蛋白質(zhì)組學(xué)修改版

1、PCR 定義 ：聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)簡(jiǎn)稱PCR（英文全稱：PolymeraseChainReaction） 是體外酶促合成特異DNA片段的一種方法,由變性、退火及延伸等幾步反應(yīng)組成一個(gè)周期,循環(huán)進(jìn)行,使目的DNA得以迅速擴(kuò)增,具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、操作簡(jiǎn)便、省時(shí)等特點(diǎn)。它不僅可用于基因分離、克隆和核酸序列分析等基礎(chǔ)研究,還可用于疾病的診斷 原理：類似于DNA的天然復(fù)制過程，其特異性依賴于與靶序列兩端互補(bǔ)的寡核苷酸引物。PCR由變性-退火-延伸三個(gè)基本反應(yīng)步驟構(gòu)成：模板DNA的變性：模板DNA經(jīng)加熱至93左右時(shí)，使模板DNA雙鏈或經(jīng)PCR擴(kuò)增形成的雙鏈DNA解離，使之成為單鏈，以便它與引物結(jié)合，為下

2、輪反應(yīng)作準(zhǔn)備；模板DNA與引物的退火(復(fù)性)：模板DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后，溫度降至55左右，引物與模板DNA單鏈的互補(bǔ)序列配對(duì)結(jié)合；引物的延伸：DNA模板-引物結(jié)合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP為反應(yīng)原料，靶序列為模板，按堿基配對(duì)與半保留復(fù)制原理，合成一條新的與模板DNA鏈互補(bǔ)的半保留復(fù)制鏈。重復(fù)循環(huán)變性-退火-延伸三過程，就可獲得更多的“半保留復(fù)制鏈”，而且這種新鏈又可成為下次循環(huán)的模板。每完成一個(gè)循環(huán)需24分鐘，23小時(shí)就能將待擴(kuò)目的基因擴(kuò)增放大幾百萬倍。 步驟 ：標(biāo)準(zhǔn)的PCR過程分為三步： 1.DNA變性（90-96）：雙鏈DNA模板在熱作用下，氫鍵斷裂，形成單鏈DNA 2

3、.退火（25-65）：系統(tǒng)溫度降低，引物與DNA模板結(jié)合，形成局部雙鏈。 3.延伸（70-75）：在Taq酶（在72左右最佳的活性）的作用下，以dNTP為原料，從引物的5端3 端延伸，合成與模板互補(bǔ)的DNA鏈。每一循環(huán)經(jīng)過變性、退火和延伸，DNA含量既增加一倍。臨床應(yīng)用用于治療感染性疾病，腫瘤及遺傳病感染性疾病PCR對(duì)感染性疾病的診斷。PCR對(duì)病原體的檢測(cè)解決了免疫學(xué)檢測(cè)的“窗口期”問題，可判斷疾病是否處于隱性或亞臨床狀態(tài)。定量PCR研究表明，病原體數(shù)量與感染性疾病病情的輕重程度、傳染性及治療效果均有相關(guān)性。腫瘤癌基因的表達(dá)增加和突變，在許多腫瘤早期和良性的階段就可出現(xiàn)。PCR技術(shù)不但能有效的

4、檢測(cè)基因的突變，而且能準(zhǔn)確檢測(cè)癌基因的表達(dá)量，可據(jù)此進(jìn)行腫瘤早期診斷、分型、分期和預(yù)后判斷。幾乎所有慢性骨髓性白血病患者都可檢測(cè)到原癌基因易位導(dǎo)致的BCR/ABL融合基因形成，定量PCR技術(shù)可通過檢測(cè)BCR/ABL融合基因的表達(dá)確定微量殘余惡性細(xì)胞存在的數(shù)量，以此作為治療效果和估計(jì)復(fù)發(fā)的危險(xiǎn)性的依據(jù)。遺傳病PCR技術(shù)首次臨床應(yīng)用就是從檢測(cè)鐮狀細(xì)胞和-地中海貧血的基因突變開始的。基因的突變和缺失均會(huì)引起各種珠蛋白的表達(dá)不平衡，用FQ-PCR檢測(cè)各種珠蛋白基因表達(dá)差異，是地中海貧血診斷的有效手段下面就PCR在生物學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用簡(jiǎn)介如下：(1) 擴(kuò)增各種蛋白的基因：可用于基因重組、蛋白表達(dá)、構(gòu)建cDN

5、A文庫，目前所用的基因工程生物產(chǎn)品，絕大多數(shù)為通過PCR方法而獲得的目的基因。(2) PCR后的測(cè)序：可以很快地測(cè)出常規(guī)的PCR產(chǎn)物或單鏈的DNA序列。(3) 用于分子進(jìn)化和種系發(fā)育的研究：因?yàn)樵谝恍┚薮蠓肿拥男蛄兄泻凶銐虻倪M(jìn)化信息，通過PCR對(duì)其編碼基因的擴(kuò)增，并與較近或較遠(yuǎn)的種系比較，研究其分子進(jìn)化及種系發(fā)育是很有用的。(4) 分析和診斷遺傳性疾?。焊鶕?jù)其基因的缺失或突變對(duì)其做出診斷。如苯丙酮酸尿癥、地中海貧血等有特定的遺傳性基因，可以做出明確的診斷。(5)對(duì)人類HLA基因的多肽性分析，用于器官移植的配型。對(duì)于某些基因突變，如腫瘤發(fā)生的研究等均很有用。Western Blot：概念：We

6、stern免疫印跡（Western Blot）是將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到膜上，然后利用抗體進(jìn)行檢測(cè)。對(duì)已知表達(dá)蛋白，可用相應(yīng)抗體作為一抗進(jìn)行檢測(cè)，對(duì)新基因的表達(dá)產(chǎn)物，可通過融合部分的抗體檢測(cè)。原理：原理與Southern Blot或Northern Blot雜交方法類似，但Western Blot法采用的是聚丙烯酰胺凝膠電泳，被檢測(cè)物是蛋白質(zhì)，“探針”是抗體，“顯色”用標(biāo)記的二抗。經(jīng)過PAGE(聚丙烯酰胺凝膠電泳)分離的蛋白質(zhì)樣品，轉(zhuǎn)移到固相載體（例如硝酸纖維素薄膜）上，固相載體以非共價(jià)鍵形式吸附蛋白質(zhì)，且能保持電泳分離的多肽類型及其生物學(xué)活性不變。以固相載體上的蛋白質(zhì)或多肽作為抗原，與對(duì)應(yīng)的抗體起免疫

7、反應(yīng)，再與酶或同位素標(biāo)記的第二抗體起反應(yīng)，經(jīng)過底物顯色或放射自顯影以檢測(cè)電泳分離的特異性目的基因表達(dá)的蛋白成分。該技術(shù)也廣泛應(yīng)用于檢測(cè)蛋白水平的表達(dá)。操作步驟（一）蛋白質(zhì)樣品獲得：細(xì)菌誘導(dǎo)表達(dá)后，可通過電泳上樣緩沖液直接裂解細(xì)胞，真核細(xì)胞加勻漿緩沖液，機(jī)械或超聲波室溫勻漿0.5-1min。然后4，13,000g離心15min。取上清液作為樣品。（二）電泳：制備電泳凝膠，進(jìn)行SDS-PAGE。（三）轉(zhuǎn)移：（半干式轉(zhuǎn)移）1、電泳結(jié)束后將膠條割至合適大小，用轉(zhuǎn)膜緩沖液平衡，5min3次。2、膜處理：預(yù)先裁好與膠條同樣大小的濾紙和NC膜，浸入轉(zhuǎn)膜緩沖液中10min。3、轉(zhuǎn)膜：轉(zhuǎn)膜裝置從下至上依次按陽極

8、碳板、24層濾紙、NC膜、凝膠、24層濾紙、陰極碳板的順序放好，濾紙、凝膠、NC膜精確對(duì)齊，每一步去除氣泡，上壓500g重物，將碳板上多余的液體吸干。接通電源,恒流1mA/cm2，轉(zhuǎn)移1.5hr。轉(zhuǎn)移結(jié)束后，斷開電源將膜取出,割取待測(cè)膜條做免疫印跡。將有蛋白標(biāo)準(zhǔn)的條帶染色，放入膜染色液中50s后，在50%甲醇中多次脫色，至背景清晰，然后用雙蒸水洗，風(fēng)干夾于兩層濾紙中保存，留與顯色結(jié)果作對(duì)比。（四）免疫反應(yīng)：1、用0.01M PBS洗膜，5min 3次。2、加入包被液，平穩(wěn)搖動(dòng)，室溫2hr。3、棄包被液，用0.01M PBS洗膜，5min3次。4、加入一抗（按合適稀釋比例用0.01M PBS稀釋

