雜交瘤技術(shù)制備單克隆抗體

1、精選優(yōu)質(zhì)文檔-傾情為你奉上雜交瘤技術(shù)制備單克隆抗體來源： 1975年Kohler和Milstein發(fā)現(xiàn)將小鼠骨髓瘤細(xì)胞與和綿羊紅細(xì)胞免疫的小鼠脾細(xì)胞進(jìn)行融合，形成的雜交瘤細(xì)胞既可產(chǎn)生抗體，又可無性繁殖，從而創(chuàng)立了單克隆抗體雜交瘤技術(shù)。這一技術(shù)上的突破使血清學(xué)的研究進(jìn)入了一個高度精確的新紀(jì)元。免疫細(xì)胞化學(xué)的 技術(shù)關(guān)鍵之一是制備特異性強(qiáng)、親合力大、滴度高的特異性抗體，由于每種抗原都有幾個抗原決定簇，用它免疫動物將產(chǎn)生對各個決定簇的抗體，即多克隆抗體。單克隆抗體則是由一個產(chǎn)生抗體的細(xì)胞與一個骨髓瘤細(xì)胞融合而形成的雜交廇細(xì)胞經(jīng)無性繁殖而來的細(xì)胞群所產(chǎn)生的，所以它的免疫球蛋白屬同一類型，質(zhì)地純一，而且它

2、是針對某一抗原決定簇的，因此特異性強(qiáng)，親合性也一致。單克隆抗體（McAb）的特性和常規(guī)血清抗體的特性比較見2-3。表23 單克隆抗體（McAb）和常規(guī)免疫血清抗體的特性比較項目常規(guī)免疫血清抗體McAb抗體產(chǎn)生細(xì)胞多克隆性單克隆性抗體的結(jié)合力特異性識別多種抗原決定簇特異性識別單一抗原決定簇免疫球蛋白類別及亞類不均一性，質(zhì)地混雜同一類屬，質(zhì)地純一特異性與親合力批與批之間不同特異性高，抗體均一有效抗體含量0.010.1mg/ml（小鼠腹水）0.55.0mg/ml(小鼠腹水) 0.510.0g/ml（培養(yǎng)物上清液）用于常規(guī)免疫學(xué)實驗可用單抗組合應(yīng)用抗原抗體形成格子結(jié)構(gòu)（沉淀反應(yīng)）容易形成一般難形成抗原

3、抗體反應(yīng)抗體混雜，形成2分子反應(yīng)困難，不可逆可形成2分子反應(yīng)，可逆單克隆抗體制備的一般流程如下:時間（天）制備步驟說明1初次免疫每種抗原免疫5只Balb/c小鼠，抗原與弗氏完全佐劑22第二次免疫抗原與弗氏不完全佐劑43第三次免疫抗原與弗氏不完全佐劑免疫一周后取血+ELISA檢測效價57加強(qiáng)免疫單獨(dú)抗原三天后采血（血清做陽性對照），取脾60細(xì)胞融合SP2/0骨髓瘤細(xì)胞與一只小鼠（ELISA效價較高）的脾細(xì)胞融合70-100HAT選擇雜交瘤細(xì)胞ELISA效價檢測篩選陽性細(xì)胞克隆雜交瘤細(xì)胞的亞克隆進(jìn)行2-4次雜交瘤細(xì)胞的亞克隆，直至細(xì)胞上清的ELISA結(jié)果陽性率達(dá)到100%，將完成細(xì)胞建株115-1

4、20亞類鑒定對雜交瘤細(xì)胞株所分泌的抗體進(jìn)行亞類測定120凍存細(xì)胞株每種抗原制備至少2株雜交瘤細(xì)胞121-140制備腹水并純化接種細(xì)胞制備腹水、Protein A/G純化單克隆抗體的制備方法如下。（一）動物的選擇與免疫1動物的選擇 純種BALB/C小鼠，較溫順，離窩的活動范圍小，體弱，食量及排污較小，一般環(huán)境潔凈的實驗室均能飼養(yǎng)成活。目前開展雜交瘤技術(shù)的實驗室多選用純種BALA/C小鼠。2免疫方案 選擇合適的免疫方案對于細(xì)胞融合雜交的成功，獲得高質(zhì)量的McAb至關(guān)重要。一般在融合前兩個月左右根據(jù)確立免疫方案開始初次免疫，免疫方案應(yīng)根據(jù)抗原的特性不同而定。（1）可溶性抗原免疫原性較弱，一般要加佐劑

