腫瘤科研項(xiàng)目方案設(shè)計(jì)

1、XX腫瘤相關(guān)功能基因XXX研究課題設(shè)計(jì)一、XX腫瘤相關(guān)基因功能研究整體技術(shù)路線二、合作項(xiàng)目簡(jiǎn)介整個(gè)文章的研究思路是，在臨床病理當(dāng)中發(fā)現(xiàn)在XX腫瘤標(biāo)本中XXX基因特異性高表達(dá)，在相應(yīng)的腫瘤細(xì)胞系也得到一致的結(jié)果，隨后選取2株典型的細(xì)胞系用XXX基因的RNAi的lentivirus獲得細(xì)胞、整體水平研究數(shù)據(jù)，了解該基因沉默后對(duì)腫瘤增殖，凋亡，侵襲轉(zhuǎn)移能力的影響。最后檢測(cè)XXX基因的下游作用分子，尋找其可能的作用途徑。預(yù)期文章數(shù)據(jù)框架:Fig.1 腫瘤病理標(biāo)本中研究的靶基因呈現(xiàn)表達(dá)上調(diào)（免疫組化或qPCR）Fig.2 不同的XX腫瘤細(xì)胞株中該基因的表達(dá)也顯著增高Fig.3慢病毒（lentivirus

2、）結(jié)構(gòu)圖，腫瘤細(xì)胞感染圖片F(xiàn)ig.4 靶基因RNAi慢病毒感染腫瘤細(xì)胞后，mRNA和蛋白表達(dá)顯著下調(diào)（qPCR和western）Fig.5 在兩株細(xì)胞上沉默靶基因之后平行的MTT結(jié)果及統(tǒng)計(jì)Fig.6 在兩株細(xì)胞上沉默靶基因之后流式分析細(xì)胞周期，計(jì)算凋亡率Fig.7 在兩株細(xì)胞上沉默靶基因之后克隆形成能力變化，圖片和統(tǒng)計(jì)結(jié)果Fig.8 用腫瘤細(xì)胞感染RNAi慢病毒制備成穩(wěn)定細(xì)胞株，然后做裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)，裸鼠圖片，每天量瘤子大小，做腫瘤生長(zhǎng)曲線，4周處死稱瘤重，計(jì)算抑瘤率。Fig.9下游基因的qPCR檢測(cè)結(jié)果（如果有陽(yáng)性結(jié)果就放上去）Fig.10 western blot驗(yàn)證上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果三、實(shí)驗(yàn)方案

3、1、XXX在XX細(xì)胞表達(dá)檢測(cè)實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)內(nèi)容：選取多株XX細(xì)胞株，檢測(cè)XXX基因的表達(dá)，高表達(dá)XXX基因的兩株細(xì)胞用于后續(xù)RNAi的研究。1. qPCR檢測(cè)不同細(xì)胞株中XXX的mRNA水平；2. 對(duì)XXX表達(dá)陽(yáng)性的細(xì)胞株進(jìn)行感染預(yù)實(shí)驗(yàn)，確定各個(gè)細(xì)胞株病毒感染的難易程度3. 將有XXX表達(dá)并且容易感染的腫瘤細(xì)胞感染RNAi病毒并進(jìn)行MTT實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)?zāi)康模捍_定各細(xì)胞XXX的表達(dá)以及在MTT實(shí)驗(yàn)中哪株細(xì)胞的功能最明顯，作為選擇相應(yīng)細(xì)胞株進(jìn)行后續(xù)功能實(shí)驗(yàn)研究的依據(jù)。實(shí)驗(yàn)在多株腫瘤細(xì)胞上平行進(jìn)行（如qPCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)有細(xì)胞低表達(dá)XXX，則該細(xì)胞不進(jìn)入MTT實(shí)驗(yàn)）項(xiàng)目分組NCConRNAiqPCR-XXX（驗(yàn)證）

