RNA轉(zhuǎn)錄后的加工與修飾

1、第二節(jié)RNA轉(zhuǎn)錄后的加工與修飾不論原核或真核生物的rRNAs都是以更為復(fù)雜的初級轉(zhuǎn)錄本形式被合成的，然后再加工成為成熟的RNA分子。然而絕大多數(shù)原核生物轉(zhuǎn)錄和翻譯是同時(shí)進(jìn)行的，隨著mRNA開始的DNA上合成，核蛋白體即附著在mRNA上并以其為模板進(jìn)行蛋白質(zhì)的合成，因此原核細(xì)胞的mRNA并無特殊的轉(zhuǎn)錄后加工過程，相反，真核生物轉(zhuǎn)錄和翻譯在時(shí)間和空間上是分天的，剛轉(zhuǎn)錄出來的mRNA是分子很大的前體，即核內(nèi)不均一RNA。hnRNA分子中大約只有10%的部分轉(zhuǎn)變成成熟的mRNA，其余部分將在轉(zhuǎn)錄后的加工過程中被降解掉。（一）mRNA的加工修飾原核生物中轉(zhuǎn)錄生成的mRNA為多順反子，即幾個(gè)結(jié)構(gòu)基因，利用

2、共同的啟動(dòng)子和共同終止信號經(jīng)轉(zhuǎn)錄生成一條mRNA，所以此mRNA分子編碼幾種不同的蛋白質(zhì)。例如乳糖操縱子上的Z、Y及A基因，轉(zhuǎn)錄生成的mRNA可翻譯生成三種酶，即半乳糖苷酶，透過酶和乙?；D(zhuǎn)移酶。原核生物中沒有核模，所以轉(zhuǎn)錄與翻譯是連續(xù)進(jìn)行的，往往轉(zhuǎn)錄還未完成，翻譯已經(jīng)開始了，因此原核生物中轉(zhuǎn)錄生成的mRNA沒有特殊的轉(zhuǎn)錄后加工修飾過程。真核生物轉(zhuǎn)錄生成的mRNA為單順反子，即一個(gè)mRNA分子只為一種蛋白質(zhì)分子編碼。真核生物mRNA的加工修飾，主要包括對5端和3端的修飾以及對中間部分進(jìn)行剪接。1在5端加帽成熟的真核生物mRNA，其結(jié)構(gòu)的5端都有一個(gè)m7G-PPNmN結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)被稱為甲基鳥苷的

3、帽子。如圖17-9所示。鳥苷通過5-5焦磷酸鍵與初級轉(zhuǎn)錄物的5端相連。當(dāng)鳥苷上第7位碳原子被甲基化形成m7G-PPNmN時(shí)，此時(shí)形成的帽子被稱為“帽0”，如果附m7G-PPNmN外，這個(gè)核糖的第“2”號碳上也甲基化，形成m7G-PPNm，稱為“帽1”，如果5末端N1和N2中的兩個(gè)核糖均甲基化，成為m7G-PPNmPNm2，稱為“帽2”。從真核生物帽子結(jié)構(gòu)形成的復(fù)雜可以看出，生物進(jìn)化程度越高，其帽子結(jié)構(gòu)越復(fù)雜。圖17-9Post-transcriptional modification of mRNa showing the 7-methylguanosine cap and poly-A ta

4、il.真核生物mRNA 5端帽子結(jié)構(gòu)的重要性在于它是mRNa 做為翻譯起始的必要的結(jié)構(gòu)，對核糖體對mRNA的識(shí)別提供了信號，這種帽子結(jié)構(gòu)還可能增加mRNA的穩(wěn)定性，保護(hù)mRNa 免遭5外切核酸酶的攻擊。2在3端加尾大多數(shù)的真核mRNA 都有3端的多聚尾巴（A)，多聚（A)尾巴大約為200bp。多聚（A)屠巴不是由DNA編碼的，而是轉(zhuǎn)錄后在核內(nèi)加上去的。受polyA聚合酶催化，該酶能識(shí)別，mRNa 的游離3-OH端，并加上約200個(gè)A殘基。近年來已知，在大多數(shù)真核基因的3一端有一個(gè)AATAA序列，這個(gè)序列是mRNa 3-端加polyA尾的信號。靠核酸酶在此信號下游10-15堿基外切斷磷酸二酯鍵，

