酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法

1、酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法 ELISA1. 定義 32. 原理 32.1 抗原抗體反響 32.2 免疫測(cè)定在臨床檢驗(yàn)中的應(yīng)用 53. ELISA的類(lèi)型53.1 雙抗體夾心法測(cè)抗原： 63.2 雙抗原夾心法測(cè)抗體 63.3 間接法測(cè)抗體 63.4 競(jìng)爭(zhēng)法測(cè)抗體 73.5 競(jìng)爭(zhēng)性測(cè)抗原 73.6 捕獲包被法測(cè)抗體 73.7 ABS-ELISA法 84. ELISA試劑的組成94.1 固相載體： 94.2 包被的方式 94.3 包被用抗原：天然抗原、重組抗原、合成多肽抗原。 104.4 包被的條件： 104.5 洗滌液： 104.7 酶的催化性； 114.8 結(jié)合物的制備 114.9 結(jié)合物的保存 124.

2、10 酶的底物 124.11 酶反響終止液 124.12 參考標(biāo)準(zhǔn)品 134.13 加樣： 134.14 保溫 134.15 保溫方式： 134.16 室溫溫育的反響 134.17 洗滌 144.18 顯色 144.19 比色 144.20 酶標(biāo)比色儀 154.21 結(jié)果判定 154.22 定量測(cè)定 164.23 ELISA的操作要點(diǎn)161. 定義酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay，簡(jiǎn)稱(chēng)ELISA采用抗原與 抗體的特異反響將待測(cè)物與酶連接， 然后通過(guò)酶與底物產(chǎn)生顏色反響， 對(duì)受檢物質(zhì)進(jìn)展定性 或定量分析的一種檢測(cè)方法。2. 原理采用抗原與抗體的

3、特異反響將待測(cè)物與酶連接， 然后通過(guò)酶與底物產(chǎn)生顏色反響， 可對(duì) 受檢物質(zhì)的定性或定量分析。2.1 抗原抗體反響2.1.1 可逆性 抗原與抗體結(jié)合形成抗原抗體復(fù)合物的過(guò)程是一種動(dòng)態(tài)平衡，其反響式為：Ag+Ab Ag Ab抗體的親和力affinity，可以用平衡常數(shù) K表示：K=AgAb/AgAb , Ag Ab的解 離程度與 K 值有關(guān)。高親和力抗體的抗原結(jié)合點(diǎn)與抗原的決定簇在空間構(gòu)型上非常適合，兩者結(jié)合結(jié)實(shí)，不易解離。解離后的抗原和抗體均能保持原有的構(gòu)造和活性。2.1.2 特異性抗原抗體的結(jié)合發(fā)生在抗原的決定簇與抗體的結(jié)合位點(diǎn)之間。 化學(xué)構(gòu)造和空間構(gòu)型互補(bǔ) 關(guān)系，具有高度的特異性。因此，在很

4、多時(shí)候，測(cè)定某一特定的物質(zhì)不需別離待測(cè)物。2.1.3 最適比例 只有當(dāng)抗原抗體的濃度比例是當(dāng)時(shí)，才出現(xiàn)可見(jiàn)反響。以沉淀反響為例Ab量固定，Ag量遞增AnrinrrwxcT-ssK<.mrAntitwiJ> pret jncJtr<tAiitinn adikdArritvHly-cscrs%EqwHLfirf»*nr?nnr圖1該理論的支持者網(wǎng)格學(xué)說(shuō)，其成立的三個(gè)條件：? 抗原多價(jià)，抗體雙價(jià)；? 二那么比例適宜；? Ag/Ab 過(guò)剩。當(dāng)抗原抗體濃度比例適宜時(shí)，抗體的兩個(gè)Fab段分別結(jié)合兩個(gè) Ag分子，相互穿插結(jié)合連接成巨大的網(wǎng)格狀立體聚合物，沉淀可見(jiàn)，如圖boAb/A