9、，液體必須覆蓋膜的全部），4 放置12hr以上。陰性對(duì)照，以1%BSA取代一抗，其余步驟與實(shí)驗(yàn)組相同。5、棄一抗和1%BSA，用0.01M PBS分別洗膜，5min4次。6、加入辣根過氧化物酶偶聯(lián)的二抗（按合適稀釋比例用0.01M PBS稀釋），平穩(wěn)搖動(dòng)，室溫2hr。7、棄二抗，用0.01M PBS洗膜，5min4次。8、加入顯色液，避光顯色至出現(xiàn)條帶時(shí)放入雙蒸水中終止反應(yīng)。注意事項(xiàng)1、一抗、二抗的稀釋度、作用時(shí)間和溫度對(duì)不同的蛋白要經(jīng)過預(yù)實(shí)驗(yàn)確定最佳條件。2、顯色液必須新鮮配置使用，最后加入H2O2。3、DAB有致癌的潛在可能，操作時(shí)要小心仔細(xì)。蛋白質(zhì)電泳技術(shù)：1、 醋酸纖維素薄膜電泳 ：醋

10、酸纖維素薄膜電泳是以醋酸纖維素薄膜為支持物，它是纖維素的醋酸酯，由纖維素的羥基經(jīng)乙酰化而制成。醋酸纖維素膜薄是一種細(xì)密而又薄的微孔膜。醋酸纖維素膜對(duì)樣品的吸附性較小，因此，少量的樣品，甚至大分子物質(zhì)都能得以較高的分辨率。又由于醋酸纖維素薄膜親水性較小，故電滲作用也較小，并且它所容納的緩沖液也較少，因此電流的大部分由樣品傳導(dǎo)，可以加速樣品分離，大大節(jié)約電泳時(shí)間。醋酸纖維素具有操作簡(jiǎn)單、快速、價(jià)廉、定量容易等優(yōu)點(diǎn)。目前醋酸纖維素薄膜電泳己廣泛應(yīng)用于科學(xué)實(shí)驗(yàn)、生化產(chǎn)品分析和臨床化驗(yàn)，如分析檢測(cè)脂蛋白、糖蛋白、脫氫酶、多肽、核酸及其他生物大分子，為心血管疾病、肝硬化及某些癌癥鑒別診斷提供了可靠的依據(jù)，

11、因而已成為醫(yī)學(xué)和臨床檢驗(yàn)的常規(guī)技術(shù)。2、 瓊脂糖凝膠電泳：瓊脂糖凝膠電泳是一種以瓊脂糖凝膠為支持物的凝膠電泳，其分析原理與其它支持物電泳的最主要區(qū)別是：它兼有“分子篩”和“電泳”的雙重作用。瓊脂糖凝膠具有網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，直接參與帶電顆粒的分離過程，在電泳中，物質(zhì)分子通過空隙時(shí)會(huì)受到阻力，大分子物質(zhì)在泳動(dòng)時(shí)受到的阻力比小分子大，因此在凝膠電泳中，帶電顆粒的分離不僅依賴于凈電荷的性質(zhì)和數(shù)量，而且還取決于分子大小，這就大大地提高了分辨能力。但由于其孔徑相當(dāng)大，對(duì)大多數(shù)蛋白質(zhì)來說其分子篩效應(yīng)微不足道，現(xiàn)廣泛應(yīng)用于核酸的研究中。瓊脂糖是由半乳糖及其衍生物構(gòu)成的中性物質(zhì)，不帶電荷。而瓊脂膠是一種含硫酸根和羧基的

12、強(qiáng)酸性多糖，由于這些基團(tuán)帶有電荷，在電場(chǎng)作用下能產(chǎn)生較強(qiáng)的電滲現(xiàn)象。所以常用于血清蛋白、血紅蛋白、脂蛋白、糖蛋白等同工酶的分離和鑒定，為臨床某些疾病的鑒別診斷提供了可靠的依據(jù)。與免疫化學(xué)反應(yīng)相結(jié)合發(fā)展成為免疫電泳技術(shù)，用于分離和檢測(cè)抗原。3、 聚丙烯酰胺凝膠電泳 ：聚丙烯酰胺凝膠是由單體丙烯酰胺和交聯(lián)劑又稱為共聚體的N,N-甲叉雙丙烯酰胺（簡(jiǎn)稱Bis）在加速劑和催化劑的作用下聚合交聯(lián)成三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝膠，以此凝膠為支持物的電泳稱為聚丙烯酰胺凝膠電泳(簡(jiǎn)稱PAGE)。應(yīng)用范圍廣，可用于蛋白質(zhì)、酶、核酸等生物大分子的分離、定性、定量及少量的制備，還可測(cè)定分子量、等電點(diǎn)等。 4、 等電聚焦電泳 ：等

13、電聚焦電泳是利用具有pH梯度的電泳介質(zhì)來分離等電點(diǎn)(pI)不同的蛋白質(zhì)的電泳技術(shù)?；驹硎窃谥苽渚郾┌纺z凝膠時(shí)，在膠的混合液中加入載體兩性電解質(zhì)。含有載體兩性電解質(zhì)的凝膠，當(dāng)通以直流電時(shí)，載體兩性電解質(zhì)即形成一個(gè)從正極到負(fù)極連續(xù)增加的pH梯度。如果把蛋白質(zhì)加人此體系中進(jìn)行電泳時(shí)，不同的蛋白質(zhì)即移動(dòng)并聚焦于相當(dāng)其等電點(diǎn)的位置。好的載體兩性電解質(zhì)應(yīng)具有以下特點(diǎn)：在等電點(diǎn)處有足夠的緩沖能力，不易被樣品等改變其pH梯度；必須有均勻的足夠高的電導(dǎo)，以便使一定的電流通過；分子量不宜太大，便于快速形成梯度并從被分離的高分子物質(zhì)中除去；不與被分離物質(zhì)發(fā)生化學(xué)反應(yīng)或使之變性等。 等電聚焦電泳與其它區(qū)帶電泳比

14、較具有更高的分辨率，等電點(diǎn)僅差0.01pH的物質(zhì)即可分開；具有更好的濃縮效應(yīng)，很稀的樣品也可進(jìn)行分離，并且可直接測(cè)出蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)。所以此技術(shù)在高分子物質(zhì)的分離、提純和鑒定中的應(yīng)用日益廣泛。但是等電聚焦電泳技術(shù)要求有穩(wěn)定的pH梯度和使用無鹽溶液，而在無鹽溶液中蛋白質(zhì)易發(fā)生沉淀。DNA電泳技術(shù)：用于分離，鑒定和純化DNA片段方法主要有：1. 瓊脂糖凝膠電泳：分離范圍大50-百萬Bp的DNA均可以分離。水平方位，恒定強(qiáng)度和方向的電場(chǎng)。2. 聚丙烯酰胺凝膠電泳：適合分離小片段DNA（5-500BP），制備比較復(fù)雜，垂直方向進(jìn)行。3. 脈沖場(chǎng)電泳：兩個(gè)電場(chǎng)交互，電場(chǎng)方向有一定角度，可以分離非常大的片段

15、。DNA電泳與蛋白質(zhì)電泳區(qū)別：DNA電泳一般使用的都是瓊脂糖凝膠電泳，電泳的驅(qū)動(dòng)力靠DNA骨架本身的負(fù)電荷。 蛋白質(zhì)電泳（一般指SDS-PAGE）一般使用的都是聚丙烯酰胺凝膠電泳，電泳的驅(qū)動(dòng)力靠與蛋白質(zhì)結(jié)合的SDS上所攜帶的負(fù)電荷。 所以相同點(diǎn)就是樣品都是帶負(fù)電荷的，從負(fù)極向正極移動(dòng)，移動(dòng)的距離都和樣品的分子量有關(guān)。而且這兩個(gè)電泳體系可以互相交換使用。進(jìn)行大分子蛋白質(zhì)電泳時(shí)，可以考慮換用瓊脂糖凝膠，因?yàn)樵擉w系孔徑大。相反，如果需要精確到各位數(shù)堿基的DNA電泳也可以使用聚丙烯酰胺凝膠系統(tǒng)，因?yàn)槭褂迷撓到y(tǒng)可以將相差一個(gè)堿基的兩條DNA鏈分開。 不同點(diǎn)首先是樣品不同。其次是結(jié)果的觀察方法不同。DNA