5、在polyA聚合酶催化下，在3-OH上逐一引入100-200個(gè)A堿基。關(guān)于polyA尾巴的功能問題盡管經(jīng)過極其廣泛的探索，但還不完全清楚。有人推測polyA可能與mRNA從細(xì)胞核轉(zhuǎn)送到細(xì)胞質(zhì)有關(guān)，但是相當(dāng)數(shù)量，的沒有polyA屠巴的mRNA如組蛋白mRNA，也照樣通過核膜進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)。還有人認(rèn)為這種結(jié)構(gòu)對真核mRNA的翻譯效率具有某種作用，并能穩(wěn)定mRNA結(jié)構(gòu)，保持一定的生物半衰期。3.mRNA前體（hnRNA）的拼接原核生物的結(jié)構(gòu)基因是連續(xù)編碼序列，而真核生物基因往往是斷裂基因，即編碼一個(gè)蛋白質(zhì)分子的核苷酸序列被多個(gè)插入片斷所隔開，一個(gè)真核生物結(jié)構(gòu)基因中內(nèi)含子的數(shù)量，往往與這個(gè)基因的大小有關(guān)，

6、例如胰島素是一個(gè)很小的蛋白質(zhì)，它結(jié)構(gòu)基因只有兩個(gè)內(nèi)含子，而有些很大的蛋白質(zhì)，它的結(jié)構(gòu)基因中可以有幾十個(gè)內(nèi)含子。經(jīng)過復(fù)雜的過程后，切去內(nèi)元，將有編碼意義的核苷酸片段（Extron外元也叫外顯子）連接起來（圖17-10）。圖17-10Primary polymerase 11transcript of a eukaryote gene showing (a)introns after capping and addition of polyA tail.(b)Excision of introns to form the mature mRNA is called splicing.真核生物的結(jié)構(gòu)

7、的基因中具有可表達(dá)活性的外顯子，也含有無表達(dá)活性的內(nèi)含子，但內(nèi)含子序列下是無意義的，越來越多的實(shí)驗(yàn)證明有許多基因中的內(nèi)含子參與基因表達(dá)調(diào)控，在轉(zhuǎn)錄時(shí)，外顯子及內(nèi)含子均轉(zhuǎn)錄到hnRNA中。在細(xì)胞核中hnRNA進(jìn)行剪接作用，首先在核酸內(nèi)切酶作用下剪切掉內(nèi)含子；然后在連接酶作用下，將外顯子各部分連接起來，而變?yōu)槌墒斓膍RNA，這就是剪接作用，也有少數(shù)基因的hnRNA不需進(jìn)行剪接作用，例如-干擾素基因，圖17-11以卵清蛋白基因?yàn)槔?，介紹一個(gè)典型的轉(zhuǎn)錄及加工過程。圖17-11卵清蛋白基因轉(zhuǎn)錄及加工過程圖中外顯示以1、2、3、4表示，內(nèi)含子以A、B、C、D表示mRNA的拼接，需要在拼接部位有供拼接識(shí)別的

8、保守性強(qiáng)的一致順序，通過對100多種真核細(xì)胞基因的分析，發(fā)現(xiàn)外元和內(nèi)元拼接部位部分堿基順序有一定的規(guī)律（見表17-4）。表174含有內(nèi)元的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物其拼接處的堿基順序基因區(qū)域ExonIntronExon卵清蛋白內(nèi)元2UAAG GUGAACAGGUUG卵清蛋白內(nèi)元3UCAG GUACUCAGUCUG-珠蛋白內(nèi)元1GCAG GUUGUCAGGCUG-珠蛋白內(nèi)元2CAGG GUGAACAGUCUCIg內(nèi)含子1UCAG GUCAGCAGGGGCSV40病毒早期T抗原UAAG GUAAUUAGAUUC表中劃線的堿基對拼接識(shí)別有重要作用，如將兔的-珠蛋白的拼接部位的GT改為AT后，拼接反應(yīng)即受到影響。mRN