5、g過(guò)剩時(shí)，過(guò)剩方的結(jié)合價(jià)得不到飽和，大多數(shù)游離存在，只形成小分子復(fù)合物,沉淀不可見(jiàn)，如圖a, c, d o圖22.1.4 敏感性化學(xué)比色法的敏感度為 mg/mL水平；酶反響測(cè)定法的敏感度約為5-10卩g/mL;免疫測(cè)定中凝膠擴(kuò)散法和濁度法的敏感度與酶反響相仿；標(biāo)記的免疫敏感度可提高數(shù)千倍，達(dá)ng/mL水平。如 HBsAg,其敏感度可達(dá) 0.1 ng/mL。2.2免疫測(cè)定在臨床檢驗(yàn)中的應(yīng)用由于各種抗原成分，包括小分子的半抗原，均可用以制備特異性的抗血清或單克隆抗體，利用此抗體作為試劑就可測(cè)試標(biāo)本中的抗原，因此免疫測(cè)定的應(yīng)用范圍極廣。3. ELISA的類(lèi)型ELISA可用于測(cè)定抗原，也可用于測(cè)定抗體

6、。在這種測(cè)定方法中有三個(gè)必要的試劑：?免疫吸附劑：固相的抗原或抗體；?結(jié)合物：酶標(biāo)記的抗原或抗體；? 底物：酶催化的此物。常見(jiàn)的檢測(cè)方法有：雙抗體夾心測(cè)抗原、3.1雙抗體夾心法測(cè)抗原:< T d 41LH躡石&測(cè)：r規(guī)Ti此法適用于檢驗(yàn)各種蛋白質(zhì)等大分子抗原，例如HBsAg HBeAg、AFP等。只要獲得針對(duì)受檢抗原的特異性抗體，就可以用于包被固相載體和制備酶結(jié)合物而建立此法。3.2雙抗原夾心法測(cè)抗體用特異性抗原進(jìn)展包被和制備酶標(biāo)結(jié)合物。此法中受檢標(biāo)本不需稀釋?zhuān)?可直接用于測(cè)定,因此其敏感度相對(duì)高于間接法。乙肝標(biāo)志物中抗HBsAg的檢測(cè)常采用本法。本法關(guān)鍵在于酶標(biāo)抗原的制備，應(yīng)根

7、據(jù)抗原構(gòu)造的不同，尋找適宜的標(biāo)記方法。3.3間接法測(cè)抗體間接法的優(yōu)點(diǎn)是只要變換包被抗原就可利用同一酶標(biāo)抗抗體建立檢測(cè)相應(yīng)抗體的方法。圖4當(dāng)抗原材料中的干擾物質(zhì)不易除去,或不易得到足夠的純化抗原時(shí)，可用此法檢測(cè)特異性抗體。3.5競(jìng)爭(zhēng)性測(cè)抗原小分子抗原或半抗原缺乏可作為夾心法的兩個(gè)以上的位點(diǎn)，因此不能用雙抗體夾心法進(jìn)展測(cè)定，可以采用競(jìng)爭(zhēng)法模式。 其原理是標(biāo)本中的抗原和一定量的酶標(biāo)抗原競(jìng)爭(zhēng)與固相抗體 結(jié)合。標(biāo)本中的抗原含量越多，結(jié)合在固相上的酶標(biāo)抗原越少，最后顯色也越淺。小分子激素、藥物等多用此法。3.6捕獲包被法測(cè)抗體以IgM抗體為例。血清中針對(duì)某些抗原的特異性IgM常和非特異性IgM，以及特異性

8、IgG同時(shí)存在，后者會(huì)干擾IgM的測(cè)定。捕獲法那么較好地解決了上述問(wèn)題，其原理是先用抗人IgM卩鏈抗體包被固相載體，使血清中所有IgM（包括特異性與非特異性 IgM）均固定在固相上，經(jīng)洗滌去除IgG后，再測(cè)定特異性IgM。此方法目前主要用于檢測(cè)各類(lèi)早期感染 的特異性抗體IgM。3.7 ABS-ELISA法ABS為親和素avidin生物素biotin系統(tǒng)system的略語(yǔ)。親和素是一種糖蛋白， 分子量60000，每個(gè)分子由4個(gè)能和生物素結(jié)合的亞基組成。生物素為小分子化合物，分子 量244。用化學(xué)方法制成的衍生物素-羥基琥珀酰亞胺酯可與蛋白質(zhì)和糖等多種類(lèi)型的大小分子形成生物素標(biāo)記產(chǎn)物，標(biāo)記方法頗為

