全平行結(jié)構(gòu)域 反平行結(jié)構(gòu)域 +結(jié)構(gòu)域 /結(jié)構(gòu)域 其他折疊類型 結(jié)構(gòu)域是蛋白質(zhì)的功能、結(jié)構(gòu)和進(jìn)化單元，結(jié)構(gòu)域分析對(duì)于蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的分類和預(yù)測(cè)有著重要作用。

15、蛋白質(zhì)序列分析七七 基于結(jié)構(gòu)域（模體）的蛋白質(zhì)功能預(yù)測(cè)基于結(jié)構(gòu)域（模體）的蛋白質(zhì)功能預(yù)測(cè)一類基因具有轉(zhuǎn)錄功能，一類基因具有轉(zhuǎn)錄功能， 且它們所編碼的蛋且它們所編碼的蛋白質(zhì)都具有白質(zhì)都具有Y結(jié)構(gòu)域（模體），蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域（模體），蛋白質(zhì)B也具也具有有Y結(jié)構(gòu)域（模體），因而蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域（模體），因而蛋白質(zhì)B的功能也的功能也應(yīng)該與基因轉(zhuǎn)錄相關(guān)。應(yīng)該與基因轉(zhuǎn)錄相關(guān)。蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)B 轉(zhuǎn)錄活性轉(zhuǎn)錄活性轉(zhuǎn)錄活性轉(zhuǎn)錄活性 蛋白質(zhì)模體或結(jié)構(gòu)域在氨基酸序列水平比其他區(qū)蛋白質(zhì)模體或結(jié)構(gòu)域在氨基酸序列水平比其他區(qū)域保守，通過對(duì)序列比對(duì)可以發(fā)現(xiàn)這些在進(jìn)化上域保守，通過對(duì)序列比對(duì)可以發(fā)現(xiàn)這些在進(jìn)化上較為保守的區(qū)域；較為保守

16、的區(qū)域； 蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)模體模體或結(jié)構(gòu)域通常與該蛋白質(zhì)的功能直接或結(jié)構(gòu)域通常與該蛋白質(zhì)的功能直接相關(guān)；相關(guān)； 根據(jù)模體或結(jié)構(gòu)域信息可以對(duì)同源水平較低的蛋根據(jù)模體或結(jié)構(gòu)域信息可以對(duì)同源水平較低的蛋白質(zhì)的進(jìn)行功能預(yù)測(cè)。白質(zhì)的進(jìn)行功能預(yù)測(cè)。基于結(jié)構(gòu)域（模體）的蛋白質(zhì)功能預(yù)測(cè)基于結(jié)構(gòu)域（模體）的蛋白質(zhì)功能預(yù)測(cè)七七 蛋白質(zhì)序列分析蛋白質(zhì)序列分析 蛋白質(zhì)家族、結(jié)構(gòu)域、位點(diǎn)及功能分析蛋白質(zhì)家族、結(jié)構(gòu)域、位點(diǎn)及功能分析綠膿假單胞菌綠膿假單胞菌 RpsA 層粘連蛋白受體層粘連蛋白受體蛋白質(zhì)序列分析，蛋白質(zhì)序列分析， 保守結(jié)構(gòu)域以及功能分析保守結(jié)構(gòu)域以及功能分析RNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域結(jié)合結(jié)構(gòu)域核酸結(jié)合核酸結(jié)合七七 基于同

17、源序列的蛋白質(zhì)功能預(yù)測(cè)基于同源序列的蛋白質(zhì)功能預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)A具有轉(zhuǎn)錄功能，蛋白質(zhì)具有轉(zhuǎn)錄功能，蛋白質(zhì)B與與A在氨在氨基酸序列上相似（直系同源），因而蛋白基酸序列上相似（直系同源），因而蛋白質(zhì)質(zhì)B也具有轉(zhuǎn)錄功能。也具有轉(zhuǎn)錄功能。AB轉(zhuǎn)錄活性轉(zhuǎn)錄活性 轉(zhuǎn)錄活性轉(zhuǎn)錄活性蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)A蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)B 至少80個(gè)氨基酸長(zhǎng)度范圍內(nèi)具有25%以上的序列一致性才提示可能的顯著性意義。未知功能序列對(duì)庫檢索的一般分析策略如下： 和 運(yùn) 行 B l a s t p 程 序 的 服 務(wù) 器 （/blast/）連接； 將目的序列粘貼到序列輸入框中，選擇BLOSUM

18、62記分矩陣運(yùn)行BlastP程序。NCBI的BlastP程序要求輸入格式為FASTA格式； 如果BlastP檢測(cè)到了高度同源的序列，將有可能提示目的序列的生物學(xué)功能42七七 基于同源序列的蛋白質(zhì)功能預(yù)測(cè)基于同源序列的蛋白質(zhì)功能預(yù)測(cè)序列相似性比較作為一個(gè)非常有效的工具用于同源序列相似性比較作為一個(gè)非常有效的工具用于同源基因的發(fā)現(xiàn)基因的發(fā)現(xiàn)基于序列同源的蛋白質(zhì)功能預(yù)測(cè)基于序列同源的蛋白質(zhì)功能預(yù)測(cè)基于序列同源的蛋白質(zhì)功能預(yù)測(cè)基于序列同源的蛋白質(zhì)功能預(yù)測(cè)45在uniprot數(shù)據(jù)庫中檢索人脂聯(lián)素 (adiponectin)蛋白質(zhì)序列；寫出檢索號(hào)。使用在線分析平臺(tái)ExPASy對(duì)上述蛋白質(zhì)序列進(jìn)行分子質(zhì)量、氨基酸組成（protparam）、和疏水性等基本性質(zhì)分析（protscale）；寫出分子質(zhì)量是多少？氨基酸組