5、，半抗原應(yīng)先制備免疫原，再加佐劑。常用佐劑：福氏完全佐劑、福氏不完全佐劑。初次免疫 抗原150g加福氏完全佐劑皮下多點(diǎn)注射或脾內(nèi)注射（一般0.81ml,0.2ml/點(diǎn)）3周后第二次免疫 劑量同上，加福氏不完全佐劑皮下或ip（腹腔內(nèi)注射）（ip劑量不宜超過0.5ml）3周后第三次免疫 劑量同一，不加佐劑，ip（57天后采血測其效價）23周加強(qiáng)免疫，劑量50500g為宜，ip或iv（靜脈內(nèi)注射）3天后取脾融合目前，用于可溶性抗原（特別是一些弱抗原）的免疫方案也不斷有所更新，如：將可溶性抗原顆?；蚬滔嗷环矫嬖鰪?qiáng)了抗原的免疫原性，另一方面可降低抗原的使用量。改變抗原注入的途徑，基礎(chǔ)免疫可直接采用

6、脾內(nèi)注射。使用細(xì)胞因子作為佐劑，提高機(jī)體的免疫應(yīng)答水平，增強(qiáng)免疫細(xì)胞對抗原的反應(yīng)性。（2）顆?？乖庖咝詮?qiáng)，不加佐劑就可獲得很好的免疫效果。以細(xì)胞性抗原為例，免疫時要求抗原量為12107個細(xì)胞。初次免疫 1107/0.5ml ip23周后第二次免疫 1107/0.5ml ip3周后加強(qiáng)免疫（融合前三天）1107/0.5ml ip或iv取脾融合（二）細(xì)胞融合1細(xì)胞融合前準(zhǔn)備（1）骨髓瘤細(xì)胞系的選擇：骨髓瘤細(xì)胞應(yīng)和免疫動物屬于同一品系，這樣雜交融合率高，也便于接種雜交瘤在同一品系小鼠腹腔內(nèi)產(chǎn)生大量McAb。常用的骨髓瘤細(xì)胞系見表2-4。表2-4用于融合試驗的主要骨髓瘤細(xì)胞系名 稱來 源耐 受 藥

7、物Ig鏈H LP3/X63-Ag8(X63)BALB/C骨髓瘤MOPC-218-氮鳥嘌呤r1 KP3/X63-Ag8.653(X63-Ag8.653)P3/X63-Ag88-氮鳥嘌呤 P3/NSI-1-Ag4-1(NS-1)P3/X63-Ag88-氮鳥嘌呤 K（不分泌型）P3/X63-Ag8.Ul(P3Ul)（X63BALB/C脾細(xì)胞）雜交瘤8-氮鳥嘌呤 SP2/0-Ag14(SP2/0)（X63BALB/C脾細(xì)胞）雜交瘤8-氮鳥嘌呤 F0BALB/C骨髓瘤8-氮鳥嘌呤 S194/5.XXO.BU.1P3/X63-Ag85-溴脫氧尿嘧啶核苷 MPC11-45.6TG1.7BALB/C骨髓瘤MP

8、C-116-巰鳥嘌呤r2b K210.RCY3.Ag1.2.3LOU大鼠骨髓瘤R2108-氮鳥嘌呤 KGM15006TG-A12人骨髓瘤GM15006-巰鳥嘌呤r1 KU-266AR人骨髓瘤U-2668-氮鳥嘌呤骨髓瘤細(xì)胞的培養(yǎng)可用一般的培養(yǎng)液，如RPMI1640，DMEM培養(yǎng)基。小牛血清的濃度一般在10%20%，細(xì)胞濃度以1045105/ml為宜，最大濃度不得超過106/ml。當(dāng)細(xì)胞處于對數(shù)生長的中期時，可按1：31：10的比例傳代。每35天傳代一次。細(xì)胞在傳代過程中，部分細(xì)胞可能有返祖現(xiàn)象，應(yīng)定期用8-氮鳥嘌呤進(jìn)行處理，使生存的細(xì)胞對HAT呈均一的敏感性。（2）飼養(yǎng)細(xì)胞：在組織培養(yǎng)中，單個