9、簡(jiǎn)便。生物素與親和素的結(jié)合具有很強(qiáng)的特異性， 其親和力較抗原抗體反響大得多，兩者一經(jīng)結(jié)合就極為穩(wěn)定。由于一個(gè)親和素可與 4個(gè)生物素分子結(jié)合，因此如把 ABS與ELISA法可分為酶標(biāo)記親和素-生物素LAB法和橋聯(lián)親和素-生物素ABC法兩種類(lèi)型。兩者均以生物素標(biāo)記的抗體或抗原代替原ELISA系統(tǒng)中的酶標(biāo)抗體抗原 。在 LAB 中，固相生物素先與不標(biāo)記的親和素反響，然后再加酶標(biāo)記的生 物素以進(jìn)一步提高敏感度。在早期， 親和素從蛋清中提取，這種卵親和素為堿性糖蛋白，與聚苯乙烯載體的吸附性很強(qiáng)，用于ELISA中可使本底增高。從鏈霉菌中提取的鏈霉親和素那么無(wú)此缺點(diǎn)，在ELISA應(yīng)用中有替代前者的趨勢(shì)。由于

10、ABS-ELISA較普通ELISA多用了兩種試劑，增加了操作步驟，在臨床檢驗(yàn)中ABS-ELISA用不多。4. ELISA試劑的組成ELISA試劑中有三個(gè)必要的組成局部：免疫吸附、結(jié)合物、酶的底物。常見(jiàn)的組成如下：? 已包被抗原或抗體的固相載體免疫吸附劑 ；? 酶標(biāo)記的抗原或抗體結(jié)合物 ；? 酶的底物；? 陰性對(duì)照品或陽(yáng)性對(duì)照品，參考標(biāo)準(zhǔn)品；? 結(jié)合物及標(biāo)本的稀釋液；? 洗滌液；? 酶反響終止液；4.1 固相載體：聚苯乙烯具有較強(qiáng)的吸附蛋白質(zhì)的性能， 抗體或蛋白質(zhì)抗原吸附其上后仍能保存原來(lái)的 免疫學(xué)活性。聚氯乙烯，對(duì)蛋白質(zhì)的吸附性能比聚苯乙烯高，但空白值也略高。良好的ELISA板應(yīng)該是吸附性能好

11、，空白值低，孔底透明度高，各板之間、同一板各孔 之間、同一條各孔之間性能相近。4.2 包被的方式將抗原或抗體固定在固相載體上的過(guò)程稱(chēng)為包被。 蛋白質(zhì)與聚苯乙烯固相載體是通過(guò)物理吸附結(jié)合的， 靠的是蛋白質(zhì)分子構(gòu)造上的疏水基 團(tuán)與固相載體外表的疏水基團(tuán)間的作用。 這種物理吸附是非常特異性的， 受蛋白質(zhì)的分子量、 等電點(diǎn)、 濃度等的影響。 大分子蛋白質(zhì)較小分子蛋白質(zhì)通常含有更多的疏水基團(tuán)，故更易吸附到固相載體外表。不易吸附的非蛋白質(zhì)抗原， 可用間接包被的抗原經(jīng)固相抗體的親和層析作用，包被在固相上的抗原純度大大提高，因此含雜質(zhì)較多的抗原也可采用捕獲包被法。親和素生物素，即用親和素先包被載體，參加生物素