9、A前體拼機(jī)制圖17-12The RNA splicing mechanism.RNA splicing is catalyzed by a spliceosome formed from the assembly of U1,U2,U5,and sn RNPs(shown as green circles )plus other components (not shown).After assembly of the spliceosome ,the reaction occures in two speps:in step 1the branch-point A nucleotide in

10、the intron sequence,which is located colse to the 3'splice site ,attacks the 5'splice site and cleaves it;the cut 5'end of the intron sequence thereby becomes covalently linked to this A nucleotide,forming the branched nucleotide shown in Figure 8-55.In step 2 the 3'-OH end of the fi

11、rst exon sequence,which was created in the first step,adds to the beginning of the second exon sequence,cleqving the RNA molecule at the 3'splice site;the two exon sequences are thereby joined to each other and the intron sequence is released ad a ribosone.These splicing reactions occur im the n

12、ucleus and gengerate mRNa molecules from primary RNA transcripts (mRNA precursor molecules).mRNA拼接反應(yīng)需要有核內(nèi)小分子RNA參與它們與蛋白質(zhì)形成的復(fù)合物稱為小核糖核蛋白顆粒，SnRNA分別被命名為U1,U2,U3,U4,U5,和U6RNA。SnRNA中的U2RNA由與內(nèi)元右端拼接部位附近的UACUAA順序高度互補(bǔ)，形成一個(gè)環(huán)狀結(jié)構(gòu)，由特定的酶來識(shí)別切除該環(huán)狀結(jié)構(gòu)，完成拼接過程，如圖17-12所示。圖17-13Mechanim of mRNa splicing.Note that,for clari

13、ty,the process is shown in two stages;energy is not required for the process since transesterification reactions are involved.真核生物 mRNA前體在剪接過程中，還可以形成套索樣的結(jié)構(gòu)，在內(nèi)含子序列中常有一個(gè)分支部位的腺苷酸殘基，它的2-OH可以自動(dòng)攻擊內(nèi)含子5端與外顯子1連接的磷酸二酯鍵，切開了外噗子1，而腺苷酸原來已有3，5-磷酸二酯鍵相連的兩個(gè)相鄰的核苷酸殘基，加上此3，5-磷酸二酯鍵連接后，在腺苷酸處出現(xiàn)了一個(gè)套索，已被切下的外顯子1的3-OH攻擊內(nèi)含子3末端與

14、外顯子2之間的3，5-磷酸二酯鍵，鍵斷裂后，內(nèi)含子以套索的形式被節(jié)下來，此時(shí)外顯子1和外顯子2可以連接起來（圖17-13）。不論拼接過程如何，拼接必須極為精確，否則會(huì)導(dǎo)致遺傳信息傳遞障礙，合成的蛋白質(zhì)可能喪失其正常的功能。我國南方廣大地區(qū)是-地中海貧血的高發(fā)區(qū)，這是由于-珠蛋白鏈的合成受到部分或完全抑制所引起的一種血紅蛋白病。實(shí)驗(yàn)表明-珠蛋白基因元1中核苷酸的點(diǎn)突變改變了正常拼接部位的堿基順序，結(jié)果造成錯(cuò)誤部位的拼接。加工成熟的mRNA雖能翻譯，但產(chǎn)物不是正常的-珠蛋白，結(jié)果引起血紅蛋白級結(jié)構(gòu)和功能的改變。（二）rRNA轉(zhuǎn)錄后加工原核生物rRNA轉(zhuǎn)錄后加工，包括以下幾方面：rRNA前體被大腸桿

