幾種測蛋白含量方法的比較

1、蛋白蛋白質(zhì)含量測定方法的比較質(zhì)含量測定方法的比較及肽含量及肽含量的的測定測定 （一）（一） 蛋白質(zhì)測定方法的比較（原理、優(yōu)缺點(diǎn)）蛋白質(zhì)測定方法的比較（原理、優(yōu)缺點(diǎn)） 蛋白質(zhì)含量測定法，目前包括定氮法、雙縮脲法、福林酚法（Lowry 法）和紫外吸收法、考馬斯亮藍(lán)法。其中考馬斯亮藍(lán)和福林酚法靈敏度最高，比紫外吸收法靈敏 1020 倍，比雙縮脲法靈敏 100 倍以上。定氮法較復(fù)雜，但準(zhǔn)確，往往以定氮法測定的蛋白質(zhì)作為其他方法的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)。 在選擇方法時(shí)應(yīng)該考慮：（1）實(shí)驗(yàn)測定要求的靈敏度和精確度； （2）蛋白質(zhì)的性質(zhì)； （3）溶液中存在的干擾物質(zhì)； （4）測定花費(fèi)時(shí)間。蛋白質(zhì)含量測定法，目前包括定氮

2、法、雙縮脲法、福林酚法（Lowry 法）和紫外吸收法、考馬斯亮藍(lán)法。其中考馬斯亮藍(lán)和福林酚法靈敏度最高，比紫外吸收法靈敏 1020 倍，比雙縮脲法靈敏 100 倍以上。定氮法較復(fù)雜，但準(zhǔn)確，往往以定氮法測定的蛋白質(zhì)作為其他方法的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)。在選擇方法時(shí)應(yīng)該考慮： （1）實(shí)驗(yàn)測定要求的靈敏度和精確度； （2）蛋白質(zhì)的性質(zhì)； （3）溶液中存在的干擾物質(zhì)； （4）測定花費(fèi)時(shí)間。 1 微量凱氏定氮法（微量凱氏定氮法（GB 5009.5-2010） 1.1 原理 樣品與濃硫酸共熱。含氮有機(jī)物即分解產(chǎn)生氨（消化） ，氨又與硫酸作用，變成硫酸氨。經(jīng)強(qiáng)堿堿化使之分解放出氨，借蒸汽將氨蒸至酸液中，根據(jù)此酸液被中

3、和的程度可計(jì)算得樣品之氮含量。 1.2 操作方法 樣品經(jīng)前處理、炭化、消化、蒸餾、滴定等主要步驟 1.3 特點(diǎn) 準(zhǔn)確度較高，適用于 0.2 1.0mg 氮，誤差為 2；操作復(fù)雜費(fèi)時(shí)，整個(gè)過程需要耗時(shí) 810h，試劑消耗量大。 ，測得結(jié)果為總氮含量，包括蛋白氮和非蛋白氮含量；適用范圍廣，幾乎所有樣品均可用此方法。 2 雙縮脲比色法雙縮脲比色法 2.1 原理 雙縮脲法是利用蛋白質(zhì)的雙縮脲反應(yīng)而測定蛋白質(zhì)含量的方法。因蛋白質(zhì)含有兩個(gè)以上的肽鍵， 所以有雙縮脲反應(yīng)。 在堿性溶液中蛋白質(zhì)與 Cu2+形成紫紅色絡(luò)合物， 在一定的實(shí)驗(yàn)條件下， 未知樣品溶液與標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液同時(shí)反應(yīng)，并于 540560nm 測

4、定，即可以通過標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)曲線求出未知樣品的蛋白質(zhì)濃度。其顏色的深淺與蛋白質(zhì)的濃度成正比，而與蛋白質(zhì)的分子量及氨基酸成分無關(guān)。 2.2 操作方法 標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液或樣液直接加雙縮脲試劑反應(yīng) 30min，即可測定。先繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，再測定樣品 2.3 特點(diǎn) 靈敏度低 120mg ， 2030 分鐘操作簡便、呈色穩(wěn)定性好、試劑單一；測定結(jié)果與蛋白質(zhì)的濃度成正比，而與蛋白質(zhì)的分子量及氨基酸成分無關(guān)；靈敏度不高，約為 1mg，雙縮脲法常用于需要快速，但并不需要十分精確的蛋白質(zhì)測定。 3 福林酚法（福林酚法（Lowry 法）法） 3.1 原理 蛋白質(zhì)在堿性溶液中其肽鍵與 Cu2+螯合，形成蛋白質(zhì)一銅復(fù)合物