12、化的DNA,這種包被方法均勻、結(jié)實(shí)，已擴(kuò)大應(yīng)用于各種抗原物質(zhì)的定量測(cè)定。脂類(lèi)物質(zhì)，無(wú)法與固相載體結(jié)合，可將其在有機(jī)溶劑例如乙醇中溶解后參加ELISA板孔中，開(kāi)蓋置冰箱過(guò)夜或冷風(fēng)吹干，待酒精揮發(fā)后，讓脂質(zhì)自然干固在固相外表。優(yōu)點(diǎn)：試驗(yàn)的特異性、敏感性均由此得以改善，重復(fù)性也好，抗原用量少，僅為直接包被的 1/10 乃至 1/100 。4.3 包被用抗原：天然抗原、重組抗原、合成多肽抗原。合成多肽抗原是抗原決定簇的氨基酸序列人工合成的多肽片段。 一般只含有一個(gè)抗原決 定簇，純度高、特異性也高。但由于分子量太小，往往難于直接吸附于固相上。借助于偶聯(lián) 物與固相載體的吸附，間接地結(jié)合到固相載體外表。包被

13、用抗體：IgG對(duì)聚苯乙烯有強(qiáng)吸附力，其聯(lián)接發(fā)生在Fc段上，抗體結(jié)合點(diǎn)暴露于外。取材于抗血清或含單克隆抗體的培養(yǎng)液，須除去雜抗體后才能用于ELISA以保證試驗(yàn)的特異性。腹水中單抗的濃度較高，特異性亦較強(qiáng)，因此不需要作吸收層析處理，直接包被。 在某些情況下，用多種單抗混合包被，可取得更好的效果。4.4 包被的條件：Ph9.6 碳酸鹽緩沖液；pH7.2 磷酸鹽緩沖液；Ph7-8 Tris-HCI 緩沖液；參加包被液后，在 4-8 C冰箱中放置過(guò)夜，37C中保溫2小時(shí)。包被濃度隨載體和包被 物的性質(zhì)可能有很大的變化， 每批材料需通過(guò)實(shí)驗(yàn)與酶結(jié)合物的濃度協(xié)調(diào)選定。 一般蛋白質(zhì) 的包被濃度為 10ng/m

14、L-20ug/mL 。封閉：在包被后， 用高濃度的無(wú)關(guān)蛋白質(zhì)溶液再包被的過(guò)程。 封閉讓大量無(wú)關(guān)的蛋白質(zhì)充填這 些空隙，從而排斥 ELISA后步驟中干擾物質(zhì)的再吸附。常用的封閉劑： 0.05%-0.5%BSA； 10%的小牛血清或 1%明膠；脫脂奶粉，比擬價(jià)廉，可以用高濃度 5%。4.5 洗滌液：在板式ELISA中,常用的稀釋液為含 0.05%吐溫20磷酸鹽緩沖液。4.6 結(jié)合物：即酶標(biāo)記的抗體或抗原是ELISA中關(guān)鍵的試劑。4.7 酶的催化性；抗體抗原的免疫活性；含有或少含有游離的抗體或抗原 ；結(jié)合物要有良好的穩(wěn)定性。結(jié)合物用的抗原和抗體制備結(jié)合物時(shí)所用純度較高的IgG,以免在與酶聯(lián)結(jié)時(shí)其他蛋

15、白的干擾。最好用層析純化的抗體， 這樣全部酶結(jié)合物均具有特異的免疫活性， 可以在高稀釋度進(jìn)展反響， 實(shí)驗(yàn)結(jié)果 本地淺淡。在ELISA中用酶標(biāo)抗原的模式不多，總的要求是抗原必須是高純度的。酶純度高,催化反響的轉(zhuǎn)化率高,專(zhuān)一性強(qiáng),性質(zhì)穩(wěn)定,來(lái)源豐富,價(jià)格不貴,受檢標(biāo)本 中不存在一樣的酶。酶結(jié)合物保存活性局部和催化能力, 底物易于制備和保存, 價(jià)格低廉, 有色產(chǎn)物易于測(cè) 定等。在ELISA中有HRPAP,葡萄糖氧化酶，B -D-半乳糖苷酶和脲酶等。HRP是一種糖蛋白，含糖量約為 18%，分子量為44000，是一種復(fù)合酶，由主酶酶蛋 白和輔基亞鐵血紅素結(jié)合而成,是一種卟啉蛋白質(zhì)。4.8 結(jié)合物的制備酶