16、電泳普遍使用EB做染料，在紫外燈下觀察；而蛋白電泳使用的考馬斯亮藍(lán)染色，還需要經(jīng)過脫色步驟。還有就是膠體系的差別，DNA電泳通常是一膠跑到底，而蛋白質(zhì)電泳則會(huì)有分離膠和濃縮膠之區(qū)別。 電泳中樣品移動(dòng)的本質(zhì)確實(shí)是樣品所攜帶的電荷。但是，區(qū)分這些條帶直接可以用分子量而無需使用電荷數(shù)，是因?yàn)檫@些樣品的電荷/分子量比都是恒定的了。變性梯度凝膠電泳變性梯度凝膠電泳（DGGE）是一種根據(jù)DNA片段的熔解性質(zhì)而使之分離的凝膠系統(tǒng)。最初是Lerman 等人于20 世紀(jì)80 年代初期發(fā)明的，起初主要用來檢測(cè)DNA 片段中的點(diǎn)突變。Muyzer 等人在1993 年首次將其應(yīng)用于微生物群落結(jié)構(gòu)研究 。后來又發(fā)展出其

17、衍生技術(shù)，溫度梯度凝膠電泳（temperature gradient gel electrophoresis，TGGE）。原理：雙鏈DNA 分子在一般的聚丙烯酰胺凝膠電泳時(shí)，其遷移行為決定于其分子大小和電荷。不同長度的DNA 片段能夠被區(qū)分開，但同樣長度的DNA 片段在膠中的遷移行為一樣，因此不能被區(qū)分。DGGE/TGGE 技術(shù)在一般的聚丙烯酰胺凝膠基礎(chǔ)上，加入了變性劑（尿素和甲酰胺）梯度，從而能夠把同樣長度但序列不同的DNA 片段區(qū)分開來。一個(gè)特定的DNA 片段有其特有的序列組成，其序列組成決定了其解鏈區(qū)域(meltingdomain, MD)和解鏈行為。當(dāng)變性劑濃度逐漸增加達(dá)到其最低的解鏈

18、區(qū)域濃度時(shí)，該區(qū)域這一段連續(xù)的堿基對(duì)發(fā)生解鏈。當(dāng)濃度再升高依次達(dá)到各其他解鏈區(qū)域濃度時(shí)，這些區(qū)域也依次發(fā)生解鏈。直到變性劑濃度達(dá)到最高的解鏈區(qū)域濃度后，最高的解鏈區(qū)域也發(fā)生解鏈，從而雙鏈DNA 完全解鏈。不同的雙鏈DNA 片段因?yàn)槠湫蛄薪M成不一樣，所以其解鏈區(qū)域及各解鏈區(qū)域的解鏈濃度也是不一樣的。當(dāng)它們進(jìn)行DGGE時(shí)，一開始變性劑濃度比較小，不能使雙鏈DNA 片段最低的解鏈區(qū)域解鏈，此時(shí)DNA 片段的遷移行為和在一般的聚丙烯酰胺凝膠中一樣。然而一旦DNA 片段遷移到一特定位置，其變性劑濃度剛好能使雙鏈DNA 片段最低的解鏈區(qū)域解鏈時(shí)，雙鏈DNA 片段最低的解鏈區(qū)域立即發(fā)生解鏈。部分解鏈的DNA

19、 片段在膠中的遷移速率會(huì)急劇降低。因此，同樣長度但序列不同的DNA 片段會(huì)在膠中不同位置處達(dá)到各自最低解鏈區(qū)域的解鏈濃度，因此它們會(huì)在膠中的不同位置處發(fā)生部分解鏈導(dǎo)致遷移速率大大下降，從而在膠中被區(qū)分開來。然而，一旦變性劑濃度達(dá)到DNA 片段最高的解鏈區(qū)域溫度時(shí)，DNA 片段會(huì)完全解鏈，成為單鏈DNA 分子，此時(shí)它們又能在膠中繼續(xù)遷移。因此如果不同DNA 片段的序列差異發(fā)生在最高的解鏈區(qū)域時(shí)，這些片段就不能被區(qū)分開來。在DNA 片段的一端加入一段富含GC 的DNA 片段（GC 夾子，一般30-50 個(gè)堿基對(duì)）可以解決這個(gè)問題。含有GC 夾子的DNA 片段最高的解鏈區(qū)域在GC 夾子這一段序列處，

20、它的解鏈濃度很高，可以防止DNA 片段在DGGE 膠中完全解鏈。簡(jiǎn)略版（在現(xiàn)代遺傳學(xué)中DNA 序列突變的分析占有十分重要的地位。由于在較大DNA 序列中檢測(cè)一個(gè)細(xì)微的突變非常困難，因而現(xiàn)在人們建立了幾種方法來解決這一難題。變性梯度凝膠電泳(DGGE)能把長度相同而核苷酸順序不同的雙鏈DNA 片段分開。這種方法利用了DNA 分子從雙螺旋型變成局部變性型時(shí)電泳遷移率會(huì)下降的現(xiàn)象。不同的DNA 片段發(fā)生這種變化所需梯度不同。DGGE 的凝膠中沿電場(chǎng)方向變性劑(甲醛和尿素)含量遞增，當(dāng)DNA片段通過這種變性劑遞增的凝膠時(shí)，不同分子的電泳遷移率在不同區(qū)域會(huì)發(fā)生降低。這就可使核苷酸順序不同DNA 片段分開

21、。此方法可作為測(cè)序的初始步驟在雜合個(gè)體中分離等位基因。許多研究表明變性遞度凝膠電泳分離能力很強(qiáng)，它可以把相差僅1bp 的DNA 片段分開。）實(shí)驗(yàn)步驟1PCR反應(yīng)（同前）其中，上游引物加40bp GC Clamp。2PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳確認(rèn)。3垂直變性梯度凝膠電泳變性梯度遞增的方向與電泳方向垂直。所使用的膠為6%聚丙烯酰胺凝膠，變性濃度為0100%。其中，含7 M尿素和40%去離子甲酰胺的膠為100%變性，不含尿素和去離子甲酰胺的膠為0%變性。垂直變性梯度凝膠電泳主要是檢測(cè)引物的最適解鏈條件（即變性濃度）。PCR產(chǎn)物加上樣緩沖液后上樣，300400l/孔，電壓150V，溫度60，時(shí)間24小

22、時(shí)。4平行變性梯度凝膠電泳變性梯度遞增的方向與電泳方向平行。根據(jù)垂直變性梯度凝膠電泳檢測(cè)的解鏈區(qū)域的變性濃度，制備相應(yīng)變性濃度的平行變性梯度凝膠，檢測(cè)各標(biāo)本是否存在突變。PCR產(chǎn)物加上樣緩沖液后，25l30l/孔，電壓150V，溫度60，時(shí)間36小時(shí)。5染色5分鐘，凝膠成像儀分析結(jié)果。注意事項(xiàng)1、該實(shí)驗(yàn)中提取DNA，以及DGGE操作中接觸到得很多藥品都有毒，還有致癌、變性等毒害，一定要嚴(yán)格操作，做好防護(hù)保護(hù)自己。2、嚴(yán)格按操作步驟Caspase（天冬氨酸特異性的半胱氨酸蛋白水解酶）：是一組存在于細(xì)胞質(zhì)中具有類似結(jié)構(gòu)的蛋白酶。它們的活性位點(diǎn)均包含Cys殘基，能夠特異性的切割靶蛋白Asp殘基后的肽

23、鍵。并且，caspase能選擇性的切割某些蛋白質(zhì)，從而造成細(xì)胞凋亡。與caspase有關(guān)的凋亡通路主要有兩種：一種是死亡受體介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)途徑，另一種是線粒體依賴途徑。 死亡受體介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)途徑:最具代表性的死亡受體是FADD(又名Fas或APO一11，是一種跨膜受體蛋白，既能與細(xì)胞外的CD95抗體及CD95配基結(jié)合。又能與細(xì)胞內(nèi)的接頭蛋白FADD結(jié)合，F(xiàn)ADD的C端含有死亡域DD, N端含有死亡效應(yīng)域DED。同時(shí)CD95及caspase-8分別含有DD及DED， 當(dāng)死亡誘導(dǎo)信號(hào)CD95抗體或 CD95配基作用于CD95后，CD95的構(gòu)象發(fā)生改變，通過其DD與FADD的DD結(jié)合, FADD又

