醫(yī)院人感染H7N9禽流感病毒核酸檢測標準操作程序

1、醫(yī)院人感染H7N9禽流感病毒核酸檢測標準操作程序 一、目的確保人感染H7N9禽流感病毒核酸檢測過程標準化、規(guī)范化，降低人為不規(guī)范操作對檢測結(jié)果造成的影響，保證結(jié)果的準確性和可重復(fù)性。二、適用范圍醫(yī)療機構(gòu)臨床基因擴增檢驗實驗室按照關(guān)于醫(yī)院開展人感染H7N9禽流感病毒核酸檢測有關(guān)工作的通知（衛(wèi)辦醫(yī)政函2013383號）和關(guān)于做好醫(yī)療機構(gòu)人感染H7N9禽流感檢測試劑供給保障工作的通知（衛(wèi)發(fā)明電201329號）有關(guān)要求，使用國家疾病預(yù)防控制中心制備或商品化試劑盒開展人感染H7N9禽流感病毒核酸檢測工作。三、樣本采集、運送和保存盡量采集病例發(fā)病早期的呼吸道樣本(上呼吸道樣本包括咽拭子、鼻拭子、

2、鼻咽抽取物、咽漱液和鼻洗液, 下呼吸道樣本包括痰液、氣管吸取物、肺洗液、肺組織等)?？蓪⒈?、咽拭子收集于同一采樣管中，以便提高檢出率。患者有下呼吸道樣本時，應(yīng)優(yōu)先采集。 根據(jù)試劑說明書對樣本采集方法有關(guān)要求，制訂樣本采集標準操作程序（SOP），并組織樣本采集人員進行培訓(xùn)及考核。樣本的采集應(yīng)當(dāng)嚴格按照SOP進行。樣本采集后，按照人間傳染病的病原微生物名錄中高致病性禽流感病毒的相關(guān)規(guī)定進行包裝，用密封容器立即送往實驗室。若氣溫高時，需放入冰塊降溫。樣本抵達實驗室后，應(yīng)盡快進行檢測，24小時內(nèi)能檢測的樣本可置于28暫時保存，24小時內(nèi)無法檢測的樣本則應(yīng)置于-70狀態(tài)保存。如無-70保存條件時，可于-

3、20冰箱暫存。樣本避免反復(fù)凍融。樣本采集、處理、運輸及保存不當(dāng)時，可因病毒RNA降解出現(xiàn)假陰性結(jié)果，也可因為樣本“污染”出現(xiàn)假陽性結(jié)果。四、PCR檢測（一）樣本處理樣本的核酸提取應(yīng)當(dāng)在樣本處理區(qū)進行。按所采用的商品化試劑盒說明書要求，取適量待檢樣本、陽性及陰性對照進行核酸提取。樣本應(yīng)盡可能新鮮，提取過程應(yīng)嚴防RNA酶污染及操作不當(dāng)導(dǎo)致的RNA降解。提取過程如涉及離心步驟，應(yīng)采用低溫冷凍離心機；在生物安全柜內(nèi)進行加樣、提取過程中，為防止RNA降解，可將試管架置于托盤內(nèi)平鋪的碎冰上。提取好的RNA應(yīng)及時用于檢測，否則應(yīng)當(dāng)-70保存。如無-70保存條件，可于-20冰箱暫存。（二）試劑準備試劑準備應(yīng)當(dāng)

4、在試劑準備區(qū)進行。根據(jù)所用的試劑盒，樣本可進行甲型流感病毒核酸、禽流感H7亞型或H7N9病毒核酸的檢測。試劑的配制按所用商品化試劑盒說明書進行。除酶混合物外，其它試劑在使用前應(yīng)當(dāng)在室溫充分復(fù)融，混勻并瞬時低速離心。反應(yīng)液分裝時盡量避免產(chǎn)生氣泡，上機前注意檢查各反應(yīng)管是否蓋緊，以免管內(nèi)溶液泄露污染儀器。分裝有擴增反應(yīng)液的反應(yīng)管應(yīng)當(dāng)扣蓋或裝入密實袋內(nèi)再轉(zhuǎn)移至樣本處理區(qū)。（三）加樣加樣應(yīng)當(dāng)在樣本處理區(qū)進行。加樣時應(yīng)當(dāng)使樣品完全落入反應(yīng)液中，不應(yīng)有樣品粘附于管壁上，加樣后應(yīng)盡快蓋緊管蓋。按試劑、儀器說明書完成加樣和PCR反應(yīng)管準備。（四）PCR擴增檢測PCR擴增檢測在擴增區(qū)進行。待檢PCR管轉(zhuǎn)移至擴增