16、標(biāo)記抗體的制備方法主要有兩種,即戊二醛交聯(lián)法和過(guò)碘酸鹽氧化法。 戊二醛交聯(lián)法：戊二醛是一種雙功能團(tuán)試劑,可使酶與蛋白質(zhì)的氨基酸通過(guò)它而聯(lián)結(jié)。有效結(jié)合率達(dá) 60%-70%和重復(fù)性好。但是交聯(lián)反響是隨機(jī)的,結(jié)合物的大小不一,酶與 酶,抗體與抗體之間也有可能交聯(lián),影響效果。過(guò)碘酸氧化法：適用含糖量較高的酶。過(guò)碘酸鈉將 HRP 分子外表的多糖氧化為醛基很 活潑,可與蛋白質(zhì)上的氨基形成 chiff 氏而結(jié)合。簡(jiǎn)單有效。結(jié)合物中混有的游離酶一般不影響ELISA中最后的酶的活性測(cè)定，但會(huì)與酶標(biāo)抗體競(jìng)爭(zhēng)相應(yīng)的固相抗原, 因此制備的酶結(jié)合物應(yīng)予純化, 去除游離的酶和抗體后用于檢測(cè), 效果更 好。制得結(jié)合物,最適

17、的工作濃度就是指結(jié)合物稀釋至這一濃度時(shí),能維護(hù)一個(gè)低的本底, 并獲得測(cè)定的最正確靈敏度,到達(dá)最適宜的測(cè)定條件和測(cè)定費(fèi)用的節(jié)省。4.9結(jié)合物的保存酶和抗體均為生物活性物質(zhì)，易失活。高濃度較為穩(wěn)定，凍干后可在普通冰箱中保存一 年左右。結(jié)合物溶液中參加等體積的甘油，參加蛋白保護(hù)劑。另外再參加抗生素例如慶大霉素和防腐劑HRP結(jié)合物加硫柳汞，AP結(jié)合物可加疊氮鈉。結(jié)合物的稀釋液用于稀釋高濃度的結(jié)合物以配成工作液。為防止結(jié)合物在反響中直接吸附在固相載體上：0.1%牛血清白蛋白，0.05%吐溫20。試劑盒均已用適宜的緩沖液配制成工作液，使用時(shí)不需 再行稀釋?zhuān)?-8 C保存期可達(dá)6個(gè)月。4.10酶的底物1)

18、 HRP的底物£DH2+ H2O2 D+ 2H2O上式中，DH2為受氧體，H2O2為受氫體。DH2 一般為無(wú)色化合物，經(jīng)酶作用后成為有色的產(chǎn)物。DH2如鄰苯二胺OPD、四甲基聯(lián)苯胺TMB和ABTSOPD氧化后的產(chǎn)物呈橙紅色，用酸終止酶反響后，在492nm處有最高吸收峰，靈敏度高，比色方便，是 HRP結(jié)合物最常用的底物。TMB經(jīng)HRP作用后的產(chǎn)物顯藍(lán)色。TMB性質(zhì)較穩(wěn)定，可配成溶液試劑，只需與 H2O2溶液混合即成應(yīng)用液。酶反響終止后，TMB產(chǎn)物由藍(lán)色呈黃色，可在比色計(jì)中定量，最適吸收波長(zhǎng)為450nm。ABTS雖不如OPD和TMB敏感，但空白值極低，也為一些試劑盒所采用。HRP對(duì)氫受體