24、通過DED與procaspase-8的DED結(jié)合共同形成死亡誘導(dǎo)信號(hào)復(fù)合物DISC，DISC形成后，可誘導(dǎo) pmcaspase-8自身激活，產(chǎn)生活性的caspase-8a/b，活化的caspase-8則進(jìn)一步激活下游的caspase-3, caspase-3激活后作用于特定的凋亡底物，引起細(xì)胞凋亡 。 總結(jié)Caspase:1.它是一種Cys蛋白酶，用Cys作為裂解底物的親核基團(tuán)2.其催化活性對(duì)底物的Asp有特異性要求，caspase以活性很低的酶原形式合成，通過蛋白酶水解去除氨基端的一段序列而被激活3.活化的caspase能夠特異地水解一套地物，從而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，此過程為不可逆反應(yīng)4.正常情況

25、下細(xì)胞內(nèi)總存在有Caspase的抑制劑，以防止caspase酶原偶然被激活而對(duì)正常細(xì)胞造成損傷。（看已下載的相關(guān)PPT）1.蛋白質(zhì)組學(xué)的定義及研究內(nèi)容蛋白質(zhì)組學(xué)(Proteomics)是研究在特定時(shí)間或環(huán)境下某個(gè)細(xì)胞或某種組織的基因組表達(dá)的全部蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)組學(xué)的真正含義在于：它不是按照傳統(tǒng)的方式孤立地研究某種蛋白質(zhì)分子的功能，而是應(yīng)用各種蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)研究某種蛋白質(zhì)在復(fù)雜的細(xì)胞環(huán)境中的功能。蛋白質(zhì)組學(xué)旨在列出全部蛋白質(zhì)的細(xì)目，弄清每一個(gè)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能及蛋白質(zhì)群體內(nèi)的相互作用，對(duì)比在疾病和健康狀態(tài)下它們的表達(dá)水平的變化。蛋白質(zhì)組學(xué)分為表達(dá)蛋白質(zhì)組學(xué)和細(xì)胞圖譜蛋白質(zhì)組學(xué)。前者利用各種先進(jìn)技術(shù)

26、研究蛋白質(zhì)表達(dá)的整體變化，即研究在機(jī)體的生長發(fā)育、疾病和死亡的不同階段中，細(xì)胞與組織的蛋白質(zhì)組分的變化；后者主要通過分離蛋白質(zhì)復(fù)合物系統(tǒng)地研究蛋白質(zhì)間的相互作用。研究蛋白質(zhì)組方法：蛋白質(zhì)組研究需要有足夠的技術(shù)支撐，如質(zhì)譜分析()，酵母雙雜交系統(tǒng)，蛋白質(zhì)微陣列技術(shù)以及能夠進(jìn)行大規(guī)模數(shù)據(jù)處理的計(jì)算機(jī)系統(tǒng)和軟件等6。現(xiàn)階段蛋白質(zhì)組的研究可分為3個(gè)主要步驟：應(yīng)用雙向凝膠電泳、“雙向”高效柱層析分離蛋白質(zhì)；應(yīng)用氨基酸組成分析、或末端氨基酸序列分析及質(zhì)譜分析鑒定所分離的蛋白質(zhì)；應(yīng)用生物信息學(xué)數(shù) 據(jù)庫對(duì)鑒定結(jié)果進(jìn)行存儲(chǔ)、處理、對(duì)比和分析。3.1雙向凝膠電泳雙向凝膠電泳(two-di mensionalpol

27、ycacrylamidegelelectrophoresis，2-D電泳)是分離蛋白質(zhì)最基本的工具。其原理是：第一向是等電聚集電泳：用值呈梯度排列的凝膠，分離等電點(diǎn)不同的蛋白質(zhì)。第二向是十二烷基磺酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDSPEGE)：由于帶負(fù)電荷的SDS可與蛋白質(zhì)多肽鏈結(jié)合，掩蓋了蛋白質(zhì)原有的電荷差別，故可分離分子量不同的蛋白質(zhì)。雙向凝膠電泳不僅用于蛋白質(zhì)的分離，同時(shí)也用于蛋白質(zhì)的純化，一張凝膠可分離純化出幾千個(gè)甚至上萬個(gè)蛋白質(zhì)。目前美國的Proteome公司已開發(fā)了一種全自動(dòng)化的儀器，灌腔、電泳、染色全部實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化。雙向凝膠電泳技術(shù)存在的問題是不易分離極酸或極堿、極大(200kD)或極小

28、(10kD)的蛋白質(zhì)，不易檢測(cè)低拷貝(1000拷貝)蛋白質(zhì)或難溶解蛋白質(zhì)。此外，還有三種新的方法可以用作對(duì)2電泳的補(bǔ)充：帶有同位素的親和性標(biāo)簽標(biāo)記法，二維液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)量法，毛細(xì)管區(qū)帶電泳。3.2“雙向”高效柱層析“雙向”高效柱層析原理：第一向用分子篩柱層析，按蛋白質(zhì)不同分子量進(jìn)行分離；第二向用反向柱層析，利用蛋白質(zhì)表面疏水性質(zhì)進(jìn)行分離。第二向的分離原理與雙向凝膠電泳中利用蛋白質(zhì)等電點(diǎn)分離完全不同，因此兩種方法可相互補(bǔ)充。雙向高效柱層析的優(yōu)點(diǎn)：(1)可分離得到較多的蛋白量以供鑒定；(2)可與質(zhì)譜分析聯(lián)用，分離流出的蛋白峰直接進(jìn)入質(zhì)譜儀進(jìn)行鑒定。3.3氨基酸組成分析氨基酸組成分析可提供蛋白質(zhì)

29、一級(jí)結(jié)構(gòu)信息。原理是用酸水解蛋白質(zhì)，測(cè)定蛋白質(zhì)中各氨基酸所占摩爾百分?jǐn)?shù)(%)或各氨基酸的摩爾比率，與數(shù)據(jù)庫中已知蛋白質(zhì)的理論值進(jìn)行比較。氨基酸組成分析經(jīng)濟(jì)、快速，但靈敏度低。3.4-或-端氨基酸序列分析-端氨基酸序列分析常用Edman降解法測(cè)定蛋白質(zhì)端氨基酸序列，端氨基酸序列分析常用羧肽酶法、化學(xué)降解法測(cè)定蛋白質(zhì)端氨基酸序列。目前均可用自動(dòng)測(cè)序儀。-端4個(gè)氨基酸殘基序列即可鑒定43%83%蛋白質(zhì)、-端5個(gè)氨基酸殘基序列即可鑒定74%97%蛋白質(zhì)，若兩者結(jié)合使用，判斷結(jié)果的準(zhǔn)確性會(huì)更高。3.5質(zhì)譜分析以往僅用于小分子揮發(fā)物質(zhì)的分析，由于新的離子化技術(shù)的出現(xiàn)，如：介質(zhì)輔助的激光解析/離子化、電噴霧

30、離子化，各種新的質(zhì)譜技術(shù)開始用于生物大分子的分析。其原理是：通過電離源將蛋白質(zhì)分子轉(zhuǎn)化為氣相離子，然后利用質(zhì)譜分析儀的電場(chǎng)、磁場(chǎng)將具有特定質(zhì)量與電荷比值(/值)的蛋白質(zhì)離子分離開來，經(jīng)過離子檢測(cè)器收集分離的離子，確定離子的/值，分析鑒定未知蛋白質(zhì)。質(zhì)譜技術(shù)主要用于檢測(cè)雙向凝膠電泳或“雙向”高效柱層析分離所得的蛋白質(zhì)及酶解所得的多肽的質(zhì)量，也可用于蛋白質(zhì)高級(jí)結(jié)構(gòu)及蛋白質(zhì)間相互作用等方面的研究。三條肽段的精確質(zhì)量數(shù)便可鑒定蛋白質(zhì)。近年來，串聯(lián)質(zhì)譜分析儀發(fā)展迅猛，其數(shù)據(jù)采集方面的自動(dòng)化程度、檢測(cè)的敏感性及效率都大大提高，大規(guī)模數(shù)據(jù)庫和一些分析軟件(如：SEQUEST)的應(yīng)用使得串聯(lián)質(zhì)譜分析儀可以進(jìn)行