5、區(qū)，按順序置于PCR儀上，編輯樣本信息，按試劑和儀器說明書設(shè)定循環(huán)參數(shù)。（五）結(jié)果分析根據(jù)所用試劑盒說明書設(shè)置基線值（baseline）。熒光閾值（threshold）設(shè)定以閾值線剛好超過陰性對照品擴增曲線（無規(guī)則的噪音線）的最高點為原則，且Ct值應(yīng)大于所設(shè)置的擴增循環(huán)數(shù)（或顯示為undet）。使用儀器配套軟件自動分析結(jié)果。（六）質(zhì)量控制檢測過程對可能出現(xiàn)的假陽性和假陰性進行質(zhì)量控制，除了檢測商品試劑盒所提供陽性和陰性對照外，每次臨床樣本檢測時，至少應(yīng)當(dāng)有1份弱陽性和3份陰性質(zhì)控樣本（多份陰性質(zhì)控樣本設(shè)置對實驗室“污染”所致假陽性的監(jiān)控更為有效），隨機放在所檢測標本的中間。弱陽性質(zhì)控樣本可為檢

6、測陽性的滅活稀釋后保存的臨床樣本、滅活病毒或假病毒顆粒等，如所采用的商品化試劑盒有“內(nèi)標”控制假陰性，或弱陽性質(zhì)控樣本來源困難，可暫不設(shè)弱陽性質(zhì)控。陰性質(zhì)控樣本采用標本采集管內(nèi)溶液即可。質(zhì)控樣本應(yīng)與臨床標本同等對待，參與樣本核酸提取和擴增檢測全過程。試劑盒中的陽性和陰性對照用于判斷實驗室的有效性，按試劑盒說明書進行。（七）實驗結(jié)果的判定與解釋。按照試劑盒說明書進行。對于出現(xiàn)弱陽性結(jié)果的樣本應(yīng)進行重復(fù)檢測，并注意與可能的實驗室輕度或樣本交叉“污染”所致假陽性結(jié)果區(qū)別。五、檢測結(jié)果報告按照試劑盒說明書進行。六、其它注意事項（一）人感染H7N9禽流感病毒實驗室活動、樣本采集和運輸按照人間傳染的病原微

7、生物名錄中高致病性禽流感病毒進行管理。從事人感染禽流感檢測的技術(shù)人員必須經(jīng)過生物安全培訓(xùn)并具備相應(yīng)的實驗技能，在檢測過程中必須采取生物安全防護措施（使用眼罩、N95型口罩等）。樣本核酸提取必須在級生物安全實驗室，經(jīng)過年檢合格的二級生物安全柜內(nèi)進行。實驗室應(yīng)具有良好的通風(fēng)。（二）注意儀器設(shè)備的日常和定期維護，加樣器、擴增儀和溫育設(shè)備應(yīng)進行定期校準。試劑盒及一次性使用的無DNA酶和RNA酶PCR反應(yīng)管、離心管、帶濾芯吸頭等應(yīng)進行每批質(zhì)檢。（三）實驗應(yīng)嚴格分區(qū)操作；各區(qū)物品、工作服等均應(yīng)當(dāng)專區(qū)專用，不得交叉使用。實驗后應(yīng)及時清潔工作臺，以防污染。（四）每批實驗室后，可采取實驗室通風(fēng)、10%次氯酸鈉溶

8、液擦洗地臺面、紫外照射等措施，消除可能存在的擴增產(chǎn)物氣溶膠污染。（五）使用中國疾控中心制備試劑開展檢測工作時，可參考相應(yīng)試劑盒說明書（見附件1、2）有關(guān)要求。 附件：1.H7N9亞型禽流感病毒RNA檢測試劑盒（熒光PCR法）說明書2.H7N9禽流感病毒核酸檢測試劑盒（PCR-熒光探針法）說明書    H7N9亞型禽流感病毒RNA檢測試劑盒（熒光PCR法）說明書 【產(chǎn)品名稱】通用名稱：H7N9亞型禽流感病毒RNA檢測試劑盒（熒光PCR法） 英文名稱：Diagnostic Kit for H7N9 subtype avian flu vi