19、的專(zhuān)一性很高，僅作用于H2O2、小分子醇的過(guò)氧化物和尿素過(guò)氧化物。AP的底物為磷酸酯酶，一般采用對(duì)硝基苯磷酸酯作為底物。產(chǎn)物為黃色的對(duì)硝基酚，在405nm波長(zhǎng)處有吸收峰。用 NaOH終止酶反響后，黃色可穩(wěn)定一段時(shí)間。AP也有發(fā)熒光底物磷酸4-甲基傘酮，可用于ELISA作熒光測(cè)定，敏感度較高于用顯色底物的比色法。4.11酶反響終止液常用的HRP反響終止液為硫酸，其濃度按加量及比色液的最終體積而異，在板式ELISA中一般采用2mol/L。對(duì)照設(shè)定陽(yáng)性對(duì)照品和陰性對(duì)照品是檢驗(yàn)試驗(yàn)有效性的控制品，同時(shí)也作為判斷結(jié)果的對(duì)照。陽(yáng)性對(duì)照品的根本組成應(yīng)盡量與檢測(cè)標(biāo)本的組成相一致， 多以含蛋白保護(hù)劑的緩沖液為

20、基質(zhì)。參加的量應(yīng)與試劑的敏感度想稱(chēng)； 在測(cè)定中得到的吸光值與受檢標(biāo)本吸光值比擬，可以估計(jì)標(biāo)本物質(zhì)的量。 陰性對(duì)照品須先行檢測(cè)確定不含待測(cè)物質(zhì)。例如 HBsAg 檢測(cè)的陰性對(duì)照品中不可含 HBsAg,最好抗 HBs也是陰性。4.12 參考標(biāo)準(zhǔn)品定量測(cè)定如甲胎蛋白質(zhì)，癌胚抗原測(cè)定等 應(yīng)含有制作標(biāo)準(zhǔn)曲線用的參考標(biāo)準(zhǔn)品，應(yīng) 包括覆蓋可檢測(cè)范圍的 4-5 個(gè)濃度，一般均配入含蛋白保護(hù)劑及防腐劑的緩沖液中。標(biāo)本的采取和保存 體液、分泌物、排泄物等均可作標(biāo)本以測(cè)定其中某種抗體或抗原成份。 以血清標(biāo)本為例，血漿含有纖維蛋白原、抗凝劑，其他成份同血清。血清標(biāo)本應(yīng)防止溶血。紅細(xì)胞溶解時(shí)會(huì)釋放出具有過(guò)氧化物酶活性的

21、物質(zhì)，以HRP 為標(biāo)記的ELISA測(cè)定中，可能會(huì)增加非特異性顯色。根本操作考前須知4.13 加樣：在ELISA中一般有3次加樣步驟，即加標(biāo)本，加酶結(jié)合物，加底物。加樣時(shí)應(yīng)將所加物 加在ELISA板孔的底部，防止加在孔壁上部，并注意不可濺出，不可產(chǎn)生氣泡。4.14 保溫抗原抗體完全反響的保溫過(guò)程稱(chēng)為溫育。ELISA屬于固相免疫測(cè)定，抗原、抗體的結(jié)合只在固相外表上發(fā)生。溫育常常用的溫度有 43C、37 C、室溫和4C等。37 C是實(shí)驗(yàn)室中常用的保溫溫度，也是大多數(shù)抗原抗體結(jié)合的適宜溫度。4.15 保溫方式：ELISA儀器附有特制的電熱塊、水浴。假設(shè)用保溫箱：ELISA板放在濕盒內(nèi)，在盒底墊濕的紗布

22、， 最后將ELISA板都放在濕紗布 上。反響板均不宜疊放，以保證格板的溫度都能迅速平衡。4.16 室溫溫育的反響操作時(shí)的室溫應(yīng)嚴(yán)格限制在規(guī)定的范圍內(nèi)，標(biāo)準(zhǔn)室溫溫度是指在20-25 C,但具體操作時(shí)可根據(jù)說(shuō)明書(shū) 要求控制溫育。應(yīng)注意溫育的溫度和時(shí)間應(yīng)按規(guī)定力求準(zhǔn)確。為保證這一 點(diǎn)，一個(gè)人操作時(shí)，一次不宜多于兩塊板同時(shí)測(cè)定。4.17 洗滌洗滌在ELISA過(guò)程中雖不是一個(gè)反響步驟，卻也決定著實(shí)驗(yàn)的成敗。ELISA洗滌：到達(dá)別離游離的和結(jié)合的酶標(biāo)記物的目的。去除殘留在板孔中游離的物質(zhì)，以及非特異性地吸附的干擾物質(zhì)。 聚苯乙烯等塑料對(duì)蛋白質(zhì)的吸附是普遍性的， 而在洗滌時(shí) 又應(yīng)把這種非特異性吸附的干擾物質(zhì)