31、更大規(guī)模的測(cè)序工作。目前，利用2電泳及技術(shù)對(duì)整個(gè)酵母細(xì)胞裂解產(chǎn)物進(jìn)行分析，已經(jīng)鑒定出1484種蛋白質(zhì)，包括完整的膜蛋白和低豐度的蛋白質(zhì)。3.6酵母雙雜交系統(tǒng)對(duì)于研究蛋白質(zhì)間的相互作用，酵母雙雜交系統(tǒng)是非常有力的工具。其基本原理是：由于所有真核生物轉(zhuǎn)錄激活因子都由兩部分獨(dú)立的功能域組成，即結(jié)合功能域()和激活功能域()。的作用是與特異的啟動(dòng)子結(jié)合，的作用是引導(dǎo)聚合酶復(fù)合物，兩者靠近并協(xié)同作用，才能使結(jié)合位點(diǎn)下游的基因得以轉(zhuǎn)錄。如果將待測(cè)蛋白之一與融合，蛋白之二與融合，若待測(cè)的兩種蛋白有相互作用，則和靠近并激活報(bào)道基因的轉(zhuǎn)錄，借此可研究蛋白質(zhì)間的相互作用。為了大規(guī)模高通量研究蛋白間的相互作用，近年

32、來發(fā)展了一種酵母雙雜交掃描法。首先建立兩類含不同文庫的酵母菌株，在第一類菌株中，讀碼框()以融合蛋白形成被表達(dá)，在第二類菌株中，以融合蛋白形式被表達(dá)，將兩類菌株配對(duì)，用缺陷的培養(yǎng)基篩選二倍體，只有表達(dá)兩種可以相互作用的蛋白質(zhì)的酵母細(xì)胞才可以在該培養(yǎng)基上生長。該方法的應(yīng)用模式有兩種：一種是微陣列模式，即先將第一類酵母菌(表達(dá)已知蛋白-融合蛋白)克隆在陣列的柵狀網(wǎng)孔內(nèi)，以此篩查第二類菌株(表達(dá)待測(cè)蛋白融合蛋白)，從而確定待測(cè)蛋白質(zhì)可與哪一已知蛋白質(zhì)相結(jié)合；另一種是庫篩查模式，即先將一組產(chǎn)生的融合蛋白建成一個(gè)庫，而后通過待測(cè)蛋白質(zhì)與庫中的蛋白質(zhì)的反應(yīng)尋找可以相互作用某個(gè)或某些蛋白質(zhì)。最近，從酵母雙雜

33、交系統(tǒng)衍生出一種新的方法，稱為“反向雙雜交”，主要用于鑒定可以干擾蛋白質(zhì)間相互作用的化合物和多肽。與傳統(tǒng)方式不同，這種方法可以用于開發(fā)在體內(nèi)具有活性的藥物。此外，酵母雙雜交系統(tǒng)的作用已經(jīng)擴(kuò)展至對(duì)蛋白質(zhì)的鑒定，通過這種方法已經(jīng)發(fā)現(xiàn)與酵母菌剪接相關(guān)的15種蛋白質(zhì)，以及噬菌體7的55種蛋白質(zhì)、痘苗病毒的226種蛋白質(zhì)、釀酒酵母的5345種蛋白質(zhì)。酵母雙雜交系統(tǒng)提供的蛋白質(zhì)間可能的相互作用的信息，還需通過進(jìn)一步的生物化學(xué)試驗(yàn)加以確定和排除。3.7微陣列技術(shù)嚴(yán)格的講，微陣列技術(shù)并非蛋白質(zhì)組技術(shù)的范疇，但是卻不失為大規(guī)模研究蛋白質(zhì)功能的一種好方法。通常在轉(zhuǎn)錄中受到協(xié)同調(diào)控的基因?qū)⒕幋a同種功能的蛋白質(zhì)，如果

34、某一段序列與已知功能的序列在很大程度上相同，說明它們編碼的蛋白質(zhì)的功能也可能相同，例如酵母細(xì)胞中與細(xì)胞分裂周期和芽孢形成相關(guān)的基因可能編碼功能相同的蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)陣列技術(shù)已經(jīng)發(fā)展起來，蛋白質(zhì)樣品以納升小滴共價(jià)吸附在玻璃、硅、塑料等載物片上，每一個(gè)載物片可以點(diǎn)10000個(gè)樣品，可用于鑒定一個(gè)生物有機(jī)體的全部修飾酶。例如：蛋白質(zhì)微陣列技術(shù)已經(jīng)檢測(cè)出酵母中近乎全套的蛋白激酶。3.8生物信息學(xué)蛋白質(zhì)組的研究要求有自動(dòng)化處理大規(guī)模數(shù)據(jù)的工具，從而促使生物信息學(xué)迅速發(fā)展。目前許多與蛋白質(zhì)組相關(guān)的軟件可通過與EXPASY蛋白質(zhì)組學(xué)服務(wù)器鏈接而獲得(./.)，這些軟件可用于鑒定蛋白質(zhì)的種類，分析蛋白質(zhì)的理化特

35、性，預(yù)測(cè)可能的翻譯后修飾以及蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)，其中注釋蛋白質(zhì)和二維凝膠電泳數(shù)據(jù)庫是蛋白質(zhì)組研究的生物信息學(xué)核心。4.蛋白質(zhì)組學(xué)與疾病蛋白質(zhì)組學(xué)可以讓我們對(duì)人類疾病的發(fā)病機(jī)制有更加清楚的認(rèn)識(shí)。在基因水平檢測(cè)基因的突變和多態(tài)性，在蛋白質(zhì)水平分析健康及病變組織不同水平的基因表達(dá)，對(duì)于疾病的發(fā)病機(jī)制的研究二者均具有重要意義，但對(duì)于疾病的診斷治療方面后者更為重要。正常及患病個(gè)體的組織、體液中的蛋白質(zhì)分布、特征及差異都是將蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)應(yīng)用于分子診斷學(xué)的基礎(chǔ)。例如：骨髓瘤患者尿液中沉淀物?BenceJones蛋白、抗上皮細(xì)胞腫瘤特異性抗體、病變肝細(xì)胞中的53蛋白均可以作為腫瘤的標(biāo)記，用于腫瘤的診斷。目前，

36、應(yīng)用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)已發(fā)現(xiàn)許多與癌癥相關(guān)的異常糖基化的蛋白質(zhì)，但將這些研究結(jié)果應(yīng)用于臨床診斷其價(jià)值尚待評(píng)估。到目前為止，心功能障礙的發(fā)病機(jī)制仍未闡明。如果用蛋白質(zhì)組學(xué)的研究方法分析心肌蛋白質(zhì)表達(dá)的變化，將為闡明心臟疾病相關(guān)的細(xì)胞病變機(jī)制提供新的思路，也將有助于發(fā)現(xiàn)新的診斷標(biāo)記、治療方法。人類心臟蛋白質(zhì)聯(lián)合二維電泳數(shù)據(jù)庫(./.)已建立，目前已鑒定幾百種心臟蛋白質(zhì)。對(duì)于感染性疾病而言，由于許多微生物的部分或全部基因組的測(cè)序工作已經(jīng)完成，這將有助于鑒定該微生物所產(chǎn)生的全部蛋白質(zhì)，以尋找新的診斷標(biāo)記，尋找用作疫苗的抗原及毒力決定簇等。5.蛋白質(zhì)組與藥物開發(fā)藥物作用的靶標(biāo)多為蛋白質(zhì)。如何發(fā)現(xiàn)更多的藥物作

37、用的靶蛋白是藥品開發(fā)面臨的主要挑戰(zhàn)。蛋白質(zhì)組研究能發(fā)現(xiàn)那些在健康人組織細(xì)胞中正常表達(dá)或不存在，而在患者組織細(xì)胞中異常表達(dá)或出現(xiàn)的蛋白質(zhì)，為藥品開發(fā)提供新的藥物靶標(biāo)，或新的生物標(biāo)記，還能發(fā)現(xiàn)與藥物毒性相關(guān)的蛋白質(zhì)，用于預(yù)報(bào)藥物的毒副作用，從而減少到臨床試驗(yàn)階段才發(fā)現(xiàn)該藥物的副作用所造成的中間階段的損耗。除了藥物作用的靶蛋白的選擇外，觀察藥物對(duì)靶蛋白的作用及藥物毒性的研究也同樣重要。在這一研究領(lǐng)域中，可采用CD-標(biāo)記(CD-tagging)技術(shù)研究用藥期間蛋白質(zhì)組中的任一成員在分子和細(xì)胞水平的各種變化。其原理是將帶有CD-tagging的CD盒插入某一個(gè)表達(dá)基因的內(nèi)含子，結(jié)果該基因轉(zhuǎn)錄的增加了一段