9、rus RNA（Fluorescence PCR）【包裝規(guī)格】48人份/盒。【預(yù)期用途】本試劑用于對咽拭子樣本中H7N9亞型禽流感病毒RNA進行定性檢測，用于H7N9禽流感病毒感染的輔助診斷及流行病學(xué)監(jiān)控。【檢驗原理】根據(jù)熒光PCR技術(shù)原理，針對H7N9亞型禽流感病毒的HA基因和NA基因設(shè)計特異性引物和Taqman探針，通過熒光PCR檢測儀進行檢測，從而實現(xiàn)對H7N9亞型禽流感病毒RNA的定性檢測。試劑盒以正常人上皮細胞中廣泛存在的核糖核酸酶P（RNase P）的mRNA為正常人體細胞對照，對提取和檢測過程進行監(jiān)控。【主要組成成分】  名稱成分規(guī)格數(shù)量(管)H7反應(yīng)液含內(nèi)標

10、RNP 、H7亞型特異基因的引物探針混合液1.0ml/管1N9反應(yīng)液含內(nèi)標RNP 、N9亞型特異基因的引物探針混合液1.0ml/管1DNA聚合酶DNA聚合酶，不可用其他同類DNA聚合酶替代60l /管1逆轉(zhuǎn)錄酶逆轉(zhuǎn)錄酶，不可用其他同類逆轉(zhuǎn)錄酶替代60l /管1陽性對照RNP、H7、N9 RNA假病毒混合物1.0ml/管1陰性對照DEPC水1.0ml/管1本品各組成成分均不得與其他產(chǎn)品或不同批號產(chǎn)品中的相應(yīng)組成成分進行互換。 本品不包含，但對試驗必須的設(shè)備和試劑：生物安全柜、臺式離心機、旋渦震蕩器、拭子、采樣管、無菌病毒采樣液、1.5 ml無核酸酶的離心管、全自動熒光PCR檢測儀專用P

11、CR擴增管和核酸分離試劑盒(硅膠膜吸附法，北京金豪制藥股份有限公司，Cat：BJH101)?！緝Υ鏃l件及有效期】-20冷凍保存，有效期2個月，陽性對照反復(fù)凍融次數(shù)不得超過5次?！具m用儀器】RG3000、LightCycler、ABI Prism 7500、ABI Prism 7000型全自動熒光PCR檢測儀。【樣本要求】1. 樣本類型：咽拭子。推薦使用金豪公司生產(chǎn)的微生物采樣及運送管（12人份/盒）。2. 拭子、采樣管和保存液：2.1拭子選擇：應(yīng)使用頭部為合成纖維（例如，聚酯纖維），桿部為鋁或塑料的拭子。2.2采樣管：外螺旋口、耐-70凍存，可容納3 ml病毒采樣液。2.3無菌病毒采樣液：應(yīng)含

12、有蛋白質(zhì)穩(wěn)定劑，阻止細菌和真菌生產(chǎn)的抗生素，緩沖液，經(jīng)無菌處理。3.樣本采集、運輸和保存：由于H7N9亞型禽流感病毒為呼吸道傳播病毒，有關(guān)生物安全應(yīng)按照“人間傳染的病原微生物名錄”中高致病性禽流感病毒進行管理。3.1采集：采集病人發(fā)病3日內(nèi)的咽拭子標本，用于病原檢測。用微生物采樣及運送管內(nèi)的采樣棉簽，適度用力拭抹咽后壁和兩側(cè)扁桃體部位，應(yīng)避免觸及舌部；迅速將棉簽放入裝有3ml保存液的15ml外螺旋蓋采樣管中，在靠近頂端處折斷棉簽桿，旋緊管蓋并密封，以防干燥，外表貼上帶有唯一識別號碼的標簽。4暫存并在48小時內(nèi)送達實驗室。3.2保存和運輸：新鮮采集樣本應(yīng)在4條件下48小時運送到檢測實驗室。保存樣

13、本可在-20以下低溫冷凍保藏，需長期保存的標本存于-70冰箱。冷凍樣本應(yīng)在冷凍條件下送至實驗室。運輸時在包裝箱內(nèi)填充吸水材料，運輸過程中保持標本采集管直立狀態(tài)，不能傾斜。樣本送至實驗室后，立即進行處理和分裝，避免反復(fù)凍融。臨床樣本保存在4不能超過4天。4.咽拭子標本的處理咽拭子要在標本保存液中充分攪動（至少 40 下），以洗脫拭子上粘附的病毒及含有病毒的細胞等，用于病毒分離時，需要凍融一次（防止多次凍融），使細胞破裂，釋放病毒顆粒。然后在4條件下，10000rpm離心20分鐘，用上清接種細胞或直接提取RNA。如果發(fā)現(xiàn)有細菌污染，須用濾器過濾除菌?！緳z驗方法】1. 核酸提?。喝?00l咽拭子樣本