9、或少數(shù)分散的細(xì)胞不易生長繁殖，若加入其它活細(xì)胞，則可促進(jìn)這些細(xì)胞生長繁殖，所加入的這種細(xì)胞數(shù)被稱為飼養(yǎng)細(xì)胞。在制備McAb的過程中，許多環(huán)節(jié)需要加飼養(yǎng)細(xì)胞，如在雜交瘤細(xì)胞篩選、克隆化和擴(kuò)大培養(yǎng)過程中，加入飼養(yǎng)細(xì)胞是十分必要的。常用的飼養(yǎng)細(xì)胞有：小鼠腹腔巨噬細(xì)胞（較為常用）、小鼠脾臟細(xì)胞或胸腺細(xì)胞。也有人用小鼠成纖維細(xì)胞系3T3經(jīng)放射線照射后作為飼養(yǎng)細(xì)胞。飼養(yǎng)細(xì)胞的量為一般為2104或105細(xì)胞/孔。2細(xì)胞融合的步驟（1）制備飼養(yǎng)細(xì)胞層：一般選用小鼠腹腔巨噬細(xì)胞。與免疫小鼠相同品系的小鼠，常用BALB/C小鼠，610周拉頸 處死，浸泡在75%酒精內(nèi)，35min用無菌剪刀剪開皮膚，暴露腹膜用無菌注

10、射器注入56ml預(yù)冷的培養(yǎng)液（嚴(yán)禁刺破腸管）反復(fù)沖洗，吸出沖洗液沖洗液放入10ml離心管，1200rpm/分離56min用20%小牛血清（NCS）或胎牛血清（FCS）的培養(yǎng)液混懸，調(diào)整細(xì)胞數(shù)至1105/ml加入96孔板，100l/孔放入37，CO2孵箱培養(yǎng)（2）制備免疫脾細(xì)胞最后一次加強(qiáng)免疫3天后小鼠拉頸處死無菌取脾臟，培養(yǎng)液洗一次脾臟研碎，過不銹鋼篩網(wǎng)離心，細(xì)胞用培養(yǎng)液洗2次計數(shù)取108脾淋巴細(xì)胞懸液備用（3）制備骨髓瘤細(xì)胞取對數(shù)生長骨髓瘤細(xì)胞離心用無血清培養(yǎng)液洗2次計數(shù)，取得107細(xì)胞備用（4）融合將骨髓瘤細(xì)胞與脾細(xì)胞按1：10或1：5的比例混合在一起，在50ml離心管中用無血清不完全培養(yǎng)

11、液洗1次，離心，1200rpm,8min;棄上清，用吸管吸凈殘留液體，以免影響聚乙二醇（PEG）濃度。輕輕彈擊離心管底，使細(xì)胞沉淀略松動。90s內(nèi)加入37預(yù)溫的1ml 45%PEG（分子量4000）溶液，邊加邊輕微搖動。37水浴作用90s。加37預(yù)溫的不完全培養(yǎng)液以終止PEG作用，每隔2min分別加入1ml、2ml、3ml、4ml、5ml和6ml。離心，800rpm, 6min。充上清，用含20%小牛血清HAT選擇培養(yǎng)液重懸。將上述細(xì)胞，加到已有飼養(yǎng)細(xì)胞層的96孔板內(nèi)，每孔加100l。一般一個免疫脾臟可接種4塊96孔板。將培養(yǎng)板置37、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。 （三）選擇雜交瘤細(xì)胞及抗體檢測1