5、，此復(fù)合物使酚試劑的磷鉬酸還原，產(chǎn)生藍(lán)色化合物，在一定條件下，利用藍(lán)色深淺與蛋白質(zhì)濃度的線性關(guān)系作標(biāo)準(zhǔn)曲線并測定樣品中蛋白質(zhì)的濃度。該化合物在750nm 有最大吸收峰。 3.2 操作方法 測定依次加福林酚甲液、乙液后可見光度計(jì) 750nm測定；先繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線、再測定樣品。 3.3 特點(diǎn) 試劑配制略麻煩，但試劑可長期保存；測定靈敏度高，約 5mg ，測定時(shí)間約 4060 分鐘，操作簡便；操作要嚴(yán)格計(jì)時(shí)；顏色深淺隨不同蛋白質(zhì)變化（測定結(jié)果受待測樣品蛋白中肽鍵存在形式及含量的影響） 。 4 紫外吸收法紫外吸收法 4.1 原理 蛋白質(zhì)分子中，酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸殘基的苯環(huán)含有共軛雙鍵，使蛋白質(zhì)具有

6、吸收紫外光的性質(zhì)。吸收高峰在 280nm 處，其吸光度（即光密度值）與蛋白質(zhì)含量成正比。此外，蛋白質(zhì)溶液在 238nm 的光吸收值與肽鍵含量成正比。利用一定波長下，蛋白質(zhì)溶液的光吸收值與蛋白質(zhì)濃度的正比關(guān)系，可以進(jìn)行蛋白質(zhì)含量的測定。 4.2 操作方法 直接上紫外分光光度計(jì)測定，需繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線 4.3 特點(diǎn) 靈敏度 50100mg ， 510 分鐘完成，操作十分簡便，但結(jié)果受樣品蛋白品種影響大。 5 考馬斯亮藍(lán)法考馬斯亮藍(lán)法 5.1 原理 考馬斯亮藍(lán)在一定蛋白質(zhì)濃度范圍內(nèi)，蛋白質(zhì)和染料結(jié)合符合比爾定律 ，因此可以通過測定染料在 595nm 處光吸收的增加量得到與其結(jié)合的蛋白質(zhì)量。 5.2 操作

7、方法 直接加考馬斯亮藍(lán)試劑反應(yīng) 5min 后即可測定；先繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，再測定樣品。 5.3 特點(diǎn) 靈敏度高，約為 15mg （比 Lowry 法靈敏 4 倍） ，測定時(shí)間 515分鐘，操作簡便、迅速、干擾物質(zhì)少、重線性好，但要求樣品顏色為無色或淺色，靈敏度高。 （二）（二）蛋白含量的蛋白含量的測定測定方法及步驟方法及步驟 1 微量凱氏定氮法微量凱氏定氮法（GB 5009.5-2010） 1.1 試劑試劑 硫酸銅、硫酸鉀、硫酸、2%硼酸溶液、混合指示液（1 份 0.1%甲基紅乙醇溶液與 5 份 0.1%溴甲酚綠乙醇溶液臨用時(shí)混合；或 2 份 0.1%甲基紅乙醇溶液與 1 份0.1%次甲基藍(lán)乙醇溶

8、液臨用時(shí)混合） 、40%氫氧化鈉溶液、 0.1mol/L 鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液。 1.2 儀器儀器 消化架、吸量管、量筒、微量滴定裝置、錐形瓶、容量瓶、定氮蒸餾裝置 1.3 分析步驟：分析步驟： 1.3.1 消化 精密稱取固體樣品 0.22g，半固態(tài) 25g，液體樣品 1020mL（約相當(dāng)于3040mg 氮）于干燥潔凈的凱氏燒瓶，加入 6g 無水 K2SO4，0.2g CuSO4，20mL H2SO4。瓶口放一小漏斗，先小火加熱待泡沫停止后加大火（330400） ，直到溶液澄清透明，再繼續(xù)加熱 0.5h1h。冷卻后加水定容 100mL（數(shù)次沖洗，使樣品溶液全部移入容量瓶） 1.3.2 蒸餾 將 2%硼