38、外來序列，該基因編碼的蛋白質(zhì)增加了一個(gè)特殊的外來肽?抗原決定簇或熒光蛋白，這種外來肽作為標(biāo)記物，可用高效價(jià)的抗體識(shí)別或各種熒光檢測(cè)方法觀察，標(biāo)記的基因及轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的變化可用多聚酶鏈反應(yīng)()、逆轉(zhuǎn)錄多聚酶鏈反應(yīng)()、測(cè)序等方法觀察。因此，標(biāo)記技術(shù)可用來研究基因的轉(zhuǎn)錄、翻譯水平的變化，評(píng)估基因的功能狀態(tài)，探查蛋白質(zhì)表達(dá)的組織特異性，以及蛋白質(zhì)在細(xì)胞或細(xì)胞器中的定位，等等。該項(xiàng)技術(shù)的特點(diǎn)是：(1)尤其適用于標(biāo)記內(nèi)含子豐富的基因；(2)被標(biāo)記的基因、轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物及蛋白質(zhì)均保留正常的功能；(3)不影響基因的正常調(diào)控；(4)可在組織細(xì)胞原位觀察研究標(biāo)記基因、標(biāo)記蛋白；(5)也可從組織細(xì)胞中分離提純標(biāo)記蛋白，然后

39、用于生化、功能檢查。蛋白質(zhì)組學(xué)正日漸走向成熟。相信對(duì)于未來醫(yī)學(xué)的發(fā)展，無論是基礎(chǔ)、臨床研究，還是藥物開發(fā)，蛋白質(zhì)組學(xué)的貢獻(xiàn)都將不可估量。蛋白質(zhì)組學(xué)(proteomics) ：指應(yīng)用各種技術(shù)手段來研究蛋白質(zhì)組的一門新興科學(xué)，其目的是從整體的角度分析細(xì)胞內(nèi)動(dòng)態(tài)變化的蛋白質(zhì)組成成份、表達(dá)水平與修飾狀態(tài)，了解蛋白質(zhì)之間的相互作用與聯(lián)系，揭示蛋白質(zhì)功能與細(xì)胞生命活動(dòng)規(guī)律蛋白質(zhì)組學(xué)常用的研究方法：酵母雙雜交系統(tǒng)、抗體芯片、LCM技術(shù)、mic Solution Inc、SPR技術(shù)、色譜分離技術(shù)、雙相電泳技術(shù)、有機(jī)質(zhì)譜等等。 LCM技術(shù)獲得的細(xì)胞可以用于蛋白質(zhì)樣品的制備。蛋白質(zhì)樣品中的不同類型的蛋白質(zhì)可以通過

40、二維電泳進(jìn)行分離。膠染色后可以利用凝膠圖象分析系統(tǒng)成像，然后通過分析軟件對(duì)蛋白質(zhì)點(diǎn)進(jìn)行定量分析，并且對(duì)感興趣的蛋白質(zhì)點(diǎn)進(jìn)行定位。Genomic Solution可以為研究者提供除質(zhì)譜外的所有蛋白質(zhì)組學(xué)研究工具，包括二維電泳系統(tǒng)，成像系統(tǒng)及分析軟件，膠切割系統(tǒng)，蛋白質(zhì)消化濃縮工作站，點(diǎn)樣工作站等；同時(shí)還可以提供相關(guān)試劑和消耗品。蛋白質(zhì)相互作用的研究，酵母雙雜交和噬菌體展示技術(shù)無疑是很好的研究方法。LCM-二維電泳-質(zhì)譜的技術(shù)路線是典型的一條蛋白質(zhì)組學(xué)研究的技術(shù)路線，除此以外，LCM-抗體芯片也是一條重要的蛋白質(zhì)組學(xué)研究的技術(shù)路線。版本二：【一 雙向電泳。雙向電泳(2-DE)與質(zhì)譜(MS)的結(jié)合是

41、最常見的蛋白質(zhì)組學(xué)的研究手段。雙向電泳包括第一向等電聚焦(IEF)和第二向SDS-PAGE。雙向電泳可以提供包含有分子量和等電點(diǎn)信息的二維圖譜二 多維色譜法。在多維色譜法中，蛋白樣品通常先被消化成肽段，然后經(jīng)過離子交換、反相HPLC而被分離。該方法的中HPLC可以直接和質(zhì)譜偶聯(lián)，可有效的分析極酸或極堿、高度疏水等傳統(tǒng)2-DE方法難以分析的蛋白質(zhì)，而且易于實(shí)現(xiàn)分析的自動(dòng)化。三 熒光差異凝膠電泳技術(shù)(DIGE)。DIGE可用三種不同的熒光染料來分別對(duì)樣品進(jìn)行標(biāo)記，熒光染料可以通過酰胺鍵與蛋白質(zhì)的賴氨酸-氨基共價(jià)結(jié)合。將標(biāo)記的樣品混合然后在同一塊雙向電泳凝膠上分離。這樣在一塊雙向電泳凝膠上可獲得三幅

42、圖像，即在一塊凝膠內(nèi)分析不同的蛋白樣品。DIGE有效地改善了傳統(tǒng)2-DE的重復(fù)性。四 定量蛋白質(zhì)組學(xué)方法： ICAT(isotope-coded affinity tags)方法。ICAT是用于定量蛋白質(zhì)組學(xué)研究的穩(wěn)定同位素標(biāo)簽法的一種。在穩(wěn)定同位素標(biāo)簽法中，質(zhì)譜可以通過識(shí)別標(biāo)記的肽段和未標(biāo)記的肽段之間的信號(hào)強(qiáng)度差異來達(dá)到定量的目的。在ICAT方法中，帶有生物素半分子的同位素標(biāo)簽對(duì)樣品中蛋白質(zhì)的半胱氨酸殘基進(jìn)行標(biāo)記，標(biāo)記的蛋白樣品經(jīng)過消化成為肽段后，經(jīng)陽離子交換色譜和親和素親和純化，然后進(jìn)入質(zhì)譜鑒定。相同肽段在質(zhì)譜上會(huì)表現(xiàn)為雙峰，峰的強(qiáng)度直接反應(yīng)了該肽段對(duì)應(yīng)的蛋白質(zhì)在兩種樣品中的相對(duì)強(qiáng)度。IC

43、AT的缺點(diǎn)是無法標(biāo)記缺乏半胱氨酸殘基的蛋白質(zhì)、會(huì)丟失轉(zhuǎn)錄后修飾信息、相同肽段由于標(biāo)記上的差異在HPLC中會(huì)產(chǎn)生不一致的洗脫表現(xiàn)以及增加的生物素基團(tuán)會(huì)增加質(zhì)譜解析的復(fù)雜性。 cICAT (cleavable isotope-coded affinity tags)。也是穩(wěn)定同位素標(biāo)簽法，基于ICAT。cICAT采用了13C和酸性可裂解生物素而克服了ICAT的部分缺點(diǎn)。 iTRAQ 。iTRAQ(isobaric tags for relative and absolute quantitation)法可同時(shí)分析多達(dá)四個(gè)不同樣品的，該方法不會(huì)丟失轉(zhuǎn)錄后修飾信息，因而可以用于信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中的蛋白質(zhì)磷酸化

44、修飾的研究。蛋白質(zhì)組學(xué)在生物醫(yī)學(xué)方面的應(yīng)用：主要包括幾個(gè)方面:通過尋找差異表達(dá)蛋白質(zhì),以發(fā)現(xiàn)疾病相關(guān)的蛋白質(zhì);尋找用于診斷的疾病相關(guān)的標(biāo)記分子;尋找疾病相關(guān)的蛋白質(zhì)藥靶,以用于藥物設(shè)計(jì);研究疾病的致病機(jī)理等。以下將對(duì)這幾個(gè)方面進(jìn)行簡(jiǎn)要的綜述：常見的幾種研究差異表達(dá)蛋白的蛋白質(zhì)組學(xué)方法包括蛋白芯片技術(shù)、雙向電泳技術(shù)、多維液相色譜技術(shù)以及它們和質(zhì)譜鑒定的有機(jī)結(jié)合臨床醫(yī)藥對(duì)人類而言，蛋白質(zhì)組學(xué)的研究最終要服務(wù)于人類的健康，主要指促進(jìn)分子醫(yī)學(xué)的發(fā)展。如尋找藥物的靶分子。很多藥物本身就是蛋白質(zhì)，而很多藥物的靶分子也是蛋白質(zhì)。藥物也可以干預(yù)蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用。 在基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)和疾病機(jī)理研究中，了解人不同發(fā)