14、進行核酸提取。采用北京金豪制藥股份有限公司的核酸分離試劑盒 (硅膠膜吸附法)，該試劑盒可用于對呼吸道懸浮液樣本中的病毒RNA提取，并按試劑盒說明書要求操作。本品的陽性對照和陰性對照均參與核酸提取。1.1. 準備及注意事項：1.1.1 分別在洗液A瓶和洗液B瓶中加入16ml和60ml無水乙醇，顛倒充分混勻，并在瓶身上加以標識。1.1.2  吸取所需的洗脫液，加至一無核酸酶的eppendorf管中，于70預(yù)熱。1.1.3  冷凍樣本應(yīng)室溫融化，輕微震蕩混勻后使用。1.1.4  區(qū)分操作中的離心設(shè)置（rpm和g），本產(chǎn)品操作過程均為室溫離心。1.1.5  助沉

15、劑在低溫保存時可能呈膠狀，吹打混勻即可使用。1.2. 樣本裂解及核酸吸附1.2.1  在1.5ml無核酸酶的離心管中加入10l助沉劑和400l裂解液，加入200l待處理樣本，劇烈震蕩2分鐘，室溫靜置10分鐘。注：如樣本體積小于或大于200l，需按比例改變助沉劑、裂解液以及無水乙醇體積。體積大于400l樣本應(yīng)分多次進行處理。1.2.2  加入480l無水乙醇，顛倒混勻，吸取600l裂解混合物轉(zhuǎn)移到核酸吸附柱中。注：如樣本體積小于或大于200l，需按比例改變乙醇用量。1.2.3  3500g離心2分鐘，取下套管，倒掉套管中的液體。將剩余裂解混合物轉(zhuǎn)移至核酸吸附柱，重新

16、離心一次，棄套管中的液體。1.2.4  將核酸吸附柱重新裝入套管，6000g離心1分鐘，倒掉套管中的液體。1.3. 核酸純化1.3.1  將核酸吸附柱重新裝入套管，在核酸吸附柱中加入500l洗液A，6000g離心1分鐘，將核酸吸附柱裝入一個干凈套管中。1.3.2  在核酸吸附柱中加入500l洗液B，靜置1分鐘，6000g離心1分鐘。1.3.3  倒掉套管中的液體，將核酸吸附柱重新裝入套管。1.3.4  重復(fù)一次1.3.2步驟(本步驟不用靜置1分鐘)。1.3.5  將核酸吸附柱換一新套管，13000rpm離心3分鐘。1.4. 核酸洗脫1

17、.4.1  將核酸吸附柱裝入一無核酸酶1.5ml離心管，小心在吸附膜中央加入50l預(yù)熱洗脫液，室溫靜置4分鐘。1.4.2  10000 rpm離心2分鐘，離心管中液體即待測樣本RNA。2. PCR擴增： 2.1 實驗設(shè)計：2.1.1待檢樣本檢測：每份樣本分別使用2種反應(yīng)液（H7和N9反應(yīng)液）進行檢測，綜合2種反應(yīng)液的檢測結(jié)果對樣本進行判定。2.1.2對照品檢測：每次試驗都應(yīng)設(shè)置陰性對照和陽性對照。2.2反應(yīng)體系的配制：2.2.1準備工作：將2種反應(yīng)液（H7和N9反應(yīng)液）融化后振蕩混勻，離心6000rpm 10秒。2.2.2 2種反應(yīng)體系（H7和N9）的配制：取2個1.5ml

18、 無核酸酶離心管，計算待測樣本數(shù)量(n)，分別取20l×（n+2）反應(yīng)液（H7和N9）、0.5l×（n+2）DNA聚合酶和0.5l×（n+2）逆轉(zhuǎn)錄酶充分混勻，離心6000rpm 10秒。 n + 2 = n份樣本+1份陽性對照+1份陰性對照；2.3反應(yīng)體系分管：每份待測樣本設(shè)置2個PCR擴增管（H7和N9），分別將每種反應(yīng)體系按20l/管分裝至對應(yīng)的PCR擴增管中。2.4加樣：每份待測樣本RNA、陽性對照、陰性對照以5l/管分別加入2個PCR擴增管中。2.5擴增檢測：將加樣后的PCR擴增管分別轉(zhuǎn)移到全自動熒光定量PCR檢測儀上進行擴增檢測，不同儀器的設(shè)置如下：2