9、酸溶液 10mL 放入 100mL 三角瓶中（接收瓶） ，加入甲基紅混和指示劑 23 滴，此時(shí)為紫紅色，將冷凝管尖端浸入液面下。蒸餾裝置中的水蒸氣發(fā)生器裝水 2/3，加入數(shù)粒玻璃珠，加甲基紅乙醇溶液數(shù)滴及數(shù)毫升硫酸，以保持水呈酸性，加熱煮沸水蒸氣發(fā)生器內(nèi)的水并保持沸騰。 準(zhǔn)確吸取 2.0 mL 10.0 mL 試樣處理液由小玻杯注入反應(yīng)室，以 10 mL 水洗滌小玻杯并使之流入反應(yīng)室內(nèi)， 隨后塞緊棒狀玻塞。 將 10.0 mL 氫氧化鈉溶液倒入小玻杯，提起玻塞使其緩緩流入反應(yīng)室，立即將玻塞蓋緊，并加水于小玻杯以防漏氣。夾緊螺旋夾，開始蒸餾。蒸餾 10 min 后移動(dòng)蒸餾液接收瓶，液面離開冷凝管

10、下端，再蒸餾 1 min。然后用少量水沖洗冷凝管下端外部，取下蒸餾液接收瓶。 1.3.3 滴定 餾出液用標(biāo)準(zhǔn) HCl 溶液滴定，直到藍(lán)綠色變?yōu)榈仙２⒌味ńY(jié)果用空白試驗(yàn)校正。 1.3.4 計(jì)算： 蛋白質(zhì)（%）=（V1-V2）C0.0140F100/m V3100% V1樣品滴定時(shí)消耗的標(biāo)準(zhǔn) HCl 溶液體積（mL） V2空白滴定時(shí)消耗的標(biāo)準(zhǔn) HCl 溶液體積（mL） C標(biāo)準(zhǔn) HCl 溶液的摩爾濃度（mol/L） 0.01401mL 1mol/lL HCl 相當(dāng)于 0.0140g 氮 F氮換算成蛋白質(zhì)的系數(shù)，一般食物為 6.25 m試樣的質(zhì)量（g） V3測定時(shí)吸取消化液的體積（mL） 2 雙

11、縮脲法雙縮脲法 2.1 試劑試劑 （1）標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液：用標(biāo)準(zhǔn)的結(jié)晶牛血清清蛋白（BSA）或標(biāo)準(zhǔn)酪蛋白，配制成 10mg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液，可用 BSA 濃度 1mg/ml 的 A280nm為 0.66 來校正其純度。如有需要，標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)還可預(yù)先用微量凱氏定氮法測定蛋白氮含量，計(jì)算出其純度，再根據(jù)其純度，稱量配制成標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液。牛血清清蛋白用 H2O或 0.9% NaCl 配制，酪蛋白用 0.05mol/L NaOH 配制。 （2）雙縮脲試劑：稱取 1.50g 硫酸銅（CuSO4.5H2O）和 6.0g 酒石酸鉀鈉（KNaC4H4O6.4H2O） ， 用 500mL 水溶解， 在攪拌下加

12、入 300mL 10% NaOH 溶液，用水稀釋到 1L， 貯存于塑料瓶中 （或內(nèi)壁涂以石蠟的瓶中） 。 此試劑可長期保存。若貯存瓶中有黑色沉淀出現(xiàn)，則需要重新配制。 2.2 器材器材 可見光分光光度計(jì)、試管 15 支、旋渦混合器等。 2.3 操作方法操作方法 2.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的測定：取 7 支試管，分別加入 0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0mL的 10mg/mL 標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液，用水補(bǔ)足到 1 毫升，然后加入 4 毫升雙縮脲試劑。充分搖勻后，在室溫（2025）下放置 30 分鐘，于 540nm 處進(jìn)行比色測定。用未加蛋白質(zhì)溶液的第一支試管作為空白對(duì)照液。以蛋白質(zhì)的含量為橫坐標(biāo)，