45、育、生長期和不同生理、病理?xiàng)l件下及不同細(xì)胞類型的基因表達(dá)的特點(diǎn)具有特別重要的意義。這些研究可能找到直接與特定生理或病理狀態(tài)相關(guān)的分子，進(jìn)一步為設(shè)計(jì)作用于特定靶分子的藥物奠定基礎(chǔ)。生物信息學(xué)：生物信息學(xué)(Bioinformatics)是研究生物信息的采集，處理，存儲(chǔ)，傳播，分析和解釋等各方面的一門學(xué)科，它通過綜合利用生物學(xué)，計(jì)算機(jī)科學(xué)和信息技術(shù)而揭示大量而復(fù)雜的生物數(shù)據(jù)所賦有的生物學(xué)奧秘。蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)庫是蛋白質(zhì)組研究水平的標(biāo)志和基礎(chǔ)。瑞士的SWISS-PROT擁有目前世界上最大，種類最多的蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)庫。丹麥、英國、美國等也都建立了各具特色的蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)庫。生物信息學(xué)的發(fā)展已給蛋白質(zhì)組研究提供了

46、更方便有效的計(jì)算機(jī)分析軟件；特別值得注意的是蛋白質(zhì)質(zhì)譜鑒定軟件和算法發(fā)展迅速。最近發(fā)展的質(zhì)譜數(shù)據(jù)直接搜尋基因組數(shù)據(jù)庫使得質(zhì)譜數(shù)據(jù)可直接進(jìn)行基因注釋、判斷復(fù)雜的拼接方式。隨著基因組學(xué)的迅速推進(jìn)，會(huì)給蛋白質(zhì)組研究提供更多更全的數(shù)據(jù)庫。另外，對(duì)肽序列標(biāo)記的從頭測(cè)序軟件也十分引人注目。生物信息學(xué)基本概念早在1956年，在美國田納西州蓋特林堡召開的首次“生物學(xué)中的信息理論研討會(huì)”上，便產(chǎn)生了生物信息學(xué)的概念。1987年，林華安博士正式把這一學(xué)科命名為“生物信息學(xué)”（Bioinformatics）。被尊稱為“生物信息學(xué)之父”。生物信息學(xué)（Bioinformatics）：(1)生物信息學(xué)包含了生物信息的獲取

47、、處理、儲(chǔ)存、分析和解釋等在內(nèi)一門交叉學(xué)科，(2)它綜合運(yùn)用數(shù)學(xué)、計(jì)算機(jī)科學(xué)和生物學(xué)的各種工具進(jìn)行研究，(3)目的在于闡明大量生物學(xué)數(shù)據(jù)所包含的生物學(xué)意義。生物信息學(xué)當(dāng)前的主要研究任務(wù)蛋白質(zhì)組學(xué)： （1）蛋白質(zhì)組圖像數(shù)據(jù)處理，蛋白及其修飾鑒定（2）構(gòu)建蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫，相關(guān)軟件的開發(fā)和應(yīng)用；（3）蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)、功能預(yù)測(cè)；（4）蛋白質(zhì)連鎖圖。生物信息學(xué)的研究內(nèi)容 生物信息學(xué)主要包括以下幾個(gè)主要研究領(lǐng)域：1、序列比對(duì)（Alignment）。 基本問題是比較兩個(gè)或兩個(gè)以上符號(hào)序列的相似性或不相似性。序列比對(duì)是生物信息學(xué)的基礎(chǔ)，非常重要。兩個(gè)序列的比對(duì)有較成熟的動(dòng)態(tài)規(guī)劃算法，以及在此基礎(chǔ)上編寫的比對(duì)軟件包B

48、ALST和FASTA，可以免費(fèi)下載使用。這些軟件在數(shù)據(jù)庫查詢和搜索中有重要的應(yīng)用。有時(shí)兩個(gè)序列總體并不很相似，但某些局部片斷相似性很高。Smith-Waterman算法是解決局部比對(duì)的好算法，缺點(diǎn)是速度較慢。兩個(gè)以上序列的多重序列比對(duì)目前還缺乏快速而又十分有效的算法。 2、結(jié)構(gòu)比對(duì)。 基本問題是比較兩個(gè)或兩個(gè)以上蛋白質(zhì)分子空間結(jié)構(gòu)的相似性或不相似性。已有一些算法。 3、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)，包括2級(jí)和3級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)，是最重要的課題之一。 從方法上來看有演繹法和歸納法兩種途徑。前者主要是從一些基本原理或假設(shè)出發(fā)來預(yù)測(cè)和研究蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和折疊過程。分子力學(xué)和分子動(dòng)力學(xué)屬這一范疇。后者主要是從觀察和總結(jié)已知

49、結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)規(guī)律出發(fā)來預(yù)測(cè)未知蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)。同源模建和指認(rèn)（Threading）方法屬于這一范疇。雖然經(jīng)過30余年的努力，蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)研究現(xiàn)狀遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足實(shí)際需要。 4、計(jì)算機(jī)輔助基因識(shí)別(僅指蛋白質(zhì)編碼基因)。 基本問題是給定基因組序列后，正確識(shí)別基因的范圍和在基因組序列中的精確位置.這是最重要的課題之一，而且越來越重要。經(jīng)過20余年的努力，提出了數(shù)十種算法，有十種左右重要的算法和相應(yīng)軟件上網(wǎng)提供免費(fèi)服務(wù)。原核生物計(jì)算機(jī)輔助基因識(shí)別相對(duì)容易些，結(jié)果好一些。從具有較多內(nèi)含子的真核生物基因組序列中正確識(shí)別出起始密碼子、剪切位點(diǎn)和終止密碼子，是個(gè)相當(dāng)困難的問題，研究現(xiàn)狀不能令人滿意，仍有大量的

50、工作要做。 5、非編碼區(qū)分析和DNA語言研究，是最重要的課題之一。 在人類基因組中，編碼部分進(jìn)展總序列的35%，其它通常稱為“垃圾”DNA，其實(shí)一點(diǎn)也不是垃圾，只是我們暫時(shí)還不知道其重要的功能。分析非編碼區(qū)DNA序列需要大膽的想象和嶄新的研究思路和方法。DNA序列作為一種遺傳語言，不僅體現(xiàn)在編碼序列之中，而且隱含在非編碼序列之中。 6、分子進(jìn)化和比較基因組學(xué)，是最重要的課題之一。 早期的工作主要是利用不同物種中同一種基因序列的異同來研究生物的進(jìn)化，構(gòu)建進(jìn)化樹。既可以用DNA序列也可以用其編碼的氨基酸序列來做，甚至于可通過相關(guān)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)比對(duì)來研究分子進(jìn)化。以上研究已經(jīng)積累了大量的工作。近年來由

51、于較多模式生物基因組測(cè)序任務(wù)的完成，為從整個(gè)基因組的角度來研究分子進(jìn)化提供了條件?？梢栽O(shè)想，比較兩個(gè)或多個(gè)完整基因組這一工作需要新的思路和方法，當(dāng)然也渴望得到更豐碩的成果。這方面可做的工作是很多的。 7、序列重疊群（Contigs）裝配。 一般來說，根據(jù)現(xiàn)行的測(cè)序技術(shù)，每次反應(yīng)只能測(cè)出500 或更多一些堿基對(duì)的序列，這就有一個(gè)把大量的較短的序列全體構(gòu)成了重疊群（Contigs）。逐步把它們拼接起來形成序列更長的重疊群，直至得到完整序列的過程稱為重疊群裝配。拼接EST數(shù)據(jù)以發(fā)現(xiàn)全長新基因也有類似的問題。已經(jīng)證明，這是一個(gè)NP-完備性算法問題。 8、遺傳密碼的起源。 一種最簡(jiǎn)單的理論認(rèn)為，密碼子與