4、細(xì)胞增殖檢測(cè)（MTT法）2、XXX在腫瘤細(xì)胞系中的功能研究實(shí)驗(yàn)內(nèi)容：根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果選擇12株細(xì)胞系進(jìn)行XXX的相應(yīng)功能的實(shí)驗(yàn)研究，獲得一套in vitro實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。同時(shí)在XXX RNAi獲得功能表型的變化后，重新導(dǎo)入一個(gè)突變的XXX表達(dá)病毒載體，使得功能變化得到回復(fù)，從而驗(yàn)證RNAi反應(yīng)和基因功能的特異性。實(shí)驗(yàn)?zāi)康模捍_定XXX基因在腫瘤細(xì)胞中的功能Knock Down XXX功能驗(yàn)證XXX siRNA病毒ControlNCXXX RNAi組別說明空白對(duì)照RNAi陰性對(duì)照RNAi病毒qPCR-XXXWestern-XXX細(xì)胞增殖檢測(cè)（MTT法）凋亡檢測(cè)（annexin-v/pi雙染法）克隆形成

5、（克隆形成實(shí)驗(yàn)）3、XXX作用機(jī)理研究（下游相關(guān)基因檢測(cè)）實(shí)驗(yàn)內(nèi)容：根據(jù)上述的實(shí)驗(yàn)結(jié)果確定XXX的功能后，對(duì)其相關(guān)基因進(jìn)行檢測(cè)（qPCR或WB法），確定XXX作用的信號(hào)傳導(dǎo)通路。相關(guān)基因可以是以前研究報(bào)道的，也可以是經(jīng)典的途徑如與凋亡相關(guān)的、增殖相關(guān)的或侵襲相關(guān)的途徑實(shí)驗(yàn)?zāi)康模捍_定XXX的作用機(jī)制4、XXX在動(dòng)物水平功能研究實(shí)驗(yàn)內(nèi)容：運(yùn)用慢病毒感染后的腫瘤細(xì)胞直接與對(duì)照細(xì)胞在裸鼠體內(nèi)成瘤，4周后比較瘤體大小，計(jì)算抑瘤率，也可以采用細(xì)胞成瘤后定點(diǎn)注射瘤體的方式進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，兩種方式互為驗(yàn)證，獲得一套高質(zhì)量的in vivo實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康模涸谡w水平驗(yàn)證XXX基因在腫瘤成瘤過程中的功能分組Contro

6、lNC-1RNAi-1NC-2RNAi-2組別說明空白對(duì)照用陰性對(duì)照病毒感染細(xì)胞成瘤用RNAi病毒感染細(xì)胞成瘤定點(diǎn)注射陰性對(duì)照病毒定點(diǎn)注射RNAi病毒5、XXX表達(dá)與臨床樣本的關(guān)系（可用組織芯片技術(shù)）實(shí)驗(yàn)內(nèi)容：收集腫瘤組織樣本，獲得相應(yīng)的蛋白和RNA，進(jìn)行XXX表達(dá)Pattern和表達(dá)量分析，臨床標(biāo)本進(jìn)行免疫組化檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)?zāi)康模河^察XXX表達(dá)情況和腫瘤的發(fā)生、轉(zhuǎn)移、藥物敏感性、預(yù)后的關(guān)系四、候選基因信息：AXXX；CXXX；EXXX；iXXX；NXXX（僅以以上幾個(gè)基因?yàn)槔?，我們基因?kù)中已有有效RNAi慢病毒顆粒）（考慮到科研工作的需要，把具體的基因信息隱去了，還請(qǐng)諒解?。〢XXX 2002年

7、才被克隆，屬于比較新的基因，它是大腸桿菌AXXb的同源物，涉及其研究的文章可以檢索到的總共大約有10篇左右，目前主要是停留在研究其作為雙脫氧酶可以通過氧化去甲基化催化去除DNA的1-methyladenine和3-methylcytosine，從而起到DNA修復(fù)的作用。該蛋白主要是與雙鏈DNA結(jié)合，2008年的nature剛剛報(bào)道了這種結(jié)合的晶體結(jié)構(gòu)。腫瘤方面只見到其在腦腫瘤中有高表達(dá)的報(bào)道。該基因的研究前景廣闊，可以從以下幾個(gè)方面：1該基因產(chǎn)物在腫瘤中的作用，包括腫瘤的生存、凋亡、對(duì)細(xì)胞周期的影響、對(duì)腫瘤浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移方面的作用。還可研究其是否可以作為腫瘤標(biāo)記物來輔助臨床診斷和治療?？蛇x擇得腫瘤