15、菌RNase,RNaseE等剪切成一定鏈長的rRNA分子；rRNA在修飾酶催化下進(jìn)行堿基修飾；rRNA與蛋白質(zhì)結(jié)合形成核糖體的大、小亞基（見圖17-14）圖17-14大腸桿菌rRNA前體的加工真核生物rRNA前體比原核生物大，哺乳動(dòng)物的初級轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為45s，低等真核生物的rRNA前體為38s，真核生物5sRNA前體獨(dú)立于其他三種rRNA的基因轉(zhuǎn)錄（圖17-15)。圖17-15真核生物rRNA前體的加工真核生物rRNA前體中含有插入順序，rRNA前體要形成成熟的rRNA，需要經(jīng)過拼接反應(yīng)。例如，四膜蟲的rRNA前體的拼接是一種無酶催化的自動(dòng)拼接過程。四膜蟲基因組內(nèi)，26srRNA編碼的區(qū)域內(nèi)有4

16、13bp的插入順序。該插放序列可以不消耗能量從rRNA前體中被除掉。用SDS煮沸和用蛋白酶外理等破壞酶活性辦法，都不能破壞拼接活性，但反應(yīng)中Mg2+和鳥嘌呤核苷酸是必在的。用32P-GTP進(jìn)行追蹤實(shí)驗(yàn)表明，起始過程是GTP在插入順序5端發(fā)生親核反應(yīng)，同時(shí)GMP與5端切點(diǎn)的切除段形成磷酸二酯鍵并使原RNA斷開。第二步是5切點(diǎn)的外元3-OH與3切點(diǎn)的外元5-P共價(jià)連接，獲得成熟的rRNA，被切除部分最后環(huán)化，形成一個(gè)環(huán)狀結(jié)構(gòu)，同時(shí)從5端去掉一個(gè)15核苷酸啐片。剩余部分連接成399核苷酸的環(huán)狀產(chǎn)物，再經(jīng)過幾步，最后切下一個(gè)19個(gè)核苷酸的線性內(nèi)含子序列即L-19，它具有催化活性，上面的剪接作用，是由內(nèi)

17、含子本身的催化性質(zhì)決定的（圖17-16）。圖17-16四膜蟲rRNA前體的自我剪接這種rRNA的自身剪接反應(yīng)給人們一個(gè)提示：即RNA分子也有酶的催化活性。這向酶的化學(xué)本質(zhì)是蛋白質(zhì)這一傳統(tǒng)概念提出了挑戰(zhàn)。這種有酶催化活性的RNA分子命名為Ribozyme。T.Cech和S.Altman各自分別發(fā)現(xiàn)RNA具有催化作用，他們的發(fā)現(xiàn)對于了解生命進(jìn)行過程有重要意義。很可能在原始生命中，RNA所催化的斷裂一連接反應(yīng)是最早出現(xiàn)的催化過程。為此，他們共同獲得了1989年Nobel化學(xué)獎(jiǎng)。從大多數(shù)Ribozymw的結(jié)構(gòu)中發(fā)現(xiàn)一些特征，例如：錘頭狀結(jié)構(gòu)的RNA分子有13個(gè)保守的核苷酸序列，如果它們中的堿基改變會(huì)使

18、這種催化活性失去作用。根據(jù)這種特片，科學(xué)家們在體外沒計(jì)并人工合成這種RNA分子，用于抗腫瘤及抗病毒的實(shí)驗(yàn)中（圖17-17）。圖17-17錘頭結(jié)構(gòu)模式圖（三）tRNA轉(zhuǎn)錄后的加工修飾原核生物和真核生物剛轉(zhuǎn)錄生成的tRNA前體一般無生物活性，需要進(jìn)行剪切和拼接堿基修飾3-OH連接-ACC結(jié)構(gòu)（圖17-18）。圖17-18tRNA前體的加工tRNA前體在tRNA剪切酶的作用下，切成一定在小的tRNA分子。大腸桿菌RNase P可特異剪切tRNA前體的5旁順序，因此，該酶被稱為tRNA5成熟酶。除了RNaseP外，tRNA前體的剪切尚需要一個(gè)3-核酸內(nèi)切酶，這可將tRNA前體3端的一段核苷酸序列切下來。此外RNaseD是tRNA3端成熟酶。近年來的研究表明大腸桿菌RNaseP是一種非常特殊的酶分子，它是由RNA和蛋白質(zhì)組成，最近發(fā)現(xiàn)RNAaseP分子中的RNA部分在某些條件下，可