13、光吸收值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。 雙縮脲標(biāo)準(zhǔn)曲線y = 0.0332x + 0.121R2 = 0.999300.10.20.30.40.5024681012蛋白濃度mg/ml吸光值 圖 1 雙縮脲法測定蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線 3 福林酚福林酚法（法（Lowry 法）法） 3.1 試劑試劑 3.1.1 試劑甲：50 份 A 與 1 份 B 混合，即為試劑甲 A 液：10g Na2CO3，2g NaOH 和 0.25g 酒石酸鉀鈉 （KNaC4H4O6.4H2O） 。溶解于 500 mL 蒸餾水中。 B 液：0.5g 硫酸銅（CuSO45H2O）溶解于 100mL 蒸餾水中。 3.1.2 試劑乙： 在 2

14、 L 磨口回流瓶中，加入 100g 鎢酸鈉（Na2WO42H2O） ，25g 鉬酸鈉（Na2MoO42H2O）及 700 mL 蒸餾水，再加 50 mL85%磷酸，100 mL 濃鹽酸，充分混合，接上回流管，以小火回流 10 小時(shí)，回流結(jié)束時(shí)，加入 150g 硫酸鋰（Li2SO4） ，50 mL 蒸餾水及數(shù)滴液體溴，開口繼續(xù)沸騰 15 分鐘，以便驅(qū)除過量的溴。冷卻后溶液呈黃色（如仍呈綠色，須再重復(fù)滴加液體溴的步驟） 。稀釋至1L，過濾，濾液置于棕色試劑瓶中保存。使用時(shí)用標(biāo)準(zhǔn) NaOH 滴定，酚酞作指示劑，然后適當(dāng)稀釋，約加水 1 倍，使最終的酸濃度為 1mol/L 左右。 3.1.3 標(biāo)準(zhǔn)蛋白

15、質(zhì)溶液（250 g/mL） ：精確稱取結(jié)晶牛血清清蛋白，溶于蒸餾水再定容。 3.2 儀器儀器 可見光分光光度計(jì)、旋渦混合器、秒表、試管 3.3 分析步驟分析步驟 3.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的測定：取 7 支大試管，分別加入 0，0.1，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 毫升標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液（濃度為 250g/mL） 。用水補(bǔ)足到 1.0 毫升，然后每支試管加入 5 mL 試劑甲，在旋渦混合器上迅速混合，于室溫（2025）放置 10分鐘。再逐管加入 0.5 mL 試劑乙，同樣立即混勻。這一步混合速度要快，否則會(huì)使顯色程度減弱。然后在室溫下放置 10 分鐘，以未加蛋白質(zhì)溶液的第一支試管作為空白對(duì)照，

16、于 750nm 處測定各管中溶液的吸光度值。以蛋白質(zhì)濃度為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)，繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線。 福林酚法測牛血清蛋白含量標(biāo)準(zhǔn)曲線y = 0.0019xR2 = 0.988900.050.10.150.20.250.30.350.40.450.5050100150200250300濃度（ g/mL）A750nm 圖 2 福林酚法測定蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線 4 紫外吸收法紫外吸收法 4.1 分析步驟分析步驟 4.1.1 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線 取八只試管分別加入 0 ml、0.5 ml、1.0 ml、1.5 ml、2.0 ml、2.5 ml、3.0 ml、4mL 的 1mg/mL 牛血清蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液，加水至

17、4 mL，在 280nm 條件下測定其吸光值 紫外法y = 1.1611x - 0.1694R2 = 0.9787-0.200.20.40.60.811.200.20.40.60.811.2蛋白濃度（mg）吸光值 圖 3 紫外法測定蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線 5 考馬斯亮藍(lán)法考馬斯亮藍(lán)法 5.1 試劑試劑 5.1.1 1mg/mL 牛血清蛋白標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液： 精密稱取 0.1g 牛血清蛋白標(biāo)準(zhǔn)品用蒸餾水定容于 100mL 容量瓶。 5.1.2 100g/mL 牛血清蛋白標(biāo)準(zhǔn)工作液液：取 10mL 牛血清蛋白標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液加水定容至 100mL 5.1.3 考馬斯亮藍(lán)試劑：取 0.1g 考馬斯亮藍(lán) G-250 溶于 50mL 95%乙醇，加入100mL質(zhì)量濃度為0.85 g/mL的磷酸， 作為母液保存， 使用時(shí)用水稀釋到1000mL。 5.2 儀器和設(shè)備儀器和設(shè)備 試管、移液管、移液槍、可見分光光度計(jì) 5.3 分析步驟分析步驟 5.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 取六只試管分別加入 0 mL、0.1 mL、0