19、.5.1全自動熒光定量PCR檢測儀（RG3000、ABI Prism 7500、ABI Prism 7000型）擴增程序：對于ABI Prism 7500、ABI Prism 7000型全自動熒光定量PCR檢測儀，熒光信號設(shè)置為：Reporter Dye1：FAM、JOE/VIC，Quencher Dye1：NONE，Passive Reference：NONE。其他型號儀器可設(shè)置為FAM和HEX通道。熒光PCR擴增程序的設(shè)置見表1。反應(yīng)總體積為25l。表1.熒光PCR擴增程序步驟反應(yīng)溫度時間是否采集光循環(huán)數(shù)逆轉(zhuǎn)錄及變性5030分鐘否1953分鐘否預(yù)擴增9515秒否55030秒否721分鐘否擴

20、增及熒光收集9510秒否405540秒是2.5.2 全自動熒光定量PCR儀（Roche LightCycler系列）擴增程序：選擇FAM、HEX通道收集熒光。熒光PCR擴增程序見表2。表2.熒光PCR擴增程序步驟反應(yīng)溫度時間是否采集熒光循環(huán)數(shù)逆轉(zhuǎn)錄及變性5030分鐘否1933分鐘否預(yù)擴增9315秒否55030秒否721分鐘否擴增及熒光收集9310秒否405540秒是 3. 結(jié)果分析：3.1本品H7熒光探針的報告熒光為FAM，N9熒光探針的報告熒光為FAM，RNP熒光探針的報告熒光為HEX。所以應(yīng)選擇FAM通道和HEX通道分析試驗結(jié)果。3.2 基線（Baseline）范圍根據(jù)儀器要求設(shè)

21、定，目的為校正背景熒光干擾，終止循環(huán)（End）一般設(shè)置為最強樣本出現(xiàn)擴增信號的前3-4個循環(huán)。3.3 閾值線用于判斷樣本是否擴增，應(yīng)調(diào)整使閾值線高于熒光背景和陰性對照的熒光信號，或點擊分析（Analysis）自動獲得。4. 質(zhì)量控制：每次試驗應(yīng)設(shè)置陽性對照和陰性對照，且應(yīng)符合以下要求，否則試驗結(jié)果不成立。4.1陰性對照無Ct值或Ct值為0。4.2 陽性對照Ct值小于30.0?！緟⒖贾担▍⒖挤秶緾t值37.0報告該反應(yīng)陽性；無Ct值或Ct值為0報告該反應(yīng)陰性；37.0Ct值40.0為灰區(qū)；內(nèi)標RNP有效的范圍為：0Ct值33.0；【檢驗結(jié)果的解釋】1. 在內(nèi)標RNP結(jié)果成立的條件下各種判讀模

22、式如下：反應(yīng)液模式1模式2模式3模式4H7-+N9-+-+RNP+結(jié)果判斷H7N9亞型禽流感病毒RNA陰性H7N9亞型禽流感病毒RNA陰性H7N9亞型禽流感病毒RNA陰性H7N9亞型禽流感病毒RNA陽性注：在內(nèi)標RNP結(jié)果不成立的條件下視為檢測異常，應(yīng)重新采樣檢測。2. 結(jié)果在灰區(qū)的樣本需重復(fù)試驗：取200l樣本重新提取RNA（核酸分離試劑盒中裂解液、無水乙醇的用量加倍，其他組分的用量不變）并檢測。復(fù)檢結(jié)果Ct40.0的樣本為陽性，否則為陰性。3. 內(nèi)標RNP檢測靶物質(zhì)為正常人上皮細胞中廣泛存在的核糖核酸酶P（RNase P）的mRNA，用于對樣本中RNA的提取和擴增檢測過程進行有效監(jiān)控。如果

23、該份樣本的RNP檢測 Ct值33.0，可能為以下原因：3.1 未采集到足夠的正常人上皮細胞，應(yīng)重新采樣。3.2核酸提取過程異常，導(dǎo)致RNA損失，應(yīng)重新提取。3.3樣本中存在RT-PCR抑制物質(zhì)，可稀釋后檢測；【檢驗方法的局限性】1.樣本中RNA濃度低于本產(chǎn)品的最低檢出值（100copies/ml）時可能出現(xiàn)假陰性。2.目前研究顯示，發(fā)病后兩日內(nèi)取樣檢測，病毒RNA檢出率最高，隨發(fā)病時間的延長，病毒被清除，病毒核酸的檢出水平迅速下降。因此應(yīng)在發(fā)病后盡早采樣，必要時可采用多部位取樣檢測。臨床評價應(yīng)結(jié)合其他臨床癥狀和實驗室檢測指標進行判斷?！井a(chǎn)品性能指標】1.本品可最低檢出100copies/ml稀釋物。2.本品對季節(jié)性流感（H1N1以及H3N2）滅活