23、洗滌下來(lái)。可以說(shuō)，在ELISA操作中，洗滌是最主要的關(guān)鍵技術(shù)。洗滌的方式除某些 ELISA儀器配有的特殊的自動(dòng)洗滌儀外，手工操作有流水沖洗式和浸泡式兩種。1) 流水沖洗式 流水沖洗法最初用于小珠載體的洗滌，洗滌液為蒸餾水，自來(lái)水。洗滌效果更為徹底，且也簡(jiǎn)便、 快速。已有實(shí)驗(yàn)說(shuō)明，流水沖洗式同樣適用于微量滴定板的洗滌。讓水流沖擊板 孔外表，洗滌效果更佳。2) 浸泡式微量滴定板多采用。 洗滌液為非離子型洗滌劑的中性緩沖液。 聚苯乙烯載體與蛋白質(zhì)的 結(jié)合是疏水性的， 非離子型洗滌劑既含有疏水基團(tuán)， 也含有親水基團(tuán)， 使蛋白質(zhì)回復(fù)到水溶 液狀態(tài)，從而脫離固相載體。4.18 顯色顯色是酶催化無(wú)色的底物生

24、成有色產(chǎn)物的溫育反響。 反響的溫度和時(shí)間仍然是影響顯色 的因素。在一定的時(shí)間內(nèi)，陰性孔可保持無(wú)色，而陽(yáng)性孔那么隨時(shí)間的延長(zhǎng)而呈色加強(qiáng)。適 當(dāng)提高溫度有助于加速顯色進(jìn)展。TMB 受光照的影響不大，可在室溫中置于操作臺(tái)上，邊反響觀察結(jié)果。但為保證試驗(yàn)結(jié)果的穩(wěn)定性，最好在規(guī)定的適當(dāng)時(shí)間閱讀結(jié)果。TMB經(jīng)HRP作用后，約40分鐘顯色達(dá)頂峰，隨即逐漸減弱，至 2 小時(shí)后即可完全消退至無(wú)色。4.19 比色拭干板底附著的液體，然后將板正確放入酶標(biāo)比色儀中。以蒸餾水校準(zhǔn)零點(diǎn)， 測(cè)量讀取底物孔 未經(jīng)任何反響僅僅添加底物溶液的孔 和空白孔 以生理鹽水或稀釋液代替標(biāo)本作全過(guò)程的孔 ，以記錄本次試驗(yàn)的試劑狀況。其后可

25、用空 白孔以蒸餾水校準(zhǔn)零點(diǎn)，以上各孔的吸光度需減去空白孔的吸光度，然后進(jìn)展計(jì)算。結(jié)果以光密度 oplical density,OD ,先按規(guī)定用吸光度 absorbence,A ，兩者含義一樣。通常的表示方法是，將吸收波長(zhǎng)寫(xiě)于A字母的右下角，如 OPD的吸收波長(zhǎng)為492nm，表示方法為“ A492nm "或“ OD492nm "。4.20 酶標(biāo)比色儀酶標(biāo)比色儀簡(jiǎn)稱(chēng)酶標(biāo)儀，通常指測(cè)讀ELISA光度計(jì)。針對(duì)固相載體形式不同，各有特制的適用于板、珠和小試管的設(shè)計(jì)。酶標(biāo)儀的主要性能指標(biāo)有：測(cè)讀速度、讀數(shù)的準(zhǔn)確性、重 復(fù)性、準(zhǔn)確度和可測(cè)量范圍、線性等等。優(yōu)良的酶標(biāo)儀的讀數(shù)一般可以準(zhǔn)確到0.001，準(zhǔn)確性為 ±1%，重復(fù)性達(dá) 0.5%