52、氨基酸之間的關(guān)系是生物進(jìn)化歷史上一次偶然的事件而造成的，并被固定在現(xiàn)代生物最后的共同祖先里，一直延續(xù)至今。不同于這種“凍結(jié)”理論，有人曾分別提出過選擇優(yōu)化、化學(xué)和歷史等三種學(xué)說來解釋遺傳密碼。隨著各種生物基因組測(cè)序任務(wù)的完成，為研究遺傳密碼的起源和檢驗(yàn)上述理論的真?zhèn)翁峁┝诵碌乃夭摹?9基于結(jié)構(gòu)的藥物設(shè)計(jì)。 人類基因組計(jì)劃的目的之一在于闡明人的約10萬種蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)、功能、相互作用以及與各種人類疾病之間的關(guān)系，尋求各種治療和預(yù)防方法，包括藥物治療。基于生物大分子結(jié)構(gòu)的藥物設(shè)計(jì)是生物信息學(xué)中的極為重要的研究領(lǐng)域。為了抑制某些酶或蛋白質(zhì)的活性，在已知其3級(jí)結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上，可以利用分子對(duì)接算法，在計(jì)算機(jī)

53、上設(shè)計(jì)抑制劑分子，作為候選藥物。這種發(fā)現(xiàn)新藥物的方法有強(qiáng)大的生命力，也有著巨大的經(jīng)濟(jì)效益。 10、其他。 如基因表達(dá)浦分析，代謝網(wǎng)絡(luò)分析；基因芯片設(shè)計(jì)和蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)分析等，逐漸成為生物信息學(xué)中新興的重要研究領(lǐng)域。這里不再贅述生物信息學(xué)在蛋白質(zhì)中的應(yīng)用：蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)庫： 2.11水稻蛋白組數(shù)據(jù)庫2.12Swiss-2Dpage數(shù)據(jù)庫2.2基于蛋白質(zhì)序列信息的數(shù)據(jù)庫2.21蛋白質(zhì)信息資源數(shù)據(jù)庫2.22Swiss-Prot數(shù)據(jù)庫其他蛋白數(shù)據(jù)庫蛋白質(zhì)芯片蛋白質(zhì)芯片是一種高通量的蛋白功能分析技術(shù)，可用于蛋白質(zhì)表達(dá)譜分析，研究蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)的相互作用，甚至DNA蛋白質(zhì)、RNA蛋白質(zhì)的相互作用，篩選藥物作

54、用的蛋白靶點(diǎn)等。蛋白芯片主要有三類：蛋白質(zhì)微陣列、微孔板蛋白質(zhì)芯片、三維凝膠塊芯片等。原理：蛋白芯片技術(shù)的研究對(duì)象是蛋白質(zhì)，其原理是對(duì)固相載體進(jìn)行特殊的化學(xué)處理，再將已知的蛋白分子產(chǎn)物固定其上（如酶、抗原、抗體、受體、配體、細(xì)胞因子等），根據(jù)這些生物分子的特性，捕獲能與之特異性結(jié)合的待測(cè)蛋白（存在于血清、血漿、淋巴、間質(zhì)液、尿液、滲出液、細(xì)胞溶解液、分泌液等），經(jīng)洗滌、純化，再進(jìn)行確認(rèn)和生化分析；它為獲得重要生命信息（如未知蛋白組分、序列。體內(nèi)表達(dá)水平生物學(xué)功能、與其他分子的相互調(diào)控關(guān)系、藥物篩選、藥物靶位的選擇等）提供有力的技術(shù)支持。蛋白質(zhì)芯片應(yīng)用：1.基因表達(dá)的篩選AngelikaL等人從

55、人胎兒腦的cDNA文庫中選出92個(gè)克隆的粗提物制成蛋白質(zhì)芯片，用特異性的抗體對(duì)其也進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果的準(zhǔn)確率在87%以上，而用傳統(tǒng)的原位濾膜技術(shù)準(zhǔn)確率只達(dá)到63%。與原位濾膜相比，用蛋白質(zhì)芯片技術(shù)在同樣面積上可容納更多的克隆，靈敏度可達(dá)到pg級(jí)。2.抗原抗體檢測(cè)在CavinM等人的實(shí)驗(yàn)中，蛋白質(zhì)芯片上的抗原抗體反應(yīng)體現(xiàn)出很好的特異性，在一塊蛋白質(zhì)芯片上10800個(gè)點(diǎn)中，根據(jù)抗原抗體的特異性結(jié)合檢測(cè)到唯一的1個(gè)陽性位點(diǎn)。這種特異性的抗原抗體反應(yīng)一旦確立，就可以利用這項(xiàng)技術(shù)來度量整個(gè)細(xì)胞或組織中的蛋白質(zhì)的豐富程度和修飾程度。其次利用蛋白質(zhì)芯片技術(shù)，根據(jù)與某一蛋白質(zhì)的多種組分親和的特征，篩選某一抗原的未

56、知抗體，將常規(guī)的免疫分析微縮到芯片上進(jìn)行，使免疫檢測(cè)更加方便快捷。3.篩選及研究常規(guī)篩選蛋白質(zhì)主要是在基因水平上進(jìn)行，基因水平的篩選雖已被運(yùn)用到任意的cDNA文庫，但這種文庫多以噬菌體為載體，通過噬菌斑轉(zhuǎn)印技術(shù)在一張膜上表達(dá)蛋白質(zhì)。但由于許多蛋白質(zhì)不是全長基因編碼，而且真核基因在細(xì)菌中往往不能產(chǎn)生正確折疊的蛋白質(zhì)，況且噬菌斑轉(zhuǎn)移不能縮小到毫米范圍進(jìn)行，所以這種方法的局限性，靠蛋白質(zhì)芯片彌補(bǔ)。酶作為一種特殊的蛋白質(zhì)，可以用蛋白質(zhì)芯片來研究酶的底物、激活劑、抑制劑等。蛋白質(zhì)芯片為蛋白質(zhì)功能研究提供了新的方法，合成的多肽及來源于細(xì)胞的蛋白質(zhì)都可以用作制備蛋白質(zhì)芯片的材料。Uetz將蛋白質(zhì)芯片引入酵母

57、雙雜交研究中，大大提高了篩選率。建立了含6O0O個(gè)酵母蛋白的轉(zhuǎn)化子，每個(gè)都具有開放性可閱讀框架（Open Reading Frame，0FR）的融合蛋白作為酵母雙雜交反應(yīng)中的激活區(qū)，此蛋白質(zhì)芯片檢測(cè)到192個(gè)酵母蛋白與此發(fā)生陽性反應(yīng)。生化反應(yīng)的檢測(cè)對(duì)酶活性的測(cè)定一直是臨床生化檢驗(yàn)中不可缺少的部分。Cohen用常規(guī)的光蝕刻技術(shù)制備芯片、酶及底物加到芯片上的小室，在電滲作用中使酸及底物經(jīng)通道接觸，發(fā)生酶促反應(yīng)。通過電泳分離，可得到熒光標(biāo)記的多肽底物及產(chǎn)物的變化，以此來定量酶促反應(yīng)結(jié)果。動(dòng)力學(xué)常數(shù)的測(cè)定表明該方法是可行的，而且，熒光物質(zhì)穩(wěn)定。藥物篩選疾病的發(fā)生發(fā)展與某些蛋白質(zhì)的變化有關(guān)，如果以這些蛋白質(zhì)構(gòu)筑芯片，對(duì)眾多候選化學(xué)藥物進(jìn)行篩選，直接篩選出與靶蛋白作用的化學(xué)藥物，將大大推進(jìn)藥物的開發(fā)。蛋白質(zhì)芯片有助于了解藥物與其效應(yīng)蛋白的相互作用，并可以在對(duì)化學(xué)藥物作用機(jī)制不甚了解的情況下直接研究蛋白質(zhì)譜。還可以將化學(xué)藥物作用與疾病聯(lián)系起來，以及藥物是否具有毒副作用、判定藥物的治療效果，為指導(dǎo)臨床用藥提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。另外，蛋白芯片技術(shù)還可對(duì)中藥的真?zhèn)魏陀行С煞诌M(jìn)行快速鑒定和分析。疾病診斷蛋白質(zhì)芯片技術(shù)在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中有著潛在的廣闊應(yīng)用前景。蛋白質(zhì)芯片能夠同時(shí)檢測(cè)生物樣品中與某種疾病或者環(huán)境因素?fù)p傷可能相關(guān)