8、類型可以涵蓋各種各樣的腫瘤，因?yàn)闆]有同類報(bào)道，所有在腫瘤領(lǐng)域的發(fā)現(xiàn)都將是"在世界上第一次"。非常適合開展實(shí)驗(yàn)。如果有結(jié)果出來基本上可以確定該課題組在國(guó)際上的領(lǐng)先地位，應(yīng)該特別容易發(fā)文章，申請(qǐng)經(jīng)費(fèi)。2由于報(bào)道了其與DNA結(jié)合的晶體結(jié)構(gòu)，因此，可以針對(duì)這種結(jié)構(gòu)，設(shè)計(jì)其特異的抑制劑，所合成的抑制劑無論在基礎(chǔ)科研還是臨床治療（見2）領(lǐng)域，均有廣闊的應(yīng)用前景。有巨大的商業(yè)前景。 CXXX 2003年12月才被識(shí)別，屬于比較新的基因，涉及其研究的文章可以檢索到的總共大約有10篇左右，目前主要是停留在組學(xué)分析上，對(duì)基因的功能知之甚少，只見到2篇其在Crohn's disease和

9、ulcerative colitis中有相關(guān)性的報(bào)道。腫瘤方面未見任何報(bào)道。該基因的研究前景廣闊，可以從以下幾個(gè)方面研究：1該基因在正常和腫瘤組織的表達(dá)譜如何。適合開展實(shí)驗(yàn)。2該基因產(chǎn)物在腫瘤中的作用，包括腫瘤的生存、凋亡、對(duì)細(xì)胞周期的影響、對(duì)腫瘤浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移方面的作用。還可研究其是否可以作為腫瘤標(biāo)記物來輔助臨床診斷和治療?？蛇x擇的腫瘤類型可以涵蓋各種各樣的腫瘤，如果有結(jié)果出來基本上可以確定該課題組在國(guó)際上的領(lǐng)先地位，應(yīng)該特別容易發(fā)文章，申請(qǐng)經(jīng)費(fèi)。3根據(jù)生物信息學(xué)分析其屬于cyclin超家族的成員，有Cyclin box fold，有 Protein binding domain ，該結(jié)構(gòu)參與c

10、ell-cycle 和 transcription 調(diào)控。該結(jié)構(gòu)存在于cyclins, TFIIB和 Retinoblastoma (RB). cyclins 由8類cell cycle調(diào)節(jié)因子組成，可以起調(diào)節(jié)cyclin dependent kinases (CDKs)的 作用. TFIIB 是一個(gè)可以結(jié)合TATA box的轉(zhuǎn)錄因子. Cyclins, TFIIB 和RB 各帶有兩個(gè)拷貝的該結(jié)構(gòu)域?；谶@些可以參考上述幾個(gè)分子的功能設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)，看是否CXXX也有這些相似的功能。iXXX是抑癌基因家族中的一個(gè)較新的癌基因，直接抑制p53活性，由于p53的廣泛作用，ixxxx必然在多種腫瘤中發(fā)揮其促癌作用，可以想見其作用的腫瘤類型應(yīng)當(dāng)較多，但是目前研究報(bào)道尚少。機(jī)制方面，與p53的相互作用，應(yīng)是重要的研究方向?？梢詮囊韵聨讉€(gè)方面開展工作：1、該基因在正常和腫瘤的表達(dá)譜預(yù)實(shí)驗(yàn)2、該基因功能作用實(shí)驗(yàn)3、與P53蛋白作用關(guān)系及調(diào)控機(jī)制研究NXXX 1998年被基因定位，屬于研究結(jié)果比較少的基因，涉及其研究的文章可以檢索到的總共幾十篇，該