注射用法羅培南鈉對金葡菌的體內(nèi)外抗菌活性研究

1、    注射用法羅培南鈉對金葡菌的體內(nèi)外抗菌活性研究 羅濤1,2,黃文祥1,吳利先1作者單位：重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 重慶市傳染病寄生蟲病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 重慶400016【關(guān)鍵詞】 羅培南鈉; 金葡菌; 體外抗菌活性; 體內(nèi)抗菌活性ABSTRACT Objective To evaluate the antibacterial activities of faropenem sodium for injection against S.aureus in vivo and in vitro. Methods Methicillin resistant S

2、.aureus (MRSA) was screened from clinical isolated S.aureus by cefoxitin disc diffusion method. The minimum inhibitory concentrations (MICs) of faropenem and vancomycin against methicillin sensitive S.aureus (MSSA) and MRSA were determined by agar dilution method. Mice peritonitis models were establ

3、ished by 3 MRSA (sensitive, moderate and severe resistant to faropenem respectively) and MSSA strains and mice were treated introvenously with faropenem sodium and vancomycin for injection. Results Sixtyfive MRSA strains were screened from 151 clinical isolated S.aureus and the positive rate of MRSA

4、 was 43%. All MSSA were sensitive to faropenem and vancomycin in vitro. All MRSA were sensitive to vancomycin, but only 10 of them were sensitive to faropenem. In four groups, the median effective dose (ED50) of faropenem were 38.3, 38.6, 71.9 and 7 .07 mg/kg respectively; vancomycin were 2.25, 10.1

5、8, 20.85 and 1.77 mg/kg respectively. Conclusion The antibacterial activities of faropenem sodium for injection against MSSA in vivo and in vitro are strong. Faropenem is ineffective in vivo to MRSA, even when it was sensitive in vitro.KEY WORDS Faropenem sodium; Staphylococcus aureus; In vivo activ

6、ity; In vitro activity1 材料與方法1.1 試驗(yàn)藥品注射用法羅培南鈉的規(guī)格為每瓶1g，批號20050713，江蘇正大天晴藥業(yè)股份有限公司研制。注射用鹽酸萬古霉素的規(guī)格為每瓶500mg，批號WM16142，Eli Lilly公司產(chǎn)品。1.2 試驗(yàn)菌株金葡菌菌株來自本室保存菌株，為近三年來重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院自臨床患者的痰、血、分泌物等標(biāo)本中分離，并經(jīng)本院鑒定。金葡菌ATCC29213(甲氧西林敏感，MSSA)由汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院錢元恕教授饋贈。實(shí)驗(yàn)質(zhì)控菌株為金葡菌ATCC25923。1.3 主要試劑(1)腹膜炎模型添加劑 高活性干酵母(北方同正)，配成5%(W/V)濃度后高

7、壓滅菌。20%無菌鼠糞提取物(sterile rat feces extracts，SRFE)制備方法見參考文獻(xiàn)5。將SRFE和高活性干酵母液配成31的液體用于稀釋菌液。(2)培養(yǎng)基 MuellerHinton瓊脂固體及液體培養(yǎng)基，杭州天和微生物制品廠出品。BHI(brain and heart infusion)液體培養(yǎng)基，Difco公司產(chǎn)品。(3)頭孢西丁紙片(紙片含藥量30g頭孢西丁)，Oxoid公司產(chǎn)品。1.4 試驗(yàn)動物清潔級近交系BABL/c小鼠，體重1822g，雌、雄各半，購自本校實(shí)驗(yàn)動物中心，動物合格證號SCXK(渝20020001)。1.5 方法(1)MRSA的篩選 根據(jù)臨床實(shí)

8、驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化研究所(CLSI)2007年抗微生物藥物敏感試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)，應(yīng)用紙片擴(kuò)散法試驗(yàn)條件，孵育24h;如耐藥則在孵育18h后可報(bào)告結(jié)果。使用反射光閱讀頭孢西丁紙片試驗(yàn)。頭孢西丁對金葡菌紙片擴(kuò)散法抑菌環(huán)直徑19mm應(yīng)報(bào)告對苯唑西林耐藥，20mm應(yīng)報(bào)告對苯唑西林敏感。推薦的質(zhì)控菌株(質(zhì)控允許范圍：30g頭孢西丁，紙片抑菌環(huán)直徑2329mm)金葡菌ATCC25923。(2)細(xì)菌體外藥敏實(shí)驗(yàn) 按照CLSI推薦的瓊脂平皿稀釋法測定所有金葡菌菌株對法羅培南鈉和萬古霉素的最低抑菌濃度(minimal inhibitory concentration，MIC)。3335孵育1618h;測萬古霉素需24h。菌落生