12、HAT選擇雜交瘤細(xì)胞 脾細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞經(jīng)PEG處理后，形成多種細(xì)胞的混合體，只有脾細(xì)胞與骨髓細(xì)胞形成的雜交瘤細(xì)胞才有意義。在HAT選擇培養(yǎng)液中培養(yǎng)時，由于骨髓瘤細(xì)胞缺乏胸苷激酶或次黃嘌呤鳥嘌呤核糖轉(zhuǎn)移酶，故不能生長繁殖，而雜交瘤細(xì)胞具有上述兩種酶，在HAT選擇培養(yǎng)液可以生長繁殖。在用HAT選擇培養(yǎng)12天內(nèi)，將有大量瘤細(xì)胞死亡，34天后瘤細(xì)胞消失，雜交細(xì)胞形成小集落，HAT選擇培養(yǎng)液維持710天后應(yīng)換用HT培養(yǎng)液，再維持2周，改用一般培養(yǎng)液。在上述選擇培養(yǎng)期間，雜交瘤細(xì)胞布滿孔底1/10面積時，即可開始檢測特異性抗體，篩選出所需要的雜交瘤細(xì)胞系。在選擇培養(yǎng)期間，一般每23天換一半培養(yǎng)液。2抗體

13、的檢測 檢測抗體的方法應(yīng)根據(jù)抗原的性質(zhì)、抗體的類型不同，選擇不同的篩選方法，一般以快速、簡便、特異、敏感的方法為原則。常用的方法有：（1）放射免疫測定（RIA）可用于可溶性抗原、細(xì)胞McAb的檢測。（2）酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）可用于可溶性抗原、細(xì)胞和病毒等McAb的檢測。（3）免疫熒光試驗適合于細(xì)胞表面抗原的McAb的檢測。（4）其它如間接血凝試驗、細(xì)胞毒性試驗、旋轉(zhuǎn)粘附雙層吸附試驗等。（四）雜交瘤的克隆化雜交瘤克隆化一般是指將抗體陽性孔進(jìn)行克隆化。因為經(jīng)過HAT篩選后的雜交瘤克隆不能保證一個孔內(nèi)只有一個克隆。在實際工作中，可能會有數(shù)個甚至更多的克隆，可能包括抗體分泌細(xì)胞、抗體非分泌細(xì)

14、胞、所需要的抗體（特異性抗體）分泌細(xì)胞和其它無關(guān)抗體的分泌細(xì)胞。要想將這些細(xì)胞彼此分開就需要克隆化。克隆化的原則是，對于檢測抗體陽性的雜交克隆盡早進(jìn)行克隆化，否則抗體分泌的細(xì)胞會被抗體非分泌的細(xì)胞所抑制，因為抗體非分泌細(xì)胞的生長速度比抗體分泌的細(xì)胞生長速度快，二者競爭的結(jié)果會使抗體分泌的細(xì)胞丟失。即使克隆化過的雜交瘤細(xì)胞也需要定期的再克隆，以防止雜交瘤細(xì)胞的突變或染色體丟失，從而喪失產(chǎn)生抗體的能力?？寺』姆椒ê芏?，最常用的是有限稀釋法和軟瓊脂平板法。1有限稀釋法克?。?）克隆前1天制備飼養(yǎng)細(xì)胞層（同細(xì)胞融合）。2）將要克隆的雜交瘤細(xì)胞從培養(yǎng)孔內(nèi)輕輕吹干，計數(shù)。（3）調(diào)整細(xì)胞為310個細(xì)胞/m

15、l。（4）取頭天準(zhǔn)備的飼養(yǎng)細(xì)胞層的細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔加入稀釋細(xì)胞100l。孵育于37、5%CO2孵箱中 。（5）在第7天換液，以后每23天換液1次。（6）89天可見 細(xì)胞克隆形成，及時檢測抗體活性。（7）將陽性孔的細(xì)胞移至24孔板中擴(kuò)大培養(yǎng)。（8）每個克隆應(yīng)盡快凍存。2軟瓊脂培養(yǎng)法克隆（1）軟瓊脂的配制：含有20%NCS（小牛血清）的2倍濃縮的RPMI1640。1%瓊脂水溶液：高壓滅菌，42預(yù)熱。0.5%瓊脂：由1份1%瓊脂加1份含20%小牛血清的2倍濃縮的RPMI1640配制而成。置42保溫。（2）用上述0.5%瓊脂液（含有飼養(yǎng)細(xì)胞）15ml傾注于直徑為9cm的平皿中，在室溫中待凝固后作為基底

16、層備用。（3）按100/ml，500/ml或5000/ml等濃度配制需克隆的細(xì)胞懸液。（4）1ml 0.5%瓊脂液（42預(yù)熱）在室溫中分別與1ml不同濃度的細(xì)胞懸液相混合。（5）混勻后立傾注于瓊脂基底層上，在室溫中10min，使其凝固，孵育于37、5%CO2孵箱中。（6）45天 后即可見針尖大小白色克隆，710天后，直接移種至含飼養(yǎng)細(xì)胞的24孔中進(jìn)行培養(yǎng)。（7）檢測抗體，擴(kuò)大培養(yǎng)，必要是地再克隆化。（五）雜交瘤細(xì)胞的凍存與復(fù)蘇1雜交瘤細(xì)胞的凍存 及時凍存原始孔的雜交瘤細(xì)胞每次克隆化得到的亞克隆細(xì)胞是十分重要的。因為在沒有建立一個穩(wěn)定分泌抗體的細(xì)胞系的時候，細(xì)胞的培養(yǎng)過程中隨時可能發(fā)生細(xì)胞的污染

17、、分泌抗體能力的喪失等等。如果沒有原始細(xì)胞的凍存，則可因上述意外而前功盡棄。雜交瘤細(xì)胞的凍存方法同其他細(xì)胞系的凍存方法一樣，原則上細(xì)胞應(yīng)在每支安瓿含1106以上，但對原始孔的雜交瘤細(xì)胞可以因培養(yǎng)環(huán)境不同而改變，在24孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)，當(dāng)長滿孔底時，一孔就可以裝一支安瓿凍存。細(xì)胞凍存液：50%小牛血清；40%不完全培養(yǎng)液；10%DMSO（二甲基亞砜）。凍存液最好預(yù)冷，操作動作輕柔、迅速。凍存時從室溫可立即降至0后放入-70超低溫冰箱，次日轉(zhuǎn)入液氮中。也可用細(xì)胞凍存裝置進(jìn)行凍存。凍存細(xì)胞要定期復(fù)蘇，檢查細(xì)胞的活性和分泌抗體的穩(wěn)定性，在液氮中細(xì)胞可保存數(shù)年或更長時間。2細(xì)胞復(fù)蘇方法 將玻璃安瓿自液氮中

18、小心取出，放37水浴中，在1min內(nèi)使凍存的細(xì)胞解凍，將細(xì)胞用完全培養(yǎng)液洗滌兩次，然后移入頭天已制備好的飼養(yǎng)層細(xì)胞的培養(yǎng)瓶內(nèi)，置37、5%CO2孵箱中培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞形成集落時，檢測抗體活性。（六）單克隆抗體的大量生產(chǎn)大量生產(chǎn)單克隆抗體的方法主要有兩種：（1）體外使用旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)管大量培養(yǎng)雜交瘤細(xì)胞，從一清液中獲取單克隆抗體。但此方法產(chǎn)量低，一般培養(yǎng)液內(nèi)抗體含量為1060g/ml,如果大量生產(chǎn)，費(fèi)用較高。（2）體內(nèi)接種雜交瘤細(xì)胞，制備腹水或血清。實體瘤法：對數(shù)生長期的雜交瘤細(xì)胞按13107/ml接種于小鼠背部皮下，每處注射0.2ml,共24點(diǎn)。待腫瘤達(dá)到一定大小后（一般1020天）則可采血，從血清中獲得單克隆 抗體的含量可達(dá)到110mg/ml。但采血量有限。腹水的制備：常規(guī)是先腹腔注射0.5ml Pristane (降植烷)或液體石蠟于BALB/C鼠，12周后腹腔注射1106個雜交瘤細(xì)胞，接種細(xì)胞710天后可產(chǎn)生腹水，密切觀察動物的健康狀況與腹水征象，待腹水盡可能多，而小鼠頻于死亡之前，處死小鼠，用滴管將腹水吸入試管中，一般一只小鼠可獲510ml腹水。也可用注射器抽提腹水，可反復(fù)收集數(shù)次。腹水中單克隆抗體含量可達(dá)到510mg/ml，這是目前最常用的方法，還可將腹水中細(xì)胞凍存起來，復(fù)蘇后轉(zhuǎn)種小鼠腹腔則產(chǎn)生腹水塊、量