9、長被完全抑制的最低藥物濃度為該藥對檢測菌的MIC。推薦的質(zhì)控菌株金葡菌ATCC25923。法羅培南參照美羅培南的標(biāo)準(zhǔn)即為4g/ml(北京天壇藥物生物技術(shù)開發(fā)公司試驗(yàn)結(jié)果)，萬古霉素的判斷標(biāo)準(zhǔn)為2g/ml5。凡是小于或等于兩種藥物的臨界濃度為敏感，大于為耐藥，并以此統(tǒng)計(jì)敏感率。(3)感染保護(hù)試驗(yàn)菌液稀釋 將試驗(yàn)用菌于試驗(yàn)前1d接種于2ml MH肉湯中(MRSA菌株使用BHI肉湯)，37培養(yǎng)6h，取菌液0.1ml轉(zhuǎn)種于10ml營養(yǎng)肉湯內(nèi)，37培養(yǎng)18h，即為試驗(yàn)用菌原液。將菌原液適當(dāng)稀釋，用添加劑稀釋至感染動物所需終濃度。藥液稀釋 采用低比值系列稀釋法，兩個(gè)相臨劑量組劑量差對數(shù)值i為0.3010。

10、最低致死劑量(minimal lethal dose，MLD)測定 實(shí)驗(yàn)小鼠按空腹體重和性別隨機(jī)分為幾組，每組6只。將菌原液適當(dāng)稀釋，用5%高活性干酵母液和無菌鼠糞提取物稀釋為不同濃度，一組為一個(gè)濃度，每只小鼠腹腔注射0.5ml菌液，記錄感染后一周各組死亡數(shù)或存活數(shù)，6只小鼠全部死亡組的最低濃度為MLD。動物保護(hù)試驗(yàn) 半數(shù)有效量(median effective dose，ED50)測定 禁食后體重1822g BABL/c小鼠隨機(jī)分組，每組10只，雌、雄各半。用0.5ml的最低致死劑量感染小鼠，1h后給予不同濃度的藥物(67個(gè)濃度組)，每只0.2ml，靜脈注射。空白對照組注射0.2ml生理鹽水

11、。記錄感染后24、48、72h直至1周內(nèi)各給藥組及對照組小鼠的死亡數(shù)或存活數(shù)，用BLISS法進(jìn)行ED50及ED50的95%可信限計(jì)算。2 結(jié)果與分析2.1 MRSA的篩選結(jié)果151株金葡菌中共分離出65株MRSA，陽性率為43%。2.2 體外抗菌試驗(yàn)86株MSSA對法羅培南和萬古霉素均敏感。65株MRSA中，10株對法羅培南敏感，敏感率為15.38%;所有MRSA菌株均對萬古霉素敏感，敏感率100%(表1)。2.3 體內(nèi)抗菌試驗(yàn)根據(jù)MIC結(jié)果選擇4株菌株建立小鼠腹膜炎模型。對法羅培南敏感、低度和高度耐藥的MRSA菌株各1株，自編號分別為113，77和39;以對法羅培南敏感的金葡菌ATCC292

12、13(MSSA標(biāo)準(zhǔn)株)。小鼠腹腔注射細(xì)菌后出現(xiàn)畏寒、寒戰(zhàn)，活動力和食欲下降。死亡小鼠尸檢肉眼觀察，各給藥組和對照組小鼠肝臟、腎臟可見大小不等的膿點(diǎn)，少數(shù)可見心外膜的膿點(diǎn)，其它臟器未見異常。實(shí)驗(yàn)組與對照組比較無明顯差異。法羅培南和萬古霉素對MSSA菌株都顯示了很強(qiáng)的體內(nèi)抗菌活性。對于MRSA，法羅培南的體內(nèi)抗菌活性低于萬古霉素，ED50值為萬古霉素的3.4517倍。即便體外顯示敏感，ED50值仍較高(38.30mg/kg)，體內(nèi)、外抗菌活性不一致。隨著細(xì)菌對法羅培南耐藥性的增強(qiáng)，法羅培南和萬古霉素的ED50也隨之增大(表2)。3 討論法羅培南是一種新型青霉烯類抗生素，臨床研究顯示其療效好，安全性

13、高，不良反應(yīng)少。法羅培南對需氧及厭氧革蘭陽性菌、革蘭陰性菌均顯示出廣譜的抗菌活性，尤其對葡萄球菌、腸球菌的需氧革蘭陽性菌及擬桿菌等厭氧菌的抗菌活性明顯優(yōu)于其它內(nèi)酰胺類6。與其它青霉烯類一樣，法羅培南通過和PBP結(jié)合抑制細(xì)菌細(xì)胞壁的合成達(dá)到殺菌作用。當(dāng)金葡菌置于法羅培南的MIC的1/8或1/4溶液時(shí)形成不規(guī)則隔膜。在1倍的MIC或更高時(shí)，大量的金葡菌溶解。這種由法羅培南所觸發(fā)的細(xì)菌形態(tài)變化與所報(bào)道的與PBP的親和力是一致的。這樣對革蘭陽性菌和革蘭陰性菌，法羅培南對PBP高親和性通過明顯的濃度依賴的殺菌作用反映出來7。注射用法羅培南鈉在國外尚未上市。江蘇正大天晴藥業(yè)股份有限公司在口服法羅培南基礎(chǔ)上

14、研制的注射用法羅培南鈉為國內(nèi)首創(chuàng)，為臨床用藥提供了更多選擇。注射用法羅培南鈉對金葡菌的體外和體內(nèi)抗菌活性目前國內(nèi)和國外均無報(bào)道。本研究中，注射用法羅培南鈉對臨床分離的MSSA菌株顯示了良好的體外和體內(nèi)抗菌活性，抗菌效果與萬古霉素相似。Christof等8測定法羅培南對31株臨床分離的MRSA的體外抗菌活性，其中18株的MIC2mg/L，敏感率為58.06%;有9株的MIC>128mg/L，且MIC90>128mg/L。Christof等研究顯示口服法羅培南對MRSA有較好的體外抗菌活性，但在我們的實(shí)驗(yàn)中，注射用法羅培南鈉對MRSA的體外敏感率僅為15.38%，且在體外敏感的菌株在體

15、內(nèi)試驗(yàn)中ED50值較高，提示注射用法羅培南鈉對MRSA無效，即使體外敏感。萬古霉素是控制MRSA等重癥感染的特效藥，目前尚未分離到耐萬古霉素的MRSA。本次試驗(yàn)篩選出的MRSA菌株在體外均對萬古霉素敏感，體內(nèi)實(shí)驗(yàn)也證實(shí)了萬古霉素對小鼠的保護(hù)作用。萬古霉素確實(shí)是治療MRSA等重癥感染的有效藥物?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】1 Behramiellet J, Dabreuil L, Bryskier A. In vitro evaluation of faropenem activity against anaerobic bacteria J. J Chemother,2005,17(1):3645.2 Wal

16、sh F, Amyes A K, Amyes S G. The in vitro effects of faropenem on lower respiratory tract pathogens isolated in the United Kingdom J. Int J Antimicrob Agents,2003,21(6):581584.3 Dalhoff A, Nasu T, Okamoto K. Betalactamase stability of faropenem J. Chemotherapy,2003,49(5):229236.4 Nishivama T, Matsuza

17、ki K, Kovama H, et a1. In vitro activity of faropenem against betalactamase produing clinical isolates J. Jpn J Antibiot,2000,53(3):179183.5 臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會. 抗微生物藥物敏感試驗(yàn)的執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)第十七版M. 臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會，2007：3845.6 孫小平，黃文祥. 青霉烯及其代表藥物法羅培南的研究進(jìn)展J. 國外醫(yī)藥抗生素分冊，2005，26(3)：111115.7 Dalhoff A, Nasu T, Okamoto K. Target affin

18、ities of faropenem to and its impact on the morphology of Grampositive and Gramnegative bacteria J. Chemotherapy,2003,49(4):172183.                    考試寶典-高分練兵場                揭秘論文“低價(jià